柴林山，李劍梅，孫翠煥，謝存一，張疏雨，朱萬芹,白玉紅

(1.遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000；2.營口市食品藥品檢驗檢測中心，遼寧 營口 115000)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又稱北蟲草，屬子囊菌門(Ascomycota)蟲草菌科(Cordycipitaceae)蟲草屬(Cordyceps)真菌[1]，富含多種天然藥理活性成分并具有多種藥理作用[2-3]。蟲草酸是蟲草類真菌的主要有效成分，又名D-甘露醇，化學分子式C7H12O6，為1,3,4,5-四羥基環(huán)己酸，具有利尿、抗氧化、預防和治療腦血栓、腦出血、心肌梗死等功效，蟲草酸含量是蟲草產(chǎn)品質(zhì)量評價的指標之一[4]。目前，蟲草酸的測定方法有滴定法、旋光法、高效液相色譜法、氣相色譜法、分光光度法等[5-8]。分光光度法是測定蟲草酸的常用方法之一[9-11]，但分光光度法受到比色槽數(shù)量限制，單次測定數(shù)量少，且操作繁瑣，試劑用量大。酶標儀與分光光度計在測定原理上是相同的，即物質(zhì)在一定波長的吸光度與濃度呈線性關系，且酶標儀可測定樣品數(shù)量多，一般96個，測定速度快，操作簡單，試劑用量少[12-13]。本研究以酶標儀為檢測儀器，建立酶標儀微量法，即在96孔板內(nèi)按照設定反應條件微量加入樣品和試劑進行顯色反應，最后利用酶標儀測定蟲草酸含量，以期提高蟲草酸的檢測效率，實現(xiàn)樣本的高通量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)子實體CM1～CM7為遼寧省微生物科學研究院藥用蕈菌實驗室栽培獲得。

1.1.2 主要試劑與儀器設備 高碘酸鈉、乙酸胺、冰醋酸、L-鼠李糖(分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司)。分析天平(PR224ZH/E OHAUS)；酶標儀(Multiskan GO 1510，Thermo Fisher)；紫外可見分光光度計(UV6000，METASH)；96孔微孔板(Corning 3635，美國康寧)；恒溫水浴鍋(HH-4，常州市江南實驗儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 蛹蟲草子實體蟲草酸提取液制備 參考鄧黎等[11]的方法：蛹蟲草子實體于烘箱內(nèi)55 ℃干燥，粉碎，過80目篩，料液比1∶30(g/mL，W/V)，于90 ℃熱水浸提60 min，離心取上清液，沉淀用蒸餾水洗滌兩次，離心，合并上清液，定容至50 mL，得到蟲草酸待測樣品液。

1.2.2 酶標儀測定蟲草酸最佳體積的確定 參考蔣永紅等[12]的方法(以下稱為標準法)，分別吸取1 mL質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50 mg/L 的甘露醇標準液1 mL至10 mL具塞比色管中，加1 mL 0.05 mol/L高碘酸鈉溶液，混勻，室溫反應10 min；再加2 mL 0.1%的L-鼠李糖溶液，震蕩混勻后加4 mL新配制的Nash試劑53 ℃ 水浴15 min，快速冷卻至室溫。分別取50、100、150、200、250 μL待測標準液于96孔板中，以相應體積的蒸餾水為空白對照，置于全波長酶標儀中412 nm波長處測定吸光度(OD)，以質(zhì)量濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制甘露醇不同體積系列標準曲線，并以已知濃度的標準液驗證曲線精確度。

1.2.3 酶標儀微量反應體系的確定 按1.2.2標準法，用移液槍向96孔板中分別加入25 μL各濃度標準液，再加入25 μL高碘酸鈉溶液，混勻，室溫反應10 min，再加50 μL 0.1% 的L-鼠李糖溶液，震蕩混勻后加100 μL新配制的Nash試劑，構(gòu)建200 μL總體積的反應體系，用防水自封袋密封后53 ℃水浴15 min使其呈色，反應結(jié)束后4 ℃冰箱預冷2 min，取防水自封袋，全波長酶標儀412 nm波長處測定OD，以質(zhì)量濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制微量反應體系下的標準曲線，并對標準法和微量法曲線方程進行比較。

1.2.4 酶標儀微量法水浴時間的確定 將微量反應法中水浴顯色時間設定為5、10、12、15、18、20 min，水浴結(jié)束后，4 ℃冰箱預冷2 min，全波長酶標儀測定吸光度，比較不同水浴時間對OD值的影響。

1.2.5 酶標儀微量法的方法學考察 ①精密度試驗：取樣品CM1和CM2的待測液，每個樣品重復測6次，酶標儀微量法測定OD值；②重復性試驗：分別取濃度為40 mg/L標準液(B40)和CM2的蟲草酸樣品液各6份，酶標儀微量法測定OD值；③加標回收率試驗：設置 6 個實驗組，每組加 0.5 mL CM1樣品溶液，然后分別加入0、10、20、30、40、50 mg/L蟲草酸標準溶液各 0.5 mL，充分混勻后，酶標儀微量法測定OD值，計算回收率。

1.2.6 酶標儀微量法測定蛹蟲草子實體中蟲草酸含量 取蟲草酸待測液用蒸餾水稀釋10倍，酶標儀微量法測定蟲草酸含量，每個樣品3個重復，同時以1.2.2制備的待測液采用分光光度計繪制分光光度法標準曲線，并對蟲草酸待測液進行蟲草酸含量測定，根據(jù)相應標準曲線，計算蟲草酸含量，并對酶標儀微量法和分光光度法進行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶標儀測定蟲草酸最佳體積的確定

在標準法反應條件下，繪制不同體積甘露醇標準液系列濃度標準曲線(圖1)，不同體積標準樣品的標準曲線相關系數(shù)R2值均達到0.986 1以上，且隨著待測標準樣品體積的增加，同一濃度的樣品光密度逐漸增大，標準曲線的斜率也逐漸增大。采用已知質(zhì)量濃度為40 mg/L的蟲草酸標準樣品按照1.2.2標準法制備待測液，3次重復。將反應待測液用移液槍分別吸取50、100、150、200、250 μL置于96孔板，在412 nm處采用酶標儀測定OD值，將OD值分別代入相應體積的標準曲線方程，計算蟲草酸標準液濃度，結(jié)果見表1，對于蟲草酸標準樣品反應液，當體積為50 μL時，標準差和相對誤差均較大，測定結(jié)果不準確；當標準樣品反應液體積為100～150 μL時，與已知標準樣品值相對誤差較大，測定結(jié)果相對準確；當標準樣品反應液體積達到200 μL及以上時，相對誤差在1.44%以內(nèi)，測定結(jié)果準確。結(jié)合檢測靈敏度、準確度及操作便捷性，采用測定體積為200 μL為宜。

表1 酶標儀比色法不同體積標準樣品顯色影響Table 1 The effect of the colorimetric method of the microplate reader on the color development of standard samples of different volumes

圖1 蟲草酸系列體積下的標準曲線方程Fig.1 Standard curve equation under the volume of cordycepic acid series

2.2 酶標儀微量法反應體系的確定

在酶標儀測定標準法基礎上，按照標準法操作，在96孔板上以總體積200 μL 檢測體積為基準，按照1.2.3方法進行酶標儀微量法甘露醇標準曲線的繪制，同時比較標準法相同體積下不同濃度標準樣品的OD值及標準曲線方程。圖2結(jié)果顯示，微量法與標準法在酶標儀下，200 μL 體積下測定的OD值相當，標準曲線方程分別為微量法y=0.008 8x+0.046 2(R2=0.998 7)和標準法y=0.008 6x+0.044(R2= 0.996 6)。兩種方法曲線斜率K值基本一致，R2值在0.996 6以上，均具有良好的線性關系，酶標儀微量法測定蟲草酸具可行性。

圖2 200 μL體積下標準法與微量法的標準曲線方程Fig.2 Standard curve equations of standard method and micro method in 200 μL

2.3 水浴反應時間對測試結(jié)果的影響

在酶標儀微量反應過程中，考察水浴時間對OD值的影響，40 mg/L標準樣品不同水浴時間OD值結(jié)果顯示在5～20 min內(nèi)吸光度值呈先升高后下降趨勢，水浴15 min時最高，直至18 min內(nèi)趨于平穩(wěn)，20 min時顯著降低。對照已知標準樣品質(zhì)量濃度(40 mg/L)與15 min時實際測定樣品質(zhì)量濃度(40.57 mg/L)，因此最佳水浴時間設定為15 min(圖3)。

圖3 不同水浴時間對OD值的影響Fig.3 The influence of different water bath time on the absorbance OD value

2.4 方法學考察結(jié)果

2.4.1 精密度試驗 采用酶標儀微量法測定樣品CM1和CM2的蟲草酸含量，每個樣品6次重復，測得的OD值代入曲線方程，計算蟲草酸含量，從表2中可看出，每個樣品6次測定結(jié)果相近，相對標準偏差(RSD)值分別為0.829%和1.772%，說明酶標儀微量法測定結(jié)果精密度良好。

表2 精密度試驗(n=6)Table 2 Precision test (n=6)

2.4.2 重復性試驗 采用酶標儀微量法測定40 mg/L標準樣品(B40)和樣品CM2中蟲草酸含量，每個樣品6次重復，測定的OD值，帶入曲線方程，計算蟲草酸含量，表3顯示標準液B40(40 mg/L)和樣品CM2的測定結(jié)果，RSD值分別為2.061%和1.599%，表明酶標儀微量法測定結(jié)果具有較好的重復性。

表3 重復性試驗(n=6)Table 3 Repeatability test (n=6)

2.4.3 加標回收試驗 在CM1樣品中加入不同濃度標準溶液，微量酶標儀法測定6組樣品OD值，計算各組的蟲草酸含量，進一步計算各組的回收率，結(jié)果見表4。6組樣品加標回收率實驗的平均值為99.24%，RSD值為3.666%，表明酶標儀微量法有較高的回收率，且檢測準確度較高。

表4 回收率試驗(n=6)Table 4 Recovery rate test (n=6)

2.5 酶標儀微量法與分光光度法測定蛹蟲草子實體中蟲草酸含量的比較

分別采用酶標儀微量法和標準法制備CM1～CM7共7個樣品的蟲草酸待測液，每個樣品3次重復，利用酶標儀和分光光度計對待測樣品OD值進行測定，代入相應標準曲線方程，計算蟲草酸含量(圖4)。結(jié)果顯示，利用分光光度法和酶標儀微量法測得的相同樣品蟲草酸含量無顯著差異(P>0.05)。采用Origin 8.6軟件分別對酶標儀微量法和分光光度法測定的7個蛹蟲草子實體樣品蟲草酸含量結(jié)果進行擬合分析，驗證兩種方法的相關性，相關性分析結(jié)果見圖5。在統(tǒng)計學上根據(jù)相關關系的強弱，將R=7.0看成是一個中等到較高的相關[13]，本研究中酶標儀微量法和分光光度法測定結(jié)果相關性分析的R=0.993 15，說明兩種方法具有較高的正相關性，驗證了酶標儀微量法測定蟲草酸的準確性。

圖4 分光光度法和酶標儀微量法測定蟲草酸含量的比較Fig.4 Comparison of cordycepic acid content by spectrophotometry and micro method

圖5 酶標儀微量法與分光光度法測定蟲草酸含量相關性分析Fig.5 Correlation analysis of the content of cordycepic acid by micro-reaction method with microplate reader and spectrophotometer method

3 討 論

蟲草酸作為蛹蟲草子實體中主要的藥理活性物質(zhì)之一，其含量的多少是評價蛹蟲草制品質(zhì)量的一個重要指標[14-16]，目前蟲草酸含量的測定主要采用高效液相色譜法和分光光度法，雖然高效液相色譜法在測量準確性和精確度上具有一定優(yōu)勢，但其對儀器設備、試劑純度及檢測人員技術(shù)水平要求較高。而分光光度法因其試劑成本低、操作簡單、檢測準確度較高被廣泛接受[17-18]。酶標儀與分光光度計在測定原理上是相同的，即物質(zhì)在一定波長的OD與濃度呈線性關系，不同在于分光光度計光路為水平，光程固定，加樣量不一致對測量結(jié)果沒有影響，但測定時需樣品量大、速度慢、效率低[14]。酶標儀具有96個比色槽，最多可同時對96個樣品進行多波段掃描和測定，速度快、效率高，96孔板在酶標儀上1 min之內(nèi)就可獲得OD數(shù)據(jù)結(jié)果，測定上百個樣品只需幾分鐘時間便可完成[19-21]，因此相較分光光度計，酶標儀測定相關樣品時具有較大優(yōu)勢，已廣泛應用于樣品檢測[22]。因酶標儀光路為垂直，加樣量多少直接影響OD值，檢測體積的大小直接影響檢測的準確性，一般體積太小會造成較大的檢測誤差[23]，本研究對酶標儀檢測蟲草酸含量的檢測體積進行了分析，確定了當標準樣品反應液體積達到200 μL及以上時，相對誤差在1.44%以內(nèi)，測定結(jié)果準確，以檢測體積為200 μL為最優(yōu)。在此基礎上探討了以96孔板為反應載體的微量樣品和試劑添加的反應方法，在200 μL反應體系下，酶標儀微量法與標準方法的OD值和曲線斜率無差異，建立的標準曲線具有高度一致性，驗證了酶標儀微量法具較高準確度。為分析酶標儀微量法中水溶時間對OD值的影響，本研究對酶標儀微量法中不同水浴時間影響進行了分析，結(jié)果顯示水浴時間與OD值具相關性，呈先升高再降低的趨勢，水浴時間在15 min時，OD值最大，結(jié)果可知反應體系的體積大小對整個反應體系無明顯影響，確定水浴最佳時間為15 min。本研究對酶標儀微量法的精密度、重復性和加標回收率等進行了方法學考察，精密度試驗中樣品CM1的RSD值0.829%，樣品CM2的RSD值1.772%顯示較高的精密度；重復性實驗中40 mg/L的標準樣品的RSD值2.061%，樣品CM2 的RSD值1.599%，重復性良好、樣品平均回收率99.24%，回收率評價RSD值3.666%，回收率較高，本方法檢測準確性高。為驗證該方法測定蟲草酸的準確性，將其測定結(jié)果與分光光度法進行了比較及兩種方法的相關性分析，結(jié)果顯示兩種方法測定結(jié)果無顯著差異(P>0.05)，同時兩種方法具有較強的相關性(R=0.993 15)。

本研究利用酶標儀為檢測儀器，在驗證酶標儀檢測蟲草酸含量準確度的基礎上，建立酶標儀微量法測定蟲草酸含量的方法，即以96孔板為反應載體，通過微量樣品和試劑在96孔板內(nèi)實現(xiàn)顯色反應進而測定蛹蟲草子實體中蟲草酸含量的方法。具體反應條件：移液槍取樣品溶液25 μL于96孔板內(nèi)，加入25 μL高碘酸鈉溶液，混勻，室溫反應10 min，加入50 μL L-鼠李糖溶液，加100 μL新配制的Nash試劑，96孔板封膜防水后，于53 ℃ 水浴15 min，迅速放入4 ℃冰箱預冷2 min，去掉防水膜后，于全波長酶標儀中測定OD值，并根據(jù)相關標準曲線計算所測蟲草酸含量。此方法具有較高的精密度、重復性、回收率，表明酶標儀微量法可以替代分光光度法，用于蟲草酸含量的測定，此法可大大減少樣品試劑的用量，且反應和檢測在96孔板內(nèi)完成，方便、快捷、高效。