李博涵，彭秘，封傳華，任琦，陳集志，徐蘭

1.南昌大學江西醫(yī)學院，江西 南昌 330006；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第908 醫(yī)院，江西 南昌 330002；3.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004；4.江西省藥品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330029

比阿培南是一種新型1β-甲基碳青霉烯類抗菌藥物，通過結(jié)合細菌細胞壁上的青霉素結(jié)合蛋白，能有效地經(jīng)細菌外膜滲透進入周質(zhì)間隙，發(fā)揮強大的殺菌活性［1］，對革蘭陽性菌（G+菌）、革蘭陰性菌（G-菌）和厭氧菌等能發(fā)揮廣譜、強大的抗菌活性［2］，被廣泛用于特殊病理生理狀況的重癥感染患者的經(jīng)驗性治療、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶G-桿菌引起的急慢性感染，臨床上較多地用于腹腔感染、呼吸道感染、敗血癥、婦產(chǎn)科感染、心內(nèi)膜炎及尿路感染［3］。比阿培南為時間依賴性抗菌藥物，發(fā)揮殺菌活性的前提是抗菌藥物濃度要達到某水平并維持較長時間。比阿培南血清穩(wěn)態(tài)濃度高于大多數(shù)G+菌、G-菌和厭氧菌的MIC90（抑制90%細菌生長的最低藥物濃度），對非產(chǎn)酶腸桿菌科和敏感金葡菌的敏感率均大于90%［4］，但鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌這兩種病原菌的MIC90 可達到64、16 μg/mL［1］，高于比阿培南血清穩(wěn)態(tài)濃度。因此，需監(jiān)測重癥感染患者中比阿培南的血藥濃度，按監(jiān)測結(jié)果制定個體化的給藥方案，提高臨床治療成功率。

藥物在血中呈游離狀態(tài)的部分能產(chǎn)生藥理效應，能被機體轉(zhuǎn)化和排泄，更為準確的做法是采用游離藥物濃度來評價藥效學和藥物不良反應。本研究參考文獻［5-7］，建立了一種快速、簡便、準確度高的HPLC 法測定人血清中游離比阿培南濃度，并應用于監(jiān)測ICU 患者比阿培南的血清濃度，為安全合理使用比阿培南提供參考。

1 儀器與試藥

LC-15C 型高效液相色譜儀（日本島津）；Millipore 超純水儀（美國Millipore 公司）；DL-360D型智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；AUW220D 型電子分析天平（日本島津）；TGL-16 型高速離心機（山東百歐醫(yī)療科技有限公司）；XH-B型微量渦旋混合器（上海汗諾儀器有限公司）；ST 3100 型pH 計（常州奧豪斯儀器有限公司）；移液槍（Thermo Fisher 公司）；超濾離心管（10kD,聚醚砜膜，美國Millipore 公司）。比阿培南對照品（批號：A137321337769，純度98.00%，APEXBio 公司）；注射用比阿培南（批號：201116125，規(guī)格：0.3 g，正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司）；3-（N-嗎啉）丙磺酸（MOPS，批號：BCB28902，純度≥99.5%，美國sigma-Aldrich 公司）；醋酸銨（批號：20190620，國藥集團化學試劑有限公司）；硫酸鋅（批號：202031099，天津市致遠化學試劑有限公司）；滅菌注射用水（四川科倫藥業(yè)，批號：M14101008，規(guī)格：500 mL）；乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Atlantis T3 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.01 mol/L 醋酸銨緩沖液（pH4.6）（2∶98）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為300 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。

2.2 溶液的配制

MOPS 溶液：精密稱取MOPS 25 mg，置50 mL棕色量瓶中，加適量水溶解，用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值為7，再加水定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.5 mg/mL 的MOPS 溶液，4 ℃冷藏保存；比阿培南對照品儲備液：精密稱取比阿培南對照品0.021 1 g，置25 mL 棕色量瓶中，用0.5 mg/mL MOPS（pH 7.0）溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得校準后濃度為0.827 1 mg/mL 的比阿培南對照品儲備液，分裝于1.5 mL EP管中，-20 ℃冷凍保存。

2.3 樣品的處理

精密量取血清210 μL，加入0.5 mg/mL MOPS（pH 7.0）溶液160 μL，渦旋混勻1 min，轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，15 000 r/min離心10 min，取下層濾液，進樣分析。

2.4 專屬性試驗

A：取空白血清160 μL，加入0.5 mg/mL MOPS溶液（pH 7.0）210 μL，渦旋混勻1 min，轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，15 000 r/min 離心10 min，取下層濾液，進樣分析。B：取空白血清160 μL，加比阿培南對照品儲備溶液50 μL，加入0.5 mg/mL MOPS（pH 7.0）溶液160 μL，渦旋混勻1 min，轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，15 000 r/min 離心10 min，取下層濾液，進樣分析。C：取患者用藥后的血清，按“2.3”項下方法操作，進樣分析。結(jié)果見圖1，比阿培南保留時間約為5.4 min，色譜峰形較好，2.5 min 左右的雜質(zhì)峰和其他內(nèi)源性雜質(zhì)對比阿培南峰型均不造成干擾。

圖1 HPLC色譜圖：A.空白血清；B.空白血清+比阿培南；C.患者血清

2.5 標準曲線的建立

取比阿培南對照品儲備液適量，用0.5 mg/mL MOPS 溶液（pH 7.0）稀釋并配制系列對照品濃度分別為0.81、1.62、6.46、12.92、25.85、51.69、103.39、206.77 μg/mL。精密量取空白血清160 μL，分別加入上述系列對照品溶液各50 μL，使比阿培南血清濃度分別為0.20、0.40、1.58、3.16、6.32、12.65、25.30、50.59 μg/mL，按“2.3”項處理，記錄色譜圖。以峰面積（A）為縱坐標，血清中比阿培南濃度（C，μg/mL）為橫坐標，建立標準曲線，得比阿培南的線性回歸方程為A=19 558C+531.15，r=0.999 9。定量下限為0.20 μg/mL。結(jié)果表明，比阿培南血清濃度在0.20～50.59 μg/mL 與峰面積線性關系良好。

2.6 回收率試驗

分別配制低、中、高濃度為1.54、6.15、24.62 μg/mL 的對照血樣，每個濃度各5 份，按“2.3”項處理，記錄色譜圖，由回歸方程計算得出測定濃度，方法回收率=測定濃度/理論濃度×100%，結(jié)果見表1。結(jié)果表明方法回收率均符合生物樣品分析要求。

2.7 精密度試驗

分別配制濃度為1.54、6.15、24.62 μg/mL 的比阿培南對照血樣，每個濃度各5 份，按“2.3”項處理，分別在同一天內(nèi)測定5 次、每天測1 次連續(xù)3 天，計算日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1。比阿培南的日內(nèi)、日間精密度RSD 均＜8%，表明精密度符合生物樣品分析要求。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗

分別配制低、中、高濃度為1.54、6.15、24.62 μg/mL 的比阿培南對照血樣，每個濃度各3 份，按“2.3”項下方法處理。室溫穩(wěn)定性：室溫放置0、2、4、6、8、12 h；冷藏穩(wěn)定性：4 ℃冰箱冷藏放置48 h；凍融穩(wěn)定性：-20 ℃冰箱凍存，取出置室溫自然融化，再置-20 ℃凍存24 h，此步驟重復2 次，共進行3 次。以上樣品均按“2.3”項下方法處理。結(jié)果顯示樣品連續(xù)凍融3 次后，比阿培南穩(wěn)定性有一定幅度下降，而凍融2 次穩(wěn)定性良好；室溫放置12 h、4 ℃下放置48 h、-20 ℃放置15 d 穩(wěn)定性良好（比阿培南濃度變化＜15%，RSD＜6.65%）。

3 治療藥物監(jiān)測

3.1 入選病例

本研究共納入病例69 例，藥敏試驗提示為多重耐藥菌感染或（和）對碳青霉烯類敏感的重癥患者，年齡≥18 歲，使用比阿培南≥3 d。

3.2 樣本收集及療效判定

給藥方案為比阿培南0.6 g，加入50 mL 0.9%氯化鈉注射液中，輸液泵泵注2～3 h，每8 小時給藥一次。比阿培南血藥濃度達穩(wěn)態(tài)（用藥2 d）后，于給藥前30 min，外周靜脈采血，測定谷濃度。本院倫理委員會已批準通過本試驗方案。根據(jù)《抗菌藥物臨床應用指導原則》（2015 年版）制定臨床療效和微生物學療效的評定標準。臨床療效：評定為治愈的標準為癥狀、體征均已消失或完全恢復正常，且非微生物學指標如影像學和實驗室等均已恢復正常；微生物學療效：微生物清除或未清除但臨床癥狀及體征好轉(zhuǎn)評定為好轉(zhuǎn)?？傆行?（臨床治愈+好轉(zhuǎn)）/總例數(shù)×100%。

3.3 結(jié)果

參考相關文獻［8-9］，本研究將比阿培南谷濃度目標設定為1～10 μg/mL，測定結(jié)果見圖2。低于最低檢測限的患者有5 例；有16 例低于1 μg/mL，根據(jù)《抗菌藥物臨床應用指導原則》（2015 年版）制定的臨床療效和微生物學療效評定標準，其中有13例治療效果不佳，調(diào)整比阿培南用藥方案比如加大單次使用劑量為0.6 g、增加給藥頻次至4 次/日、延長泵注時間等，再次監(jiān)測谷濃度均有明顯上升，均在1～10 μg/mL范圍內(nèi)，最終有12例臨床治療有效，1 例患者死亡；46 例在目標范圍（1～10 μg/mL）內(nèi)，臨床治療有效率為86.96%；有7 例大于10 μg/mL，其中2 例治療無效。

圖2 比阿培南血清游離谷濃度（實線表示為目標濃度范圍1～10 mg/L）

4 討論

4.1 色譜柱的選擇

比阿培南的水溶性大，在反相色譜柱上，特別是在非極性的C18 色譜柱上保留非常弱。在前期試驗中為了獲得適當?shù)纳V保留，使用乙腈-0.01 mol/L醋酸銨緩沖液（pH4.6）（2∶98）為流動相，因采用的C18 色譜柱不是耐水色譜柱，高水比例的流動相引起色譜柱硅膠基質(zhì)發(fā)生降解、修飾碳鏈倒伏斷裂，導致C18 色譜柱柱效快速下降、色譜峰型變差或拖尾等。因此，本研究換用了對極性大的化合物保留能力強、在水流動相中性能穩(wěn)定的Waters Atlantis T3色譜柱，解決了普通C18 色譜柱難以保留極性化合物這種難題。

4.2 樣品處理方法的選擇

目前關于比阿培南血清濃度測定方法包括微生物效價法［10］、硫酸鋅或硫酸銨蛋白沉淀法［6,8,10］、沉淀蛋白后反洗法［11］、超濾離心法［6-7］、固相萃取法［12］等，但考慮到微生物效價法干擾因素較多，準確性、重現(xiàn)性較差，而固相萃取法因操作步驟繁瑣，且衍生化試劑和衍生化產(chǎn)物的不穩(wěn)定性易影響到測定結(jié)果，兩種方法均無法快速有效監(jiān)測比阿培南血清濃度。本研究選擇并比較了硫酸鋅蛋白沉淀法和超濾離心法對血樣分離效果的影響。經(jīng)硫酸鋅沉淀蛋白后的樣品，雖然處理過程簡便、成本低，但可能是因為硫酸鋅與比阿培南產(chǎn)生共沉淀，或者比阿培南濃度因硫酸鋅稀釋血樣后有所下降［5］，比阿培南提取回收率僅33%左右，樣品經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過并靜置后仍變得渾濁不清，易堵塞色譜柱，色譜圖雜質(zhì)峰較多，干擾比阿培南峰，這結(jié)果與多篇文獻［6,8,10］報道不同。而超濾離心管處理的血樣提取回收率＞95%，能較好地保持比阿培南分子在血清中的活性，樣品澄清無雜質(zhì)，經(jīng)過約10 min 的處理就可快速用于測定，適合實時監(jiān)測血清濃度，也可減少比阿培南因其不穩(wěn)定性導致的降解，是目前較好的血樣處理方法。比阿培南的蛋白結(jié)合率約10%，與蛋白結(jié)合的比阿培南分子量超過超濾離心管膜孔的截止尺寸（10 kD），將不能被濾過。超濾離心法具有簡便、快捷、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，可作為測定比阿培南游離濃度的首選方法。

4.3 比阿培南血清游離濃度監(jiān)測

本研究測定的比阿培南血清游離濃度波動范圍為0～24.32 μg/mL，說明比阿培南在體內(nèi)代謝過程個體化差異較大，這可能是因為與健康人群相比較，比阿培南在ICU 患者體內(nèi)的藥動學參數(shù)有很大差異，如Cmax（峰濃度）、AUC 0～8 h（0～8 h 內(nèi)的藥時-曲線下面積）小于健康人群，而T1/2（半衰期）、Cl（清除率）、Vd（表觀分布容積）遠大于健康人群［4］，從而導致血藥濃度個體化差異較大。

在影響藥效達標率（PTA）的諸多因素中如MIC（最低抑菌濃度）、Vd、T1/2 等，MIC 的權(quán)重最大，達 90%以上，且MIC 值與PTA 成反比［13］。比阿培南對敏感菌株、中介需氧菌和非產(chǎn)酶腸桿菌科等病原菌的清除率較高且細菌耐藥發(fā)生率較低；對ICU常見的耐藥菌如多重耐藥鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的MIC90 分別為32～64、16～64 mg/L，敏感率均＜30%［4,14］。

ICU 患者血流動力學狀態(tài)個體差異大，病理生理狀態(tài)不同，本研究通過監(jiān)測比阿培南血清游離濃度，驗證其是否在目標范圍內(nèi)，并結(jié)合患者臨床癥狀及感染程度，制定比阿培南的個體化給藥方案，對大部分患者抗感染治療有一定的指導作用，能進一步促進臨床合理用藥，避免不良反應的發(fā)生，提高臨床用藥安全性和有效性。