馬子豪，向 軍，張福梅，周麗艷，廖慶艷，宋汶哲，盧麗媛，紀(jì)曉嵐，周雪雁，3*

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124；2.西北民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030)

根據(jù)國(guó)際糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，在2019、2020、2021年我國(guó)受疫情影響下肉類生產(chǎn)總量分別達(dá)到了7.759×107、7.748×107、8.887×107t。按家畜血液占其肉重的6%,蛋白質(zhì)含量占血液的18%計(jì)算，可獲得的蛋白質(zhì)分別達(dá)8.38×105、8.37×105、9.60×105t。由于原料血液易被污染、極難保存、血腥味濃、消化性和適口性差、色澤感官極差、禁止作為飼料原料等因素嚴(yán)重制約了畜禽血液的綜合利用，致使大量寶貴的畜禽血資源浪費(fèi)，并造成環(huán)境污染[1]。屠宰場(chǎng)產(chǎn)生的血污是屠宰場(chǎng)污水最重要的組成部分，在眾多污染物中，血液污染的污染指數(shù)最大，因此衍生出了多種處理方法[2]。國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)的處理方法有化學(xué)水解法、焚燒法、微生物水解等方法。焚燒法不僅加劇了環(huán)境污染，也造成了營(yíng)養(yǎng)資源的浪費(fèi)；化學(xué)水解方法受工藝復(fù)雜、投資成本高、營(yíng)養(yǎng)成分易被破壞等諸多因素的限制。而微生物法在微生物的發(fā)酵過(guò)程中,將可再生碳水化合物轉(zhuǎn)化為各種有用產(chǎn)品,如氨基酸、維生素、抗生素、酶制劑、生物殺蟲(chóng)劑、生物堿、類固醇等物質(zhì)，適合生產(chǎn)氨基酸肥料[3]。微生物處理后的氨基酸水解液可經(jīng)過(guò)濃縮干燥處理直接制備成固體氨基酸粉末，該粉末可直接以液體形式噴施于作物，也可以營(yíng)養(yǎng)劑的形式加入肥料中制備成氨基酸生態(tài)肥、氨基酸復(fù)合肥、氨基酸水溶肥、氨基酸葉面肥等氨基酸肥料[4]。故畜禽血液進(jìn)行微生物降解能解決血液污染問(wèn)題，其處理產(chǎn)物又可用于氨基酸肥料的制備，且因其投入低、能耗省、氨基酸含量高而被公認(rèn)為血液綜合利用的一個(gè)方向[5]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)能夠降解血液蛋白的菌株主要有黑曲霉、米曲霉、毛霉等真菌以及蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌等細(xì)菌[6-7]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于乙酰微小桿菌的研究不多，研究方向大致可分為菌株的分離鑒定、降解作用、生物合成物質(zhì)三個(gè)方面的研究。且其降解研究大多與蝦殼廢物的降解有關(guān)[8-9]。本研究于日喀則地區(qū)屠宰場(chǎng)血污堆積土壤采集樣品，分離篩選并首次研究了一株能高效降解牛血的乙酰微小桿菌(Exiguobacteriumacetylicum)，并為探究菌株血液降解效率提供了簡(jiǎn)單可參考的方法；同時(shí)為乙酰微小桿菌功能理論研究以及用微生物法轉(zhuǎn)化血污為有機(jī)氨基酸肥料，保護(hù)生態(tài)環(huán)境做出可行性探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 土壤樣品采自西藏日喀則市江孜縣英雄路6號(hào)屠宰場(chǎng)(E89°60′92.18″，N28°91′74.00″)，海拔4 000 m左右。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB(液體)培養(yǎng)基(g/L)：胰化蛋白胨10，酵母提取粉5，NaCl 10;②LB固體培養(yǎng)基(g/L)：胰化蛋白胨10，酵母提取粉5，NaCl 10，瓊脂粉20；③酪蛋白培養(yǎng)基a(g/L)：KH2PO40.36，MgSO40.5，ZnCl20.014，NaCl 0.6，Na2HPO4·7H2O 1.07，CaCl20.002，F(xiàn)eSO40.002，酪蛋白4，胰蛋白胨0.05，瓊脂15，pH值7.0；④酪蛋白培養(yǎng)基b(g/L)：酪素10，牛肉浸粉3，NaCl 5，K2HPO42，瓊脂20，pH值7.0；⑤血瓊脂平板：哥倫比亞血平板；⑥液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏0.5，蛋白胨10，葡萄糖15，酵母提取物5，Na2HPO44，NaCl 5，發(fā)酵專用豆粕粉2，發(fā)酵專用玉米淀粉4；⑦探究菌株生長(zhǎng)條件所用培養(yǎng)基；⑧探究菌株血液降解所用培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 革蘭染色試劑盒(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)，細(xì)菌DNA提取試劑盒(TaKaRa-美谷生物科技(浙江有限公司))，細(xì)菌生化試劑盒(杭州微生物試劑有限公司)，蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、福林酚試劑(博精索拉博科技有限公司)，NaCl、CaCl2(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，酵母提取物、胰蛋白胨(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)，干酪素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，NaOH(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑大都購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，罐裝牦牛血采集于西藏日喀則市江孜縣英雄路6號(hào)屠宰場(chǎng)。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(1800PC，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；pH計(jì)(SG2-FK，梅特勒-托利多)；PCR擴(kuò)增儀(846-X-070-280，德國(guó)Biometra)；蒸汽滅菌器(MOST-T，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；電子天平(AR224CN，奧豪斯儀器常州有限公司)；立式恒溫振蕩器(IS-ROV1，上海智城分析儀器制造有限公司)；BME顯微鏡(13395H2X，萊卡)；電泳儀(DYY-6D，北京六一儀器設(shè)備)；恒溫水浴鍋(DK-S24，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9270，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株純化及保存 將采集的樣品用無(wú)菌水10倍遞增稀釋103～105，移液槍取50 μL稀釋液涂布于血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑選有溶血環(huán)的菌落劃線接種在血平板上，以相同條件培養(yǎng)純化。純化好的菌落劃線接種于LB培養(yǎng)基，以相同條件培養(yǎng)。取80 μL菌液和80 μL 50%甘油于凍存管混合均勻，在-80 ℃微生物菌種保藏冰箱中長(zhǎng)久保存。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 分離得到的菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基、血平板、酪蛋白培養(yǎng)基a、酪蛋白培養(yǎng)基b，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形狀、大小、顏色、邊緣、透明等形態(tài)特征。將菌落劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，分別在37 ℃、12 h和37 ℃、24 h的條件下培養(yǎng)，輕挑少量菌落革蘭染色后鏡檢，光學(xué)顯微鏡下觀察菌體細(xì)胞的形狀、大小及染色結(jié)果。

1.2.3 生理生化鑒定 取菌種凍存液200 μL于LB培養(yǎng)基中，180 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)菌液2 mL于LB培養(yǎng)基中，以相同條件培養(yǎng)。將二代培養(yǎng)菌液50 μL接種于葡萄糖、麥芽糖、肌醇、枸櫞酸、尿素、硝酸鹽、鳥(niǎo)氨酸、苯丙氨酸等生化試管中按照生化試管所需條件進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 取二代菌液200 μL于LB固體培養(yǎng)基中均勻涂布，在培養(yǎng)基上放置等間隔的不同抗生素藥片，37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 16S rRNA基因序列鑒定 取二代菌液(第二代培養(yǎng)時(shí)間為12 h)2 mL于無(wú)菌離心管中，DNA提取試劑盒提取目標(biāo)菌株DNA。使用引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由生物工程(上海)股份有限公司完成，測(cè)序結(jié)果在NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，與GenBank中已知的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，并使用MEGA 7.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[10]。

1.2.6 菌株生長(zhǎng)條件研究 以二代培養(yǎng)液作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的種子液，實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基均為100 mL，后續(xù)培養(yǎng)基接種2 mL菌液，以180 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h為常規(guī)培養(yǎng)條件，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行并設(shè)對(duì)照，測(cè)定OD值時(shí)稀釋菌液直至吸光度在0.2～0.8之間。①不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：將六種碳源(葡萄糖、麥芽糖、小麥、蔗糖、玉米淀粉、乳糖)以10 g/L替換LB培養(yǎng)基中的酵母提取物，常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)后測(cè)定OD600。②不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：將六種氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、黃豆餅粉、胰蛋白胨、麥麩)以10 g/L替換LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨，常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)后測(cè)定OD600。③不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：將七種無(wú)機(jī)鹽(NaCl、ZnCl2、KCl、Na2HPO4、MgSO4、K2HPO4、MgCl2) 以10 g/L替換LB培養(yǎng)基中的NaCl，常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)后測(cè)定OD600。④pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：配置不同pH梯度的LB培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)后測(cè)定OD600。對(duì)最適pH、高pH、低pH條件下菌液進(jìn)行革蘭染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察。⑤不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：用含有最適碳源和氮源的LB培養(yǎng)基在不同溫度梯度于常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，測(cè)定OD600。對(duì)最適溫度、高溫、低溫條件下菌液進(jìn)行革蘭染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.7 蛋白酶活力的測(cè)定 將二代菌液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，27 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。之后4 ℃、10 000 r/min離心20 min收集上清液，作為蛋白酶測(cè)定的粗酶液[6]。采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活性(GB/T23527-2009)[11]。

1.2.8 菌株血液降解條件的探究 ①最適碳源的篩選：NaCl(5 g/L)為無(wú)機(jī)鹽，10 mL攪拌機(jī)低速攪拌1 min的牦牛血為氮源，蔗糖、葡萄糖、麥麩、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖為碳源，加入90 mL純水制備成100 mL培養(yǎng)基。接種二代菌液200 μL，32 ℃培養(yǎng)75 h后測(cè)定總氮和游離氮，計(jì)算降解效率。②最適無(wú)機(jī)鹽的篩選：以麥麩為碳源，10 mL攪拌機(jī)攪拌后的牦牛血為氮源，NaCl、KCl、MgCl2、Na2HPO4、NH4Cl、K2HPO4為無(wú)機(jī)鹽，分別加入90 mL純水制備成100 mL培養(yǎng)基，只含牦牛血的培養(yǎng)基作為對(duì)照組。接種二代菌液2 mL，37 ℃培養(yǎng)85 h后測(cè)定總氮和游離氮，計(jì)算降解效率?？偟捎肎B5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[12]中凱式定氮法測(cè)定。氨基酸液態(tài)氮采用GB5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[12]中甲醛滴定法測(cè)定。測(cè)底物所含總氮，然后根據(jù)公式計(jì)算發(fā)酵液降解度。

式中，DH為發(fā)酵液降解度(%)，A為發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量(mg)，N為底物中所含總氮含量(mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)學(xué)鑒定

二代菌液接種于不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，肉眼可觀察到菌落的不同形態(tài)(表1)。

表1 分離菌株在不同培養(yǎng)基上形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of isolated strains on different media

菌株革蘭染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)兩端圓鈍的鏈桿菌，成對(duì)或鏈狀排列，菌體顏色為藍(lán)紫色，革蘭染色陽(yáng)性。培養(yǎng)12 h時(shí)，菌體多呈對(duì)或斷鏈排列(圖1A)，培養(yǎng)24 h時(shí)，菌體多呈長(zhǎng)鏈狀(圖1B)。

圖1 12 h(A)、24 h(B)培養(yǎng)菌革蘭染色結(jié)果Fig.1 Gram staining results of bacteria cultured for 12 h(A) and 24 h(B)

2.2 生理生化鑒定

對(duì)菌株進(jìn)行糖類發(fā)酵、硝酸鹽還原、氧化酶、枸櫞酸利用試驗(yàn)等生化特性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 分離菌株生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Biochemical reaction test of the isolate

2.3 藥敏試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，該分離菌株對(duì)磷霉素、頭孢西丁、阿米卡星、環(huán)丙沙星高度敏感，對(duì)頭孢他啶、萬(wàn)古霉素敏感性較低，菌株對(duì)頭孢噻吩、阿莫西林、氨芐西林等抗生素不敏感。

表3 菌株耐藥性檢驗(yàn)Table 3 Strain resistance test

2.4 16S rRNA基因序列鑒定

采用細(xì)菌通用引物對(duì)篩選的菌株全基因組DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，菌株擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 400 bp。將該菌株送樣拼接后得到的16S rRNA基因序列在NCBI上使用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示，該菌株與乙酰微小桿菌(Exiguobacteriumacetylicum) DSM 20416序列同源性高達(dá)99.72%，與Exiguobacteriumacetylicumstrain NBRC 12146序列同源性高達(dá)99.58%，與Exiguobacteriumindicumstrain HHS 31序列同源性高達(dá)99.51%，使用MEGA7.0將獲得的菌株和BLAST結(jié)果中15條核酸序列進(jìn)行多重比對(duì)并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。該菌株與乙酰微小桿菌(Exiguobacteriumacetylicum)的同源性高達(dá)99%以上，遺傳距離較近。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rRNA基因序列鑒定結(jié)果，鑒定該菌株為微小桿菌屬(Exiguobacterium)的乙酰微小桿菌。將測(cè)得的16S rRNA基因序列提交NCBI獲得GenBank登錄號(hào)MZ148480，命名為Exiguobacteriumacetylicumstrain NWMCC0047。

圖2 基于 16S rRNA基因序列建立的菌株NWMCC0047系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of NWMCC0047 strain based on 16S rRNA gene sequence

2.5 碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、pH值、溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

菌株NWMCC0047以葡萄糖作為碳源時(shí)OD600值高，而且明顯優(yōu)于其他碳源，表明葡萄糖是該菌株生長(zhǎng)的最佳碳源(圖3A)。生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果顯示菌株NWMCC0047乳糖和蔗糖試驗(yàn)呈陰性，麥芽糖和葡萄糖試驗(yàn)呈陽(yáng)性。各種碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響由大到小依次為葡萄糖、玉米淀粉、蔗糖、乳糖、小麥、麥芽糖(圖3A)，與生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果不一致，原因是由于菌株生長(zhǎng)需要多種營(yíng)養(yǎng)條件所致。菌株NWMCC0047以牛肉膏作為碳源時(shí)，OD600值高，明顯優(yōu)于其他氮源，表明牛肉膏是該菌株生長(zhǎng)的最佳氮源(圖3B)?？赡芎团Ｈ飧嘀泻卸嚯念?、氨基酸類、核苷酸類、有機(jī)酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)，為菌體生長(zhǎng)提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。菌株NWMCC0047以Na2HPO4作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，OD600值最高，優(yōu)于其他無(wú)機(jī)鹽，表明Na2HPO4是該菌株生長(zhǎng)的最佳無(wú)機(jī)鹽(圖3C)。磷酸鹽是許多細(xì)菌生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可作為基本營(yíng)養(yǎng)成分添加到多種培養(yǎng)基中，添加一定量的Na2HPO4對(duì)本菌株生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。菌株NWMCC0047OD600值在pH值<7.0時(shí)呈上升趨勢(shì)，在pH值>7.0時(shí)呈下降趨勢(shì)。菌株在pH值為7.0時(shí)，生長(zhǎng)情況好，因此，該菌株生長(zhǎng)的最適生長(zhǎng)pH值為7.0(圖3D)。革蘭染色結(jié)果表明，細(xì)菌在不同pH環(huán)境中有形態(tài)差異。pH值為5.5時(shí)，菌體大部分單個(gè)排列，部分菌體染色為淡紫色或粉紅色(圖4A)；pH值為7.0時(shí)，菌體形態(tài)為兩端圓鈍的鏈桿菌，成對(duì)或鏈狀排列，菌體形態(tài)大致相似，染色為藍(lán)紫色(圖4B)；pH值為8.5時(shí)，菌體單個(gè)或成對(duì)排列，菌體染色偏深藍(lán)，鏡下可見(jiàn)部分半透明的深藍(lán)色物彌散分布，可能為菌體代謝產(chǎn)物(圖4C)。

圖3 碳源(A)、氮源(B)、無(wú)機(jī)鹽(C)、pH值(D)對(duì)菌株NWMCC0047生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of carbon source(A),nitrogen source(B),inorganic salt(C) and pH(D) on the growth of strain NWMCC0047

圖4 pH值為5.5(A)、7.0(B)、8.5(C)時(shí)菌株NWMCC0047革蘭染色結(jié)果Fig.4 Gram staining results of cultured bacteria at pH 5.5(A),7.0(B) and 8.5(C)

菌株NWMCC0047OD600值在溫度低于20 ℃時(shí)呈上升趨勢(shì)，溫度高于20 ℃時(shí)呈下降趨勢(shì)，菌株在溫度為20 ℃生長(zhǎng)情況好，因此20 ℃是該菌株生長(zhǎng)的最適生長(zhǎng)溫度(圖5)。革蘭染色結(jié)果表明，細(xì)菌在不同溫度環(huán)境中有形態(tài)上的差異。溫度為37 ℃時(shí)，菌體為兩端圓鈍的鏈桿菌，成對(duì)或鏈狀排列，菌體形態(tài)大致相似，染色呈藍(lán)紫色(圖6A)；溫度為42 ℃時(shí)，菌體單個(gè)或成對(duì)排列，視野下可見(jiàn)菌體死亡后部分或全部萎縮的粉紅色菌體(圖6B)；溫度為27 ℃時(shí)，菌體單個(gè)或成對(duì)排列，長(zhǎng)短不一形態(tài)不同(圖6C)。

圖5 溫度對(duì)菌株 NWMCC0047 生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of temperature on the growth of strain NWMCC0047

圖6 37 ℃(A)、42 ℃(B)、27 ℃(C)時(shí)培養(yǎng)菌革蘭染色結(jié)果Fig.6 Gram staining results of cultured bacteria at 37 ℃(A),42 ℃(B) and 27 ℃(C)

通過(guò)對(duì)不同溫度和pH條件下菌株的革蘭染色發(fā)現(xiàn)，菌株在不同條件下形態(tài)以及染色上有較大差異。Lee等[13]研究了青霉素結(jié)合蛋白(PBP)1A的非均相定位動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)此蛋白可在多水平的調(diào)控作用下，通過(guò)改變酶活性的方式來(lái)控制肽聚糖的形成與延伸。而肽聚糖在提供機(jī)械支撐、保持細(xì)胞形態(tài)、抗?jié)B透抵抗方面有著重要作用[14]。革蘭染色所觀察到細(xì)菌個(gè)體的形態(tài)染色變化可能由于不同的溫度、pH培養(yǎng)條件影響了菌體肽聚糖的形成、延伸以及松緊度從而造成細(xì)胞壁的形態(tài)異常。肽聚糖的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，革蘭染色第一步中的結(jié)晶紫燃料無(wú)法與肽聚糖相對(duì)緊密結(jié)合[15]，染色完成后易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，菌體死亡則染色極淺。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH主要影響細(xì)菌的連接以及細(xì)胞壁的松緊程度，對(duì)少部分細(xì)菌的肽聚糖形成和延伸造成破壞。溫度則對(duì)于細(xì)菌連接以及肽聚糖的延伸和形成影響較大。溫度對(duì)于細(xì)菌存活的影響要比pH顯著，在后續(xù)降解實(shí)驗(yàn)中應(yīng)優(yōu)先探究溫度對(duì)菌株血液降解的影響。

2.6 蛋白酶活力測(cè)定

由酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)得到的K值為98.97。獲得菌株NWMCC0047粗酶液的蛋白酶活力為19.00 U/mL。

圖7 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of tyrosine

2.7 血液降解條件優(yōu)化

菌株NWMCC0047以麥麩作為碳源時(shí)生長(zhǎng)情況較好，血液降解率可達(dá)12.33%，優(yōu)于其他碳源，表明麥麩是該菌株生長(zhǎng)的最佳碳源(圖8)。麥麩是小麥制粉加工中的主要副產(chǎn)物，由種皮、糊粉層、少量胚芽及胚乳組成，含有可溶和不可溶性非淀粉多糖、水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，為菌株生長(zhǎng)提供了較為全面的營(yíng)養(yǎng)條件[16]。麥麩中的各種微量?jī)?nèi)源微生物也可能與菌株NWMCC0047產(chǎn)生協(xié)作共生作用，一定程度上提升了血液降解效率[17]。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察，添加麥麩組的菌液中血液由深紅色變?yōu)樯罹G色并伴有濃烈的氨臭味，瓶中血液濃稠。周濤等[18]的研究表明，細(xì)菌附著在載體上并達(dá)到一定的密度時(shí)，就開(kāi)始分泌胞外聚合物(EPS)并形成固著在載體表面的胞外聚合物基質(zhì)團(tuán)。在生物膜中，EPS能夠?yàn)榧?xì)菌提供一種天然的屏障，并在菌體代謝方面發(fā)揮著重要作用。推測(cè)麥麩的顆粒大小和溶解性質(zhì)使其在培養(yǎng)細(xì)菌中充當(dāng)了微載體的作用，有利于細(xì)菌附著與胞外聚合物的形成，進(jìn)一步促進(jìn)了菌株的生長(zhǎng)和代謝，從而提升了血液降解效率。

圖8 碳源對(duì)菌株降解效率的影響Fig.8 Effect of carbon source on degradation efficiency of strains

菌株NWMCC0047經(jīng)過(guò)降解條件的初步優(yōu)化后，血液降解率可達(dá)21.97%，比未優(yōu)化前(5.92%)提升約3.7倍。雖然不添加無(wú)機(jī)鹽組降解效率略低于Na2HPO4組，但從后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益考慮，不添加無(wú)機(jī)鹽的綜合效果最優(yōu)(圖9)。菌株生物膜的生長(zhǎng)是一個(gè)動(dòng)力學(xué)過(guò)程并且受外界環(huán)境的影響，主要包括膜內(nèi)外滲透壓的作用、基質(zhì)擴(kuò)散的條件限制、液相主體之間的剪切作用、膜內(nèi)外溫度以及pH值的影響等，而滲透壓是引起水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在生物體中運(yùn)動(dòng)和運(yùn)輸?shù)闹匾苿?dòng)力，因此研究滲透壓對(duì)細(xì)菌生物膜生長(zhǎng)的影響具有重要意義[18]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，菌體生長(zhǎng)所需滲透壓與10%(體積分?jǐn)?shù))牦牛血培養(yǎng)基相近，加入5 g/L NaCl時(shí)，帶入周濤研究所得公式[18]，培養(yǎng)基中滲透壓將大幅度提升，很可能超出了菌體的適宜生長(zhǎng)條件。

圖9 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株降解效率的影響Fig.9 Effect of inorganic salt on degradation efficiency of strains

3 討 論

近年來(lái)，以動(dòng)物的血污、毛發(fā)及蹄腳等作為原料，采用微生物降解工藝生產(chǎn)氨基酸液體肥料具有廣闊的應(yīng)用前景[19]，而其上游環(huán)節(jié)備用菌株的篩選是至關(guān)重要的一步。本研究完成了對(duì)一株具有降解血液能力的菌株的分離鑒定及其降解血液條件的初步探索，獲得一株具有高效降解潛力的乙酰微小桿菌，為初步篩選備用菌株提供了簡(jiǎn)單可參考的實(shí)驗(yàn)方法。菌株NWMCC0047的初始血液降解率為5.92%，初步優(yōu)化后，血液降解效率為21.97%，比未優(yōu)化前有顯著提升。實(shí)驗(yàn)中LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基得到的最適生長(zhǎng)條件對(duì)血液培養(yǎng)基成分的探究有參考意義，可作為血液降解最適條件的備選條件。且根據(jù)實(shí)驗(yàn)中溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)情況的研究，推測(cè)溫度可能主要影響菌體細(xì)胞壁合成酶以及細(xì)胞壁上受體等功能蛋白質(zhì)的活性和滲透壓大小從而影響菌體生長(zhǎng)，且其影響大于pH，故在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)先開(kāi)展菌株最適溫度條件的探究。而在血液降解實(shí)驗(yàn)中由于麥麩的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的統(tǒng)一以及無(wú)機(jī)鹽對(duì)與菌體生長(zhǎng)環(huán)境滲透壓的影響，獲得的最適碳源和無(wú)機(jī)鹽的血液降解條件對(duì)于用微生物法血液降解研究有重要參考意義。

Yao等[20]從屠宰場(chǎng)取樣分離出一種可降解血紅蛋白的短小芽胞桿菌，優(yōu)化后的蛋白酶活力為35.437 U/mL，當(dāng)血粉添加量為2.1%時(shí)，可在36 h內(nèi)降解85%的血紅蛋白。張濱[5]從長(zhǎng)沙市五里牌畜禽定點(diǎn)屠宰廠附近的土壤中分離出一株可有效降解血紅蛋白的蠟樣芽胞桿菌亞種，酶活力可達(dá)483.81 U/mL，當(dāng)血紅蛋白添加量為1.05%時(shí)，血紅蛋白降解率為40.25%。菌株NWMCC0047比上述功能菌株蛋白酶活力偏低的原因很可能是由于發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇不當(dāng)從而限制了其繁殖和蛋白酶的產(chǎn)生；也可能因蛋白酶未及時(shí)釋放到胞外或培養(yǎng)基中所致，有待通過(guò)細(xì)胞破碎、優(yōu)化培養(yǎng)基組分，對(duì)候選菌株進(jìn)行基因改造及誘變育種，從而提高菌株繁殖能力和產(chǎn)酶能力[6]。菌株NWMCC0047的血液降解效率一方面可以通過(guò)對(duì)金屬離子、培養(yǎng)溫度、添加血液濃度、菌種添加量的探究來(lái)提升；另一方面可以通過(guò)紫外誘變篩選菌株、多種菌株混合、菌株和產(chǎn)蛋白酶或溶血素混合等方式進(jìn)一步提升菌株降解血液的能力。

氨基酸肥料作為一種新型的生態(tài)肥料，其使用范圍也將會(huì)越來(lái)越廣[21]。劉娜等[22]已經(jīng)完成了以廢棄革屑為原料制備含氨基酸水溶肥料的工藝，并取得了較好的結(jié)果,但因其在制備過(guò)程中使用國(guó)家現(xiàn)已違禁添加的強(qiáng)酸而被禁止。而微生物法生產(chǎn)氨基酸水溶肥料的前景愈發(fā)廣闊，氨基酸水解液可經(jīng)過(guò)濃縮干燥處理制備成固體氨基酸粉末，直接加入肥料中制成氨基酸水溶肥[3]。李廷勛等[23]發(fā)明了一種利用地衣芽孢桿菌和大豆來(lái)源的蛋白酶降解家畜血液制成的一種液體氨基酸肥料。許麗娟等[25]利用動(dòng)物蛋白廢棄物水解而成的復(fù)合氨基酸以及微量元素錳、鋅等為原料,制備復(fù)合氨基酸微量元素螯合肥。目前國(guó)內(nèi)外在利用微生物法制備氨基酸肥料的工藝研究總體不夠深入，相比之下我國(guó)的研究相對(duì)較多，可行性較高。但是由于工藝的復(fù)雜性和成本問(wèn)題等諸多原因，尚未探究出一條完整且經(jīng)濟(jì)的工業(yè)化生產(chǎn)道路，采用微生物降解工藝生產(chǎn)氨基酸液體肥亟須進(jìn)一步研究。