梁超，汪揚(yáng)，劉新博，李善寶，2

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 肝膽胰外科，上海 200437；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第一人民醫(yī)院普通外科，上海 200080）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）為臨床上常見(jiàn)的急腹癥，是急性胰腺炎的一個(gè)亞型，與多器官功能衰竭及全身炎癥反應(yīng)綜合征相關(guān)，嚴(yán)重者危及生命[1-2]。SAP患者易并發(fā)腸道屏障功能障礙，而小腸巨噬細(xì)胞的M1/M2型極化參與腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，但機(jī)體機(jī)制仍有待深入研究[3-4]。

M1型巨噬細(xì)胞活化后可分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α），并表達(dá)特征及標(biāo)識(shí)分子誘生型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），而iNOS基因上存在著核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）調(diào)控位點(diǎn)，NF-κB可調(diào)節(jié)iNOS的表達(dá)[5]?？寡装Y因子IL-4參與調(diào)節(jié)SAP炎癥反應(yīng)過(guò)程，而M2型巨噬細(xì)胞活化后分泌IL-4，可減輕M1型巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)[5-6]；其亦可產(chǎn)生精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1），使清道夫受體表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致產(chǎn)生一氧化氮（nitric oxide，NO）及IL-12的能力下降，因此將表達(dá)的Arg-1及IL-4作為M2分化的證據(jù)[7]，同時(shí)過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferater activated receptor γ，PPAR-γ）是M2巨噬細(xì)胞活化過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄因子[8]。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8樣分子2（tumor necrosis factor-α-induced protein 8 like 2，TIPE2）屬于TNFAIP8家族成員，是天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控因子；在巨噬細(xì)胞中，TIPE2高表達(dá)可調(diào)控NF-κB信號(hào)途徑，可抑制M1巨噬細(xì)胞的分化。在T淋巴細(xì)胞中可負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體及Toll樣受體的活化，阻止嚴(yán)重炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展，進(jìn)而對(duì)維持免疫的穩(wěn)態(tài)起到重要作用[9-11]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)活血清解湯可緩解SAP的炎癥反應(yīng)，但是對(duì)腸道屏障免疫功能的影響不清，其對(duì)巨噬細(xì)胞的極化更需深入研究。

本研究利用?；悄懰徕c構(gòu)建大鼠SAP模型，使用中藥活血清解湯研究其對(duì)大鼠胰腺及腸道炎癥的反應(yīng)情況，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討活血清解湯對(duì)腸巨噬細(xì)胞分化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、動(dòng)物及器械 大鼠小腸巨噬細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。SPF級(jí)別雄性SD大鼠200～230 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物房為SPF級(jí)，環(huán)境：恒溫26 ℃、恒濕45%～55%、12 h光照和12 h黑夜交替，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和飲水，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)倫理注冊(cè)號(hào)：YYLAC-2021-118。實(shí)驗(yàn)器械，剪刀、鑷子等（購(gòu)自上海金鐘器械廠），手術(shù)縫線(xiàn)、注射器等（購(gòu)自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司），微泵注射裝置由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽胰外科提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器 活血清解湯：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室提供，主要成分有丹參12 g、赤芍9 g、大黃15 g、枳實(shí)12 g、芒硝6 g、柴胡12 g、桃仁12 g、黃連9 g、黃芩等9 g，濃煎后相當(dāng)于生藥1 g/mL，每毫升相當(dāng)于含生藥1 g。牛磺膽酸鈉（Sigma，美國(guó)），用生理鹽水配成5%溶液。2%戊巴比妥由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。DMEM培養(yǎng)基（SH30022.01B，Hyclone，美國(guó)），PBS（GNM20012，吉諾生物，中國(guó)），胰酶（碧云天，中國(guó)），青鏈霉素雙抗（C0222，碧云天，中國(guó)），胎牛血清（FBS）（26010074，Gibco，美國(guó)），TRIzol（15596018，Invitrogen，美國(guó)），引物（上海生工生物科技有限公司，中國(guó)），Prime ScriptTMRT Reagent Kit（RR047A，TakaRa，日本），SYBR?Premix Ex TaqTM（RR820A, TakaRa，日本），CCK-8試劑盒（C0037，碧云天，中國(guó)），RIPA裂解液（P0013C，碧云天，中國(guó)），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P0012S，碧云天，中國(guó)），2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（P0015B，碧云天，中國(guó)），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（P0012A，碧云天，中國(guó)），ECL發(fā)光試劑盒（P0018FS，碧云天，中國(guó)），預(yù)染蛋白Marker（LC5615，Thermo Fisher，美國(guó)），GAPDH（ab9485，Abcam，英國(guó)），PPARγ抗體（ab178860，Abcam，英國(guó)），IL-4（12227S，CST，美國(guó)），TIPE2（53842S，CST，美國(guó)），Arg1（93668T，CST，美國(guó)）、NF-κB（8242T，CST，美國(guó)），iNOS（80517-1-RR，Proteintech，美 國(guó)）、TNFα抗體（17590-1-AP，Proteintech，美國(guó)）。大鼠血清淀粉酶（CSB-EL001689RA，華美生物，中國(guó)），大鼠血脂肪酶（CSB-E13784r，華美生物，中國(guó)），IL-4（CSB-E04635r，華美生物，中國(guó)）及TNFα（CSB-E11987r，華美生物，中國(guó)）的ELISA試劑盒。普通PCR儀（BIO-RAD，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量（BIO-RAD，美國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（BIORAD，美國(guó)），轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD，美國(guó)），電泳儀（BIO-RAD，美國(guó)），化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SAP模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 ⑴ 模型制備：所有大鼠術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉。用微量泵通過(guò)胰管逆行以1 mL/kg的劑量持續(xù)勻速輸入5%的?；悄懰徕c，速度為0.06 mL/min，輸注時(shí)間5 min建立SAP模型[3,12]。⑵ 動(dòng)物分組：假手術(shù)組是麻醉后開(kāi)腹擾動(dòng)胰組織后關(guān)腹，腹腔注射生理鹽水0.2 mL每只。治療組用活血清解湯灌胃，每20 mL/kg，每6 h灌胃1次。非治療組及治療組分別在6 h及12 h，用2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，開(kāi)腹經(jīng)腹主動(dòng)脈注射器采血并處死動(dòng)物，動(dòng)脈血靜置30 min后離心（3 500 r/min，5 min），收集上清液置于-80 ℃冰箱中凍存用于后續(xù)生化檢測(cè)。⑶ 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：將大鼠小腸巨噬細(xì)胞分別用活血清解湯（活血清解湯組）、牛磺膽酸鈉（?；悄懰徕c組），?；悄懰徕c+活血清解湯（?；悄懰徕c+活血清解湯組）處理，以無(wú)處理的大鼠小腸巨噬細(xì)胞為空白對(duì)照組，共培養(yǎng)24 h。活血清解湯顆粒溶解于DMSO，并用細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾清除雜質(zhì)及微生物，收集各組培養(yǎng)基上清液、細(xì)胞進(jìn)行備用（已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)采用?；撬崮扄}刺激巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚13-14]）。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn) 大鼠小腸巨噬細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)后，制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋后在96孔板中接種待測(cè)細(xì)胞懸液，每孔約5×103個(gè)細(xì)胞100 μL細(xì)胞懸液，種3個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)6 h。加入不同濃度梯度的?；悄懰徕c或者活血清解湯（藥物采用40 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾），其中牛磺膽酸鈉濃度設(shè)定根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及說(shuō)明書(shū)設(shè)置成（1～128 μmol/L相關(guān)濃度梯度）[13-14]，活血清解湯根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)設(shè)置成（1～64 g/mL相關(guān)濃度梯度），37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)1.5 h，后測(cè)定450 nm吸光度。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TRIzol試劑從培養(yǎng)的大鼠巨噬細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明，建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃60 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，最后降至4 ℃結(jié)束反應(yīng)。以檢測(cè)NF-κB、iNOS、TNF-α、Arg-1、IL-4、TIPE2、PPAR-γ和GAPDH表達(dá)的表達(dá)水平，其中GAPDH被用作內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4 Western blot 細(xì)胞置于蛋白裂解液中，制備組織勻漿，提取大鼠巨噬細(xì)胞中總蛋白質(zhì)。根據(jù)BCA蛋白測(cè)定試劑盒的制造商說(shuō)明書(shū)，測(cè)定所提取樣品的蛋白質(zhì)濃度。取20 μg蛋白進(jìn)行10% SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h后，加入一抗iNOS（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、NF-κB（1∶2 000）、Arg-1（1∶1 000）、IL-4（1∶1 000）、TIPE2（1∶1 000）、PPAR-γ（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000），4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜3次后，加二抗（抗兔/鼠1:5 000），37 ℃孵育2 h。洗膜3次后，加入ECL試劑，機(jī)器顯影。

1.2.5 ELISA實(shí)驗(yàn) 按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)大鼠的血淀粉酶、血脂肪酶、IL-4和TNF-α水平進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 組織病理學(xué)觀察 取胰腺及小腸組織，切取0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm大小組織塊，10%中性福爾馬林固定，自動(dòng)脫水機(jī)逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，包埋、4 μm切片，HE染色，顯微鏡觀察組織的病理變化。依照Schmidt病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[15]對(duì)各組胰腺進(jìn)行改良評(píng)分，從胰腺水腫、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等方面對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)定，分為5個(gè)等級(jí)，以1、2、3、4、5分進(jìn)行標(biāo)記。以Chiu病理評(píng)分[16]為基礎(chǔ)對(duì)腸黏膜、固有層及腺體等組織炎癥病理進(jìn)行改良評(píng)分，包括腸絨毛、水腫、出血、炎癥、壞死、潰瘍等方面進(jìn)行評(píng)分，小腸黏膜損傷程度評(píng)分：0～5分，每段小腸觀察10個(gè)視野，評(píng)分總和為小腸黏膜病理評(píng)分[17-18]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS軟件（版本22.0）進(jìn)行，所有條形圖中的誤差條表示指定的SD或SEM，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，兩組間采用t檢驗(yàn)，組間多重比較采用F檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)各組TNF-α和IL-4、血清淀粉酶及血脂肪酶水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組術(shù)后6、12 h的TNF-α表達(dá)量增加（均P＜0.05），而治療組后6、12 h的TNF-α表達(dá)量明顯低于相同時(shí)間段的非治療組（均P＜0.05），且治療組的TNF-α表達(dá)量明隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯降低（P＜0.05）（圖1A）。與假手術(shù)組比較，模型組術(shù)后6 h的IL-4表達(dá)量增加不明顯（P＞0.05），而治療組術(shù)后6 h的IL-4表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組與模型組（均P＜0.05），且隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)治療組IL-4表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）（圖1B）。在相同時(shí)間段的血清淀粉酶及脂肪酶水平，治療組明顯低于相同時(shí)間段的模型組（均P＜0.05）（圖1C-D）。

圖1 各組血清中TNF-α、IL-4、血清淀粉酶及脂肪酶水平比較 1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與同組6 h比較，P＜0.05；3）與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.05Figure 1 Comparison of the serum levels TNF-α, IL-4, amylase and lipase among groups 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.the 6-h value in the same group; 3) P＜0.05 vs.the value of the same time point in model group

2.2 各組胰腺及腸道組織HE染色以及病理結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組胰腺組織無(wú)水腫、充血和胰腺壞死，鏡下胰腺腺泡排列規(guī)則，腺管形態(tài)正常，無(wú)明顯充血、壞死和炎性浸潤(rùn)，且胰島結(jié)構(gòu)完整；腸道上皮及絨毛未見(jiàn)明顯損傷，無(wú)充血及水腫，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與手術(shù)組比較，模型組與治療組術(shù)后6、12 h的胰腺組織均有出血，腺泡細(xì)胞腫脹、壞死，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，葉間隙增寬，間質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變；小腸組織可見(jiàn)更多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)彌散、小腸絨毛斷裂及脫落、腺體腫脹、出血灶形成，甚至固有層崩解。模型組胰腺與小腸的病理改變隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重，治療組胰腺與小腸的病理改變隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減輕（圖2）。各組胰腺與小腸組織的病理學(xué)評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表2）。

表2 各組胰腺和腸道組織病理學(xué)評(píng)分比較（±s）Table 2 Comparison of pathological score of pancreas and intestine issue among three groups (±s)

表2 各組胰腺和腸道組織病理學(xué)評(píng)分比較（±s）Table 2 Comparison of pathological score of pancreas and intestine issue among three groups (±s)

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與同組6 h比較，P＜0.05；3）與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.05Notes：1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.the 6-h value in the same group; 3) P＜0.05 vs.the value of the same time point in model group

組織胰腺小腸假手術(shù)組1.56±0.32 2.63±0.49模型組6 h 10.24±1.571）15.41±1.521）12 h 14.72±1.391），2）27.53±2.771），2）治療組6 h 12.85±1.691），3）18.49±2.141），3）12 h 9.26±1.311），2），3）10.17±1.241），2），3）

圖2 各組大鼠胰腺和腸道組織病理學(xué)改變（HE×200）Figure 2 The histopathological changes of the pancreatic and intestinal tissues (HE×200)

2.3 各組大鼠小腸組織與M1/M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因iNOS、Arg-1的表達(dá)

Western blot及qRT-PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組12 h組的iNOS表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），而治療組的iNOS表達(dá)量明顯低于相同時(shí)間段的非治療組（均P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組6 h的Arg-1表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），而12 h的Arg-1表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），治療組Arg-1表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組與模型組6 h的表達(dá)了（均P＜0.05），且隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)Arg-1表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）（圖3）。

圖3 Western blot及qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠小腸組織iNOS、Arg-1基因的表達(dá) 1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.05Figure 3 The expressions of iNOS and Arg-1 in small intestine among groups of rats detected by Western blot and qRT-PCR 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.the value of the same time point in model group

2.4 大鼠腸巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

利用CCK-8實(shí)驗(yàn)，按照相應(yīng)的濃度梯度，加入大鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)?；悄懰徕c對(duì)大鼠小腸巨噬細(xì)胞的IC50濃度為6 μmol/L（圖4）；活血清解湯對(duì)大鼠小腸巨噬細(xì)胞的IC50濃度為6.8 g/mL（圖4）。

圖4 CCK-8檢測(cè)?；悄懰徕c與活血清解湯對(duì)大鼠小腸巨噬細(xì)胞的IC50濃度Figure 4 IC50 values of sodium taurocholate and HXQJ decoction on rat intestinal macrophages determined by CCK-8 assay

體外實(shí)驗(yàn)中，?；悄懰徕c與活血清解湯均采用各自IC50濃度。Western blot及qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及活血清解湯組比較，?；悄懰徕c組NF-κB、iNOS及TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯上升（均P＜0.05），而Arg-1、IL-4、TIPE2及PPAR-γ蛋白及mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；與空白對(duì)照組比較，活血清解湯組Arg-1、IL-4、TIPE2及PPAR-γ蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.05），而NF-κB、iNOS及TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化（均P＞0.05）；與?；悄懰徕c組比較，?；悄懰徕c+活血清解湯組的NF-κB、iNOS及TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯下降（均P＜0.05），而Arg-1、IL-4、TIPE2及PPAR-γ蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯增加（均P＜0.05）（圖5-6）。

圖5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB、iNOS、TNF-α、Arg-1、IL-4、TIPE2及PPAR-γ蛋白表達(dá) 1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與牛磺膽酸鈉組比較，P＜0.05Figure 5 The protein expressions NF-κB, iNOS, TNF-α, Arg-1, IL-4, TIPE2 and PPAR-γ in each group of cells determined by Western blot 1) P＜0.05 vs.blank control group; 2) P＜0.05 vs.sodium taurocholate group

圖6 qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的NF-κB、iNOS、TNF-α、Arg-1、IL-4、TIPE2及PPAR-γ mRNA表達(dá) 1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與?；悄懰徕c組比較，P＜0.05Figure 6 The mRNA expressions NF-κB, iNOS, TNF-α, Arg-1, IL-4, TIPE2 and PPAR-γ in each group of cells determined by qRT-PCR 1) P＜0.05 vs.blank control group; 2) P＜0.05 vs.sodium taurocholate group

3 討 論

急性胰腺炎是臨床上一種常見(jiàn)的急腹癥，特征是胰腺水腫、出血、壞死等。其中約1/5的患者并發(fā)SAP，不僅會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的急性胰腺損傷，還易引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至是多器官功能障礙綜合征[3]。在SAP早期，機(jī)體促炎與抗炎調(diào)節(jié)機(jī)制失衡，引起炎癥過(guò)度反應(yīng)，導(dǎo)致胰腺局部及外組織損傷[19]。腸道是全身炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要靶器官，可防止腸道內(nèi)的細(xì)菌及毒素等有害物質(zhì)穿透腸壁，在維護(hù)機(jī)體內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[20]。SAP早期時(shí)易并發(fā)腸道屏障功能障礙，引起的腸道菌群異位、腸源性感染以及內(nèi)毒素血癥可進(jìn)一步加重SAP[21]。其中單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)被激活，TNF-α等促炎細(xì)胞因子鏈啟動(dòng)后，引起炎癥介質(zhì)級(jí)聯(lián)樣反應(yīng)，加重腸黏膜損傷，導(dǎo)致腸道屏障功能障礙[22-23]。

在本研究中，利用?；悄懰徕c構(gòu)建大鼠SAP模型，血淀粉酶、脂肪酶及病理學(xué)結(jié)果提示成功構(gòu)建，與相關(guān)報(bào)道相似[3,24]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)活血清解湯能減輕SAP大鼠的炎癥反應(yīng)程度，促炎癥因子TNF-α釋放減少，抗炎因子IL-4釋放增多，降低血清淀粉酶及脂肪酶水平。活血清解湯可降低臨床急性胰腺炎患者血清炎性細(xì)胞因子水平，提高超氧化物歧化酶活性，清除氧自由基，改善癥狀，提高療效[25]。臨床研究[26]發(fā)現(xiàn)活血清解湯配合西醫(yī)常規(guī)療法治療急性胰腺炎，患者的排氣及通便時(shí)間、腹脹及腹痛緩解時(shí)間、體溫恢復(fù)正常及住院時(shí)間明顯優(yōu)于西醫(yī)常規(guī)療法。本中心前期研究[27]發(fā)現(xiàn)活血清解湯改善SAP患者血液流變學(xué)，控制D-二聚體的升高，維持血栓素A2及前列環(huán)素I2之間的平衡，起到治療SAP作用。因此，活血清解湯在急性胰腺炎及SAP中均發(fā)揮積極作用，可有效緩解炎癥反應(yīng)程度。而SAP易引發(fā)腸道屏障功能障礙，活血清解湯是否對(duì)腸道黏膜免疫屏障的具有保護(hù)作用及其中機(jī)制尚不清楚，有待深入研究。

巨噬細(xì)胞分M1型和M2型，腸巨噬細(xì)胞由血液中的單核細(xì)胞骨髓造血干細(xì)胞及胸腺內(nèi)早期T淋巴細(xì)胞分化而來(lái)，主要分布于腸黏膜下的固有層中，占人體巨噬細(xì)胞的絕大多數(shù)，參與炎癥反應(yīng)[28]。在健康腸道環(huán)境中，腸道巨噬細(xì)胞以M2型為主；而在炎癥期間，單核細(xì)胞被招募到腸道固有層并成為炎性巨噬細(xì)胞，分泌促炎癥細(xì)胞因子，推動(dòng)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出M1型[29]。M1型巨噬細(xì)胞的特征是分泌細(xì)胞因子的能力增強(qiáng)，可被TNF-α活化，活化后不僅能正反饋分泌促炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-1β及IL-6等殺傷感染性病原體，還能表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞一個(gè)重要的特征及標(biāo)識(shí)分子iNOS，產(chǎn)生NO，產(chǎn)生NO的巨噬細(xì)胞在炎癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，而NF-κB是其活化的重要轉(zhuǎn)錄因子[30-32]。M2型巨噬細(xì)胞有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，可表達(dá)抗炎細(xì)胞因子如IL-4和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGF-β）等，降低炎性細(xì)胞因子水平，從而下調(diào)M1型巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。同時(shí)M2型巨噬細(xì)胞能誘導(dǎo)產(chǎn)生Arg-1，使清道夫受體表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生NO和IL-12的能力下降，可將表達(dá)Arg-1及IL-4作為M2型巨噬細(xì)胞分化的證據(jù)，其中PPAR-γ是其活化的重要轉(zhuǎn)錄因子[29,31]。本研究建立的大鼠SAP模型提示，術(shù)后6 h的TNF-α表達(dá)水平明顯增高，而IL-4表達(dá)水平偏低；隨著SAP進(jìn)程延長(zhǎng)，術(shù)后12 h IL-4表達(dá)水平明顯增加。以上提示早期SAP可能由M1巨噬細(xì)胞表型占優(yōu)勢(shì)，后期M2型巨噬細(xì)胞抗炎發(fā)揮積極作用。但對(duì)SAP大鼠使用活血清解湯后，術(shù)后6 h的TNF-α表達(dá)水平較未使用組明顯降低，且IL-4表達(dá)水平升高，在術(shù)后12 h趨勢(shì)更加明顯，這提示活血清解湯可能促進(jìn)SAP大鼠腸黏膜巨噬細(xì)胞由M1型巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為M2型。

巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的表型具有可塑性，隨著微環(huán)境刺激的改變，進(jìn)而改變其生理特性，遵循不同的激活途徑；M1型巨噬細(xì)胞首先出現(xiàn)在炎癥發(fā)生早期，針對(duì)刺激釋放多種炎癥介質(zhì)，以推動(dòng)炎癥反應(yīng)；而過(guò)度過(guò)量的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體損傷加重，M2型巨噬細(xì)胞在炎癥后期釋放抗炎介質(zhì)，抑制炎癥反應(yīng)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。因此根據(jù)他們所接受的微環(huán)境刺激不同，巨噬細(xì)胞可遵循不同的激活途徑，在不同組織甚至同一組織中呈現(xiàn)的表型以及功能也具有差異性[28]。

為了進(jìn)一步探討腸巨噬細(xì)胞在炎癥中表型變化，本研究在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)?；悄懰徕c刺激腸巨噬細(xì)胞后，TNF-α、iNOS及NF-κB表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明?；悄懰徕c可介導(dǎo)腸巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)?；钛褰鉁尤肽c巨噬細(xì)胞后TNF-α、iNOS及NF-κB表達(dá)水平較單獨(dú)?；悄懰徕c刺激組明顯降低，而Arg-1、IL-4、TIPE2及PPAR-γ表達(dá)水平升高，這提示活血清解湯一定程度上能促進(jìn)大鼠腸黏膜巨噬細(xì)胞由M1型巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為M2型。

但筆者觀察到在單獨(dú)活血清解湯刺激這種趨勢(shì)相對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)不是很明顯，猜測(cè)原因如下：由于炎癥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)過(guò)程，除了巨噬細(xì)胞外還有其他多種免疫細(xì)胞參與，因此筆者體外的模擬實(shí)驗(yàn)相對(duì)來(lái)說(shuō)比較簡(jiǎn)單。由于條件所限，需要將來(lái)對(duì)活血清解湯在急性胰腺炎中的作用機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究。但結(jié)果也能一定程度上說(shuō)明活血清解湯可介導(dǎo)大鼠腸黏膜表型的轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)腸黏膜的免疫屏障功能，減輕大鼠SAP的炎癥反應(yīng)程度。這也為治療及預(yù)防SAP提供新的思路。

綜上所述，本研究結(jié)果表明活血清解湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)SAP大鼠中的小腸巨噬細(xì)胞，由M1型轉(zhuǎn)化成M2型，緩解炎癥反應(yīng)，這也為研究活血清解湯的作用機(jī)制提供新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。