石慧君，張文麗

九江市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，江西 九江 332000

小兒咳喘靈顆粒是由麻黃等七味中藥制得，適用于緩解感冒、喘癥等［1-2］?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第四冊(cè)及20 個(gè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，具體包括金銀花或甘草酸銨的薄層色譜鑒別、綠原酸或鹽酸麻黃堿的高效液相色譜含量測(cè)定等項(xiàng)目［3］，尚未從安全性和非法添加方面進(jìn)行全面的質(zhì)量控制。處方中苦杏仁為富含淀粉、油脂的種子類藥材，瓜蔞、甘草等藥材在加工、貯藏及運(yùn)輸過(guò)程中易發(fā)生霉變，根據(jù)2020 年版《中國(guó)藥典》中藥中真菌毒素測(cè)定指導(dǎo)原則規(guī)定，糧谷類、種子類、油性成分多的品種應(yīng)注意黃曲霉毒素的檢測(cè)以及處方中含有易污染藥材的中成藥品種應(yīng)注意相關(guān)真菌毒素的檢測(cè)［4］，故有必要研究該中成藥中黃曲霉毒素的安全性。但目前未見(jiàn)小兒咳喘靈顆粒中黃曲霉毒素測(cè)定相關(guān)研究，而且應(yīng)用較為廣泛的相關(guān)檢測(cè)方法為柱后光化學(xué)衍生HPLC 法［5-7］。另外雖已有不少文獻(xiàn)涉及金銀花非法摻偽山銀花，但是基本采用薄層定性鑒別和HPLC-ELSD 法定量確認(rèn)［8-9］。隨著技術(shù)手段不斷更進(jìn)，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因具高通量、色譜無(wú)需完全分離及能夠解決假陽(yáng)性等特點(diǎn)，越來(lái)越多應(yīng)用在定性篩查及定量方面。2019 年有文獻(xiàn)［10］報(bào)道采用UPLC-MS/MS 檢測(cè)小兒咳喘靈顆粒樣品中摻偽山銀花的特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙，需先進(jìn)行HPLC-ELSD 法篩查及定量，陽(yáng)性樣品再用UPLC-MS/MS 法定性確證是否摻雜山銀花。為了檢驗(yàn)檢測(cè)手段更加快速、便捷，本研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體儀器及實(shí)際應(yīng)用，建立了UPLC-MS/MS 法（MRM模式下）對(duì)小兒咳喘靈顆粒中4 種黃曲霉毒素及灰氈毛忍冬皂苷乙的定性定量分析，找到響應(yīng)值高的監(jiān)測(cè)離子對(duì)和最優(yōu)儀器參數(shù)條件，以期為小兒咳喘靈顆粒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)提升做參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Xevo-TQD 串聯(lián)四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公司，ACQUITY 系統(tǒng)，MassLynxV4.1 工作站，ESI 離子源）；離心機(jī)（上海Anke 儀器廠）；Sartorius BP211D 天平（Sartorius 公司）；Sartorius BSA 124s 天平（Sartorius 公司）。

1.2 試藥

黃曲霉毒素Mix-4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液［中國(guó)食品藥品檢定研究院，黃曲霉毒素B1（AFB1）0.93 μg/mL、黃曲霉毒素B2（AFB2）0.30 μg/mL、黃曲霉毒素G1（AFG1）0.93 μg/mL、黃曲霉毒素G2（AFG2）0.35 μg/mL，批號(hào)610001-201804］；灰氈毛忍冬皂苷乙標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111814-201604，含量以94.4%計(jì)）。甲醇和乙腈為質(zhì)譜級(jí)（德國(guó)默克公司）；水為屈臣氏飲用水；甲酸為色譜純。小兒咳喘靈顆粒樣品為18 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的51 個(gè)批次。

2 黃曲霉毒素的含量測(cè)定

2.1 溶液配制

2.1.1 黃曲霉毒素Mix-4 儲(chǔ)備溶液的制備精密吸取黃曲霉毒素Mix-4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μL，加70%甲醇制得每1 mL 含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2分別為46.50 ng、15.00 ng、46.50 ng、17.50 ng 的混合儲(chǔ)備溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備取小兒咳喘靈顆粒約6 g，精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液50 mL，高速攪拌2 min，離心5 min，精密量取上清液25 mL，置于50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，精密移取續(xù)濾液20 mL 于免疫親和柱中，用水20 mL 洗脫，棄去洗脫液，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置于2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 空白基質(zhì)溶液的制備取不含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的小兒咳喘靈顆粒樣品，依照“2.1.2”項(xiàng)下制備方法制得。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為UPLC ACQUITY BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）。梯度洗脫程序?yàn)?～1 min，20%A；1～4 min，20%→40%A；4～5 min，40%A；5～6.8 min，40%A→100%A；6.8～7.0 min，100%A→20%A；7.0～9.0 min，20%A。流速為0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。ESI+離子源模式；離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓20 V；脫溶劑氣溫度620 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h；離子源溫度：150 ℃；MS/MS 操作模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。用于定性、定量的離子對(duì)和相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)如表1 所示。

表1 黃曲霉毒素（AF）B1、B2、G1、G2的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液及空白基質(zhì)溶液的MRM 圖見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液呈現(xiàn)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2色譜峰，且空白基質(zhì)溶液無(wú)干擾。

圖1 4種黃曲霉毒素MRM圖：A.基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；B.供試品溶液；C.空白基質(zhì)溶液

2.3.2 線性關(guān)系考察將上述對(duì)照品儲(chǔ)備液分別精密吸取20 μL 于5 mL 容量瓶中及40、160、240、320、400 μL 于2 mL 容量瓶中，用“2.1.3”項(xiàng)下的空白基質(zhì)溶液以配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別進(jìn)樣分析。以定量離子對(duì)的譜峰峰面積（Y）與對(duì)照品濃度（X）進(jìn)行線性回歸得出回歸方程，3 倍、10倍信噪比值時(shí)得出的是檢出限和定量限，結(jié)果可知在各濃度范圍內(nèi)檢測(cè)相關(guān)系數(shù)良好，見(jiàn)表2。

表2 4種黃曲霉毒素線性關(guān)系及檢出限、定量限 ng/mL

2.3.3 回收率考察選取未檢出黃曲霉毒素的小兒咳喘靈顆粒為空白樣品，精密添加“2.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液高、中、低3 個(gè)不同水平（1 mL、0.5 mL、0.25 mL），每個(gè)水平各3 份，按“2.1.2”項(xiàng)下步驟制備加樣待測(cè)溶液，分別計(jì)算添加回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中黃曲霉毒素添加回收率測(cè)定結(jié)果

2.3.4 精密度考察取“2.3.3”項(xiàng)下制備的中水平加樣待測(cè)溶液1 份，在“2.2”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次測(cè)定AFB1、AFB2、AFG1及AFG2的峰面積，計(jì)算精密度RSD 分別為1.0%、2.7%、3.1%、3.4%。

2.3.5 重復(fù)性考察平行制備六份“2.3.3”項(xiàng)下中水平加樣待測(cè)溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定AFB1、AFB2、AFG1及AFG2的平均含量，計(jì)算重復(fù)性RSD 值分別為0.9%、1.5%、2.0%、2.2%。

2.3.6 穩(wěn)定性考察取“2.3.3”項(xiàng)下中水平加樣待測(cè)溶液1 份，分別在0，2，4，8，12，24 h 進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其穩(wěn)定性RSD 值為1.5%、1.7%、2.0%、2.5%。

2.4 樣品測(cè)定

按照建立的方法檢測(cè)18 個(gè)廠家51 批小兒咳喘靈顆粒中4 種黃曲霉毒素，結(jié)果表明51 批小兒咳喘靈顆粒樣品中4 種黃曲霉毒素均在檢出限以下。

3 灰氈毛忍冬皂苷乙的含量測(cè)定

3.1 溶液配制

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備精密稱取灰氈毛忍冬皂苷乙標(biāo)準(zhǔn)品8.83 mg，置100 mL 量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，即得灰氈毛忍冬皂苷乙儲(chǔ)備液。

3.1.2 供試品溶液的制備取小兒咳喘靈顆粒約2 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液25 mL，稱定重量，超聲處理30 分鐘，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液1 mL 到10 mL 容量瓶中加75%甲醇稀釋至刻度，即得供試品溶液。

3.1.3 空白基質(zhì)溶液的制備取不含灰氈毛忍冬皂苷乙的小兒咳喘靈顆粒樣品，依照“3.1.2”項(xiàng)下制備方法制得。

3.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為UPLC ACQUITY BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）。梯度洗脫程序?yàn)?～0.3 min，5%A；0.3～7 min，5% →95%A；7～8 min，95%A；8～8.1 min，95%→5%A；8.1～10 min，5%A。流速為0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μL。ESI-離子源模式；離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓：2.8 kV；錐孔電壓：65 V；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/hr；錐孔反吹氣流量：50 L/hr；離子源溫度：150 ℃；MS/MS 操作模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。定量離子對(duì)1 397.8＞1 074.36，錐孔電壓值65 V，碰撞能設(shè)47 V；定性離子對(duì)1 397.8＞536.44，錐孔電壓值65 V，碰撞能設(shè)55 V。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性考察基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液及空白基質(zhì)液的MRM 圖見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品色譜呈相同保留時(shí)間的灰氈毛忍冬皂苷乙色譜峰，且空白基質(zhì)液無(wú)干擾。

圖2 灰氈毛忍冬皂苷乙MRM圖：A.基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；B.供試品溶液；C.空白基質(zhì)溶液

3.3.2 線性關(guān)系考察精密吸取“3.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL 于100 mL 容量瓶中，用“2.1.3”項(xiàng)下的空白基質(zhì)溶液配制成833.552 ng/mL 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀。以定量離子對(duì)的譜峰峰面積（Y）和對(duì)照品進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=0.817 72X-5.190 52，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0，說(shuō)明在0.083～2.501 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；將標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋，當(dāng)信噪比（S/N）為3 時(shí)，確定灰氈毛忍冬皂苷乙的檢測(cè)限為0.556 ng/mL。

3.3.3 回收率考察精密稱取1 g 檢出灰氈毛忍冬皂苷乙的供試品共9 份，置錐形瓶中，分別精密添加“3.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液低、中、高3 個(gè)不同水平（0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL），每個(gè)水平各3 份，依照“3.1.2”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算添加回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙添加回收率測(cè)定結(jié)果

3.3.4 精密度考察取“3.3.3”項(xiàng)下配制成的中水平加樣待測(cè)溶液，在“3.2”項(xiàng)條件下連續(xù)測(cè)定6 次灰氈毛忍冬皂苷乙的峰面積，計(jì)算精密度RSD 值為3.9% 。

3.3.5 重復(fù)性考察選取“3.3.3”項(xiàng)下同一批號(hào)的供試樣品，平行制備6 份供試品溶液，在“3.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定灰氈毛忍冬皂苷乙的平均含量，計(jì)算重復(fù)性RSD 值為3.1%。

3.3.6 穩(wěn)定性考察取“3.3.3”項(xiàng)下同一批號(hào)的供試樣品1 份，分別在0，2，4，8，12，24 h 進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其穩(wěn)定性RSD 值7.8%。

3.4 樣品測(cè)定

取18 個(gè)廠家51 批小兒咳喘靈顆粒的樣品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果3 批樣品檢出灰氈毛忍冬皂苷乙，檢出含量分別為0.068 55 mg/g、1.013 mg/g、0.288 5 mg/g。

4 討論

4.1 凈化條件的優(yōu)化

小兒咳喘靈顆粒成分復(fù)雜，產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)是影響UPLC-MS/MS 檢測(cè)準(zhǔn)確度的主要因素，本研究采用免疫親和柱對(duì)樣品進(jìn)行純化，有效去除基質(zhì)中大量輔料及醇不溶性雜質(zhì)，回收率結(jié)果令人滿意，操作簡(jiǎn)便。

4.2 UPLC-MS/MS 儀器參數(shù)的優(yōu)化

4.2.1 測(cè)定黃曲霉毒素比較乙腈/甲醇-甲酸溶液、甲醇/乙腈-醋酸銨溶液等不同系統(tǒng)流動(dòng)相，其中乙腈系統(tǒng)峰形及分離度較好，保留時(shí)間較短，更能實(shí)現(xiàn)快速分析。流動(dòng)相水相加入甲酸時(shí)，正離子模式的4 種黃曲霉毒素離子響應(yīng)強(qiáng)度很好；當(dāng)加入醋酸銨時(shí)，響應(yīng)值較之更低。也考察了甲酸的濃度0.1%、0.2%、0.3%，其中0.2%的甲酸濃度色譜峰型效果和離子化效果最佳，故選擇乙腈-0.2%甲酸溶液作為流動(dòng)相測(cè)定4 種黃曲霉毒素。配制黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的標(biāo)準(zhǔn)品，在調(diào)諧（mass tune）界面中，選正離子MS 模式根據(jù)母離子響應(yīng)強(qiáng)度優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和脫溶劑氣溫度等，打開碰撞氣氬氣，MS/MS 模式下做子離子掃描（daughter scan）采集。確定定量和定性子離子，設(shè)定好母離子和碎片離子，通過(guò)優(yōu)化碰撞能，使子離子響應(yīng)強(qiáng)度最高。

4.2.2 測(cè)定灰氈毛忍冬皂苷乙結(jié)合文獻(xiàn)資料［10-11］，ESI 正離子源模式下，離子對(duì)1 421.6＞1 097.5，確定［M+Na］+。通過(guò)MS SCAN 模式掃描，不能提取到1 421.6 的母離子，下一步手動(dòng)調(diào)諧尋找母離子，選擇不同毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑氣溫度，最終確定正離子模式下最優(yōu)條件：毛細(xì)管電壓：3.2 kV；錐孔電壓：53 V；脫溶劑氣溫度：450 ℃；離子源溫度：150 ℃，此時(shí)m/z 1 421.6 離子響應(yīng)值最大。打開碰撞氣氬氣，做daughter scan 采集提取到子離子936.08 和1 097.64，然而設(shè)定好母離子和碎片離子，通過(guò)優(yōu)化碰撞能，并不能在質(zhì)譜觀測(cè)窗口看到任何采集圖譜。于是建立了ESI-模式下的UPLC-MS/MS 法，按照手動(dòng)調(diào)諧步驟，重復(fù)上述操作，優(yōu)化條件得到毛細(xì)管電壓：2.8 kV；錐孔電壓：65 V；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/hr；錐孔反吹氣流量：50 L/hr；離子源溫度：150 ℃。確定m/z 1 397.8 離子響應(yīng)強(qiáng)度最大，對(duì)應(yīng)母離子［M-H］-，繼續(xù)優(yōu)化碰撞能，得到子離子1 074.36（離子響應(yīng)最高）和536.44（響應(yīng)次之）。實(shí)驗(yàn)中采用MRM 監(jiān)測(cè)模式定性定量，所建立的方法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于準(zhǔn)確篩查小兒咳喘靈顆粒中山銀花的使用情況。

4.3 含量測(cè)定結(jié)果分析

建立的免疫親和柱凈化UPLC-MS/MS 法檢測(cè)4種黃曲霉毒素，樣品中均未檢出，說(shuō)明小兒咳喘靈顆粒均無(wú)黃曲霉毒素污染察，質(zhì)量安全性良好。建立的UPLC-MS/MS 快速測(cè)定樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙，檢出3 批存在摻雜山銀花違規(guī)現(xiàn)象，因此應(yīng)加強(qiáng)中藥制劑中對(duì)山銀花代替金銀花投料的監(jiān)管，嚴(yán)防非法添加山銀花的現(xiàn)象發(fā)生。

該研究從質(zhì)量安全和非法添加出發(fā)，實(shí)現(xiàn)了建立UPLC-MS/MS 方法定性定量分析小兒咳喘靈顆粒中4 種黃曲霉毒素及灰氈毛忍冬皂苷乙，能夠快速、有效地對(duì)小兒咳喘靈顆粒進(jìn)行質(zhì)量把控。