郭玲玲，江志陽(yáng)，陶姝宇，于 淼，朱曉琳，陳麗媛

(1.遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽(yáng) 122000；2.中國(guó)科學(xué)院 沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,遼寧 沈陽(yáng) 110032；4.遼寧恒潤(rùn)農(nóng)業(yè)有限公司，遼寧 鞍山 114000)

木質(zhì)素是一種天然有機(jī)高分子聚合物，廣泛存在于高等植物細(xì)胞壁中，具有溶解性差、難以被酸水解等特點(diǎn)，主要因其分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)較為復(fù)雜，含多種穩(wěn)定的復(fù)雜鍵型，卻不含易水解而重復(fù)的單元[1]。同時(shí)，木質(zhì)素在細(xì)胞壁中對(duì)纖維素等起到保護(hù)作用，木質(zhì)素的降解和半纖維素、纖維素的降解有著密切關(guān)聯(lián)[2-3]。菌糠和秸稈中的木質(zhì)纖維素含量高卻降解困難，成為此類(lèi)農(nóng)業(yè)廢棄物有效開(kāi)發(fā)利用的主要限制因素。因此，關(guān)于降解木質(zhì)素的微生物相關(guān)研究逐漸成為關(guān)注熱點(diǎn)。目前木質(zhì)素降解菌的研究多集中于中低溫菌，但在菌糠和秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物高溫堆肥等特殊環(huán)境中此類(lèi)菌株容易失活，其木質(zhì)素降解效果隨之受到很大影響[4]。因此，篩選高溫耐受性高效木質(zhì)素降解菌具有重要意義。自然界中木質(zhì)素的降解主要依靠微生物完成，其中真菌研究最多，主要有原孢厚毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBurdsall)、白腐真菌、褐腐真菌、毛革蓋菌(Stereumhirsutum(willd.:Fr.S.F.Gray))、東方栓菌(Trametesorientalis(Yasuda)lmaz.)等[5-10]。但大多木質(zhì)素降解真菌的研究?jī)H停留在試驗(yàn)階段，能夠應(yīng)用于生產(chǎn)的菌株實(shí)際效果都不夠理想。與真菌相比，細(xì)菌生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、來(lái)源廣泛、資源利用效率高，將細(xì)菌應(yīng)用于木質(zhì)素降解領(lǐng)域的研究值得深入探討。本研究從育苗基質(zhì)中篩選到了一株耐高溫木質(zhì)素降解菌，結(jié)合菌株形態(tài)、生理生化及分子測(cè)定結(jié)果，篩選菌株HZ11為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并對(duì)其進(jìn)行了秸稈木質(zhì)素和菌糠木質(zhì)素降解效果的研究，降解率分別達(dá)到46.7%和 42.4%。本研究對(duì)于補(bǔ)充木質(zhì)素降解菌種資源庫(kù)、豐富解淀粉芽胞桿菌特性研究數(shù)據(jù)以及農(nóng)業(yè)廢棄物資源化有效利用具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 菌種篩選用樣品粉采自遼寧土木啟生物科技有限公司，在菌糠、秸稈、牛糞等堆腐生產(chǎn)育苗基質(zhì)堆高溫階段采集樣品粉，放入滅菌袋中帶回實(shí)驗(yàn)室；玉米秸稈采自遼寧省凌源市三道河子金茂農(nóng)業(yè)有限公司種植基地，用清水洗凈玉米秸稈，65 ℃烘干后粉碎過(guò) 40 目篩，得秸稈粉，121 ℃滅菌 30 min后，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 ①富集培養(yǎng)基：MgSO40.2 g，Na2HPO41.5 g，(NH4)2SO42.0 g，CaCl22.0 g，KH2PO41.5 g，玉米秸稈粉10.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。②初篩固體培養(yǎng)基：堿性木素2.0 g，MgSO40.5 g，Na2HPO40.2 g，KH2PO41.0 g，NH4NO31.33 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L。③NA培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2～7.4。④LB液體培養(yǎng)基:酵母浸膏5.0 g，牛肉浸膏 5.0 g，魚(yú)粉蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0～7.2。⑤LB 固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基加入瓊脂粉18.0 g。⑥苯胺藍(lán)培養(yǎng)基：100 mL固體LB培養(yǎng)基中加苯胺藍(lán)0.1 g。⑦復(fù)篩液體培養(yǎng)基：大豆蛋白胨20.0 g，玉米粉20.0 g，CaCl20.2 g，MgSO40.3 g，Na2HPO42.0 g，NaH2PO41.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0。⑧無(wú)機(jī)鹽溶液：(NH4)2SO43 g，NaCl 0.5 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，CaCl20.3 g，ZnSO4·7H2O 0.015 g，MnSO4·7H2O 0.015 g，CoCl20.01 g，蒸餾水定容至 1 L。⑨秸稈固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：將無(wú)機(jī)鹽溶液 6 mL加入到250 mL 三角瓶中，稱取2.0 g 秸稈粉加入裝有上述溶液的三角瓶中。⑩菌糠固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取過(guò)40目篩的菌糠粉2.0 g，其他條件同秸稈固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基制作過(guò)程。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 藜蘆醇、硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈉、苯胺藍(lán)、氯化鈣(分析純)。超凈工作臺(tái)(VS-1300L-U,蘇州安泰);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(T6新悅，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);恒溫?fù)u床(SPH2102,上海世平);高壓滅菌鍋(LD2F-75L,上海申安);高速離心機(jī)(Hico21,上海生工);電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-2BS,天津宏諾);馬弗爐(上海唐河實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；電子天平(ME104E,上海梅特勒-托利多);生化培養(yǎng)箱(SPX-450,北京中儀國(guó)科)。

1.2 方法

1.2.1 耐高溫木質(zhì)素降解菌的富集 稱取實(shí)驗(yàn)室保存的菌種篩選用樣品粉10 g于錐形瓶中，加入100 mL富集培養(yǎng)基溶液，100 r/min、35 ℃培養(yǎng)6 d。

1.2.2 木質(zhì)素降解菌的初篩 用移液槍吸取1 mL錐形瓶中的上清液于9 mL無(wú)菌水試管中，充分搖勻后獲得10-1稀釋液，按上述方法制得10-2～10-7稀釋液。吸取 10-3～10-7稀釋液各100 μL涂布于以堿性木素為唯一碳源的初篩固體培養(yǎng)基平板上，每一稀釋梯度3 次重復(fù)，35 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。在相同條件下，分別挑取不同的菌落劃線培養(yǎng)，做3組平行試驗(yàn)，直至菌落形態(tài)一致完成菌株純化，4 ℃條件下LB試管培養(yǎng)基內(nèi)保存待用。

1.2.3 木質(zhì)素降解菌的復(fù)篩 ①脫色圈試驗(yàn)方法：初篩菌種接種到苯胺藍(lán)培養(yǎng)基，35 ℃避光培養(yǎng)5 d，測(cè)定藍(lán)色培養(yǎng)基中菌落的脫色圈大小。②菌種活化和粗酶液提取：將純化保存待用菌株擴(kuò)培，35 ℃、NA 培養(yǎng)基活化菌株24 h，活化菌株接種至復(fù)篩液體培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)48 h后，4 ℃、5 000 r/min 離心8 min，吸取上清液為粗酶液。③木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力測(cè)定：采用藜蘆醇法。加入1.0 mL 125 mmol/L、pH 3.0的酒石酸鈉緩沖液，0.2 mL 10 mmol/L 藜蘆醇，加入500 μL粗酶液，再加入500 μL 2 mmol/L的 H2O2溶液?jiǎn)?dòng)，30 ℃水浴3 min，310 nm處測(cè)定吸光度值。以每分鐘每毫升粗酶液降低 0.1 個(gè)OD值表示一個(gè)酶活力單位。④錳過(guò)氧化物酶活力測(cè)定：采用MnSO4法。加入3.4 mL 50 mmol/L、pH 4.5的乳酸鈉緩沖液，0.1 mL 1.6 mmol/L的 MnSO4溶液，加入0.4 mL粗酶液，再加入0.1 mL 1.6 mmol/L的 H2O2溶液?jiǎn)?dòng)，37 ℃水浴3 min，240 nm處測(cè)定吸光度，每分鐘吸光值增加 0.1的酶量表示一個(gè)酶活力單位。

1.2.4 菌株分類(lèi)鑒定 ①菌落和菌體形態(tài)觀察：觀察NA培養(yǎng)基上單菌落的光澤度、透明度、顏色、大小、形態(tài)、隆起形狀、邊緣特征等，挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。②生理生化特性測(cè)定：分別對(duì)菌株進(jìn)行硝酸鹽還原、甲基紅、吲哚試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、淀粉水解、明膠液化、過(guò)氧化氫酶、纖維素分解、葡萄糖發(fā)酵、甘露醇發(fā)酵等試驗(yàn)，并試驗(yàn)菌膜形成和固氮能力，每個(gè)處理3次重復(fù)。形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性測(cè)定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8版)、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行[11-12]。③分子鑒定：采用DNA提取試劑盒提取菌株的DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳法分析DNA的純度。以菌株基因組為模板，選取16S rDNA擴(kuò)增的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL，27F (25 μmol/L) 1 μL，1492R (50 μmol/L) 1 μL，DNA 模板(10 mmol/L) 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，循環(huán)35 次；終延伸72 ℃ 10 min。擴(kuò)增及測(cè)序工作均由寶生物工程有限公司完成。將測(cè)得的序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，并與已報(bào)道細(xì)菌菌株的16S rDNA序列同源性比較，并構(gòu)建分析菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 菌株木質(zhì)素降解效果驗(yàn)證 取1支已培養(yǎng)好的菌種斜面，加入無(wú)菌水5 mL，輕輕刮下瓊脂表面菌體，將該菌體制成懸浮液并置于已滅菌預(yù)先放置玻璃珠的50 mL三角瓶中，充分振搖，用無(wú)菌水調(diào)整菌體濃度，最終菌體活菌數(shù)達(dá)到107cfu/mL。分別吸取上述懸浮液1 mL接種到秸稈固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基、菌糠固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不接菌種為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，50 ℃培養(yǎng)20 d，65 ℃烘干至恒重，分別計(jì)算木質(zhì)素降解率。木質(zhì)素含量測(cè)定：將干凈的坩堝放入馬弗爐中，(575±25) ℃灼燒至少4 h。灼燒結(jié)束后，冷卻稱重。相同條件再次灼燒1 h后冷卻稱重。重復(fù)操作直至坩堝質(zhì)量差前后兩次小于0.3 mg，記錄此時(shí)坩堝的重量為M1。稱量300 mg烘干的檢測(cè)樣品粉加入到錐形瓶中，再加入72%的硫酸溶液3 mL混勻，30 ℃水浴 60 min，期間緩慢攪拌，5 min 一次。水浴結(jié)束后，向瓶?jī)?nèi)加入去離子水并緩慢搖勻，使硫酸的濃度為4%。密封錐形瓶后121 ℃濕熱滅菌1 h。將冷卻后錐形瓶中的液體倒入坩堝中真空抽濾，濾液備用。坩堝內(nèi)剩余固體物質(zhì)用去離子水沖洗，坩堝和固體物質(zhì)80 ℃烘干5 h后冷卻稱重。重復(fù)操作直至坩堝質(zhì)量差前后兩次小于0.3 mg，記錄坩堝和殘留物重量為M2。將坩堝和固體物質(zhì)放入馬弗爐灼燒30 h，冷卻后稱量坩堝與里面灰分的重量為M3。酸不溶木質(zhì)素(%)=((M1-M2)/M)×100%，灰分(%)=((M3-M1)/M)×100%。式中，M:檢測(cè)樣品粉的重量(mg)；M1：坩堝的重量(mg)；M2：坩堝和殘留物的重量(mg)；M3：坩堝和灰分的重量(mg)。酸溶木質(zhì)素(%)=((A×B×D)/(ε×d×M))×100%。式中，A：吸光度；B：水解液；D：用4%的硫酸溶液稀釋兩倍(D=2)；ε：320 nm下檢測(cè)樣品粉的吸收系數(shù)(ε=30 mL/mg·cm)；d：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)吸收池光程長(zhǎng)(d=1 cm)。木質(zhì)素降解率(%)=((C1-C2)/C1)×100%。式中，C1為對(duì)照木質(zhì)素質(zhì)量；C2為加菌體懸液木質(zhì)素質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫木質(zhì)素降解菌篩選結(jié)果

從樣品粉中初篩得到木質(zhì)素降解菌20株，通過(guò)對(duì)苯胺藍(lán)脫色圈觀察，選取其中褪色效果明顯的菌種6株，測(cè)定其上清液木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶活力，結(jié)果表明，菌株HZ11脫色圈直徑達(dá)30.5 mm，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶活力分別達(dá)到90.62和50.88 U/mL，酶活力明顯高于其他菌株，作為接下來(lái)進(jìn)行研究的優(yōu)勢(shì)菌種。

表1 不同菌株脫色圈直徑比較Table 1 Comparison of transparent ring diameters of different strain

表2 不同菌株木質(zhì)素降解酶活力檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of lignin degradable enzymes capacity of different strains

2.2 菌株HZ11鑒定

2.2.1 菌株HZ11的形態(tài)學(xué)及生理生化特征 圖1、圖2所示菌落和菌體細(xì)胞形態(tài)，菌株HZ11在NA 培養(yǎng)基上的菌落特征：雪花狀、純白色、無(wú)光澤、不透明、表面干燥、有大量褶皺、外緣不規(guī)則。顯微鏡下革蘭染色觀察陽(yáng)性、菌體較小、呈桿狀，有芽胞。菌株HZ11生理生化特征檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3 菌株HZ11的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain HZ11

圖1 菌株HZ11菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain HZ11

圖2 菌株HZ11細(xì)胞形態(tài) Fig.2 Cell morphology of strain HZ11

2.2.2 16S rDNA序列測(cè)定分析與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 登陸NCBI網(wǎng)站，將測(cè)出的序列通過(guò)16S rDNA序列同源性比較，進(jìn)行BLAST在線分析。菌株HZ11(編號(hào)JZ18562)與解淀粉芽胞桿菌的16S rDNA 序列同源性達(dá)到100%。從GenBank中選擇序列相似菌株，應(yīng)用Bioedit 7.0和Mega軟件進(jìn)行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，鑒定菌株HZ11為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖3 菌株HZ11的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA of strain HZ11

2.2.3 菌株HZ11木質(zhì)素降解能力測(cè)試結(jié)果 分別將菌株HZ11加入到秸稈固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和菌糠固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，50 ℃培養(yǎng)20 d，以未接菌的秸稈和菌糠為對(duì)照，測(cè)試菌株對(duì)秸稈和菌糠木質(zhì)素的降解效果。表4結(jié)果表明，加入菌株HZ11的秸稈和菌糠培養(yǎng)基質(zhì)木質(zhì)素質(zhì)量明顯降低，與對(duì)照組比較差異達(dá)顯著水平；玉米秸稈木質(zhì)素降解率46.7%，菌糠木質(zhì)素降解率42.4%，表明菌株HZ11對(duì)秸稈和菌糠木質(zhì)素均有較好的降解作用。

表4 菌株HZ11對(duì)秸稈和菌糠木質(zhì)素的降解效果Table 4 Degradation effect of strain HZ11 on straw and mushroom substrate

3 討 論

近年來(lái)，利用微生物降解木質(zhì)素成為高效利用生物質(zhì)資源的研究熱點(diǎn)，細(xì)菌中的芽胞桿菌(Bacilluscohn)具有定殖率高、容易培養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)芽胞桿菌因生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品穩(wěn)定、存儲(chǔ)期長(zhǎng)、使用方便、安全環(huán)保，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的潛力巨大，更具實(shí)際應(yīng)用價(jià)值而倍受學(xué)者們關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)部分細(xì)菌通過(guò)代謝降解、改變結(jié)構(gòu)、礦化產(chǎn)生CO2等作用降解木質(zhì)素[13-17]。王毅等[18]研究發(fā)現(xiàn)了一株枯草芽胞桿菌能夠降解木質(zhì)素；王納賢等[19]篩選出的一株淀粉芽胞桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后木質(zhì)素降解率能夠達(dá)到35%以上。本研究分離篩選到能高效降解木質(zhì)素的菌株HZ11為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),此結(jié)果與上述研究均印證了芽胞桿菌有望成為應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的木質(zhì)素高效降解優(yōu)良菌種研究的重要方向。

韓月穎[20]篩選的嗜麥芽窄食單胞菌LS-1，經(jīng)過(guò)20 d發(fā)酵后，木質(zhì)素降解率達(dá)36.14%；張芳芳等[21]測(cè)定亞黑管孔菌ZT-307和樺栓孔菌ZT-153對(duì)玉米秸稈酸不溶木質(zhì)素降解效率分別為13.60%和 21.87%；戚業(yè)強(qiáng)[22]研究了優(yōu)勢(shì)菌株W.dispersaDY5在玉米秸稈固體發(fā)酵60 d后木質(zhì)素降解率為34%;宋麗麗等[23]得出硬毛粗蓋孔菌 (Funaliatrogii(Berk.) Bondartsev &Singer) 預(yù)處理玉米秸稈的木質(zhì)素降解率為33.99%。本研究接種菌株HZ11的秸稈和菌糠培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵20 d后,秸稈和菌糠木質(zhì)素降解率分別達(dá)到46.7%和42.4%，木質(zhì)素降解效果明顯高于上述研究。與未接種菌株的對(duì)照組相比較,加入菌株HZ11的培養(yǎng)基試驗(yàn)組木質(zhì)素含量降低均達(dá)到顯著水平。同時(shí)，菌株HZ11不僅能夠高效降解木質(zhì)素，還能夠耐受50 ℃的高溫?？梢?jiàn),菌株HZ11無(wú)論是在秸桿、菌糠等農(nóng)業(yè)廢棄物高溫環(huán)境下好氧堆肥、生物飼料發(fā)酵等處理，還是在促進(jìn)生物質(zhì)資源高效利用等方面都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。