仲成成，李銘旭，張功銘，胡偉，王仲

（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院 1.肝膽外科 2.病理科， 江蘇 連云港 222001）

胰腺癌是一種高度侵襲性的惡性腫瘤，其病死率幾乎與發(fā)病率相似[1-2]。胰腺癌早期癥狀不典型，許多患者確診時(shí)，已經(jīng)出現(xiàn)局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，不適合手術(shù)，導(dǎo)致5年生存率低于11%[3]。此外，胰腺癌具有獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境[4]，缺乏有效的靶向治療手段，使胰腺癌患者的預(yù)后較差。因此，尋找可靠的分子標(biāo)志物對(duì)胰腺癌早期診斷及治療均有重要意義。

膜聯(lián)蛋白A5（ANXA5）是鈣依賴(lài)磷脂結(jié)合蛋白家族的一員，通常存在于細(xì)胞質(zhì)中，它可以與鈣和磷脂結(jié)合，作為各種生理過(guò)程的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子[5]。參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥、腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥等[6-8]。已有研究[9]表明，ANXA5可能通過(guò)抑制RTK-Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路中的蛋白激酶C（PKC）活性參與癌變過(guò)程。在腎癌[10]、肝癌[11]中發(fā)揮促癌基因的作用，但在胃癌[12]、宮頸癌[13]中發(fā)揮抑癌基因的作用。目前ANXA5在胰腺癌中的具體作用機(jī)制尚不清楚。

本研究利用TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，分析ANXA5在胰腺癌中的表達(dá)情況，及其在胰腺癌中的預(yù)后意義，并通過(guò)基因集富集分析（gene sets enrichment analysis，GSEA）進(jìn)一步預(yù)測(cè)其在胰腺癌中的信號(hào)通路，從而研究ANXA5在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。并通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ANXA5在胰腺癌組織中的表達(dá)情況，分析其與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系，并探討其在胰腺癌中的預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集資料

下載并處理TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.portal.gdc.cancer.gov）中179例胰腺癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)及臨床病理資料；從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載并處理3個(gè)胰腺癌數(shù)據(jù)集，包括GSE16515（平臺(tái)為GPL570，由36個(gè)腫瘤樣本和16個(gè)正常樣本組成）、GSE21501（平臺(tái)為GPL4133，由102個(gè)腫瘤樣本組成）與GSE15471（平臺(tái)為GPL570，由39個(gè)腫瘤樣本和配對(duì)正常樣本組成）。其中TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)與GSE21501數(shù)據(jù)集具有患者完整臨床信息。

1.2 病例資料

選取采用的胰腺癌組織標(biāo)本為徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院2018年9月—2021年9月經(jīng)病理確診的49例胰腺癌患者的組織標(biāo)本?；颊吲R床數(shù)據(jù)特征見(jiàn)表1。胰腺癌臨床分期按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）第8版分期標(biāo)準(zhǔn)。所有入組患者術(shù)前均未接受任何針對(duì)腫瘤的治療，術(shù)后未進(jìn)行化療及靶向治療。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：KY20190924002），所有患者均簽署知情同意書(shū)。

表1 ANXA5表達(dá)與胰腺癌患者臨床特征的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relationship between ANXA5 expression and clinical characteristics of patients with pancreatic cancer [n (%)]

1.3 免疫組織化學(xué)檢查

手術(shù)切除的胰腺癌與癌旁組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定包埋在石蠟后切成4 μm厚的切片。將切片在二甲苯中脫石蠟并在梯度乙醇中再水合。用3%過(guò)氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，并用3%山羊血清阻斷非特異性結(jié)合。隨后，將ANXA5一抗 （Affinity Biosciences有限公司，P08498，1∶100稀釋?zhuān)┯诮M織切片上孵育，4 ℃下孵育過(guò)夜。將磷酸鹽緩沖鹽水孵育的切片設(shè)定為陰性對(duì)照。將切片與過(guò)氧化物酶綴合的二抗一起溫育。二氨基聯(lián)苯胺用作色原體，蘇木素復(fù)染后，在200倍顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 免疫組化評(píng)分

由2名與本研究無(wú)關(guān)的病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立評(píng)估免疫組化評(píng)分。免疫組化評(píng)分[14]由陽(yáng)性細(xì)胞比率和染色強(qiáng)度組成，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比率：＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將ANXA5表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞比率和染色強(qiáng)度相乘，陽(yáng)性細(xì)胞率與染色強(qiáng)度之積分為0～4分為ANXA5陰性表達(dá)，5～12分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用R 4.0.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存率曲線，采用Spearman相關(guān)分析基因間的相關(guān)性，0.1≤|r|≤1.0時(shí)定義為存在相關(guān)；對(duì)預(yù)后影響因素進(jìn)行單多因素Cox回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；使用GSEA4.1.0軟件進(jìn)行基因集富集分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ANXA5在胰腺癌中高表達(dá)

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析ANXA5在腫瘤組織和非腫瘤正常組織中的表達(dá)水平，在GSE15471、GSE16515與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，胰腺癌組織中的ANXA5表達(dá)量明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖1A-C）。通過(guò)免疫組化法檢測(cè)我院49例胰腺癌組織和癌旁組織中ANXA5的表達(dá)，胰腺癌組織較癌旁正常組織表達(dá)明顯增高（P＜0.001），與上述數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致（圖1D-F）。

圖1 ANXA5在胰腺癌組織與正常組織的表達(dá)情況 A：GSE15471；B：GSE16515；C：TCGA；D：49例樣本表達(dá)情況；E-F：免疫組化檢測(cè)ANXA5的表達(dá)Figure 1 Expressions of ANXA5 in pancreatic cancer tissues and normal tissues in GSE database and TCGA database A: GSE15471; B: GSE16515; C: TCGA; D: Expression of ANXA5 in the 49 samples; E-F: Immunohistochemical staining for ANXA5 expression

2.2 ANXA5表達(dá)與胰腺癌患者生存的關(guān)系

在有臨床信息的GSE21501和TCGA中，采用“survival”包繪制Kaplan-Meier生存率曲線，結(jié)果顯示（圖2），ANXA5的低表達(dá)與良好的預(yù)后明顯有關(guān)（均P＜0.05），并根據(jù)免疫組化評(píng)分，以最佳截?cái)嘀祵?9例胰腺癌患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，其中高表達(dá)組20例，低表達(dá)組29例，分析患者預(yù)后信息，ANXA5高表達(dá)患者的預(yù)后明顯差于低表達(dá)患者（P=0.008 2）。

圖2 ANXA5表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 A：GSE21501中Kaplan-Meier生存率曲線；B：TCGA中Kaplan-Meier生存率曲線；C：49例樣本的Kaplan-Meier生存率曲線Figure 2 Relationship between ANXA5 expression and prognosis A: Kaplan-Meier survival curve in GSE21501; B: Kaplan-Meier survival curve in TCGA; C: Kaplan-Meier survival curve of the 49 samples

2.3 胰腺癌預(yù)后影響因素

為分析ANXA5表達(dá)與臨床病理因素對(duì)于胰腺癌預(yù)后的關(guān)系，在TCGA、GSE21501與我院49例樣本中進(jìn)行單因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，ANXA5基因高表達(dá)是胰腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P=0.029），在我院49例樣本中顯示ANXA5表達(dá)（P=0.014）、臨床分期（P=0.036）及性別（P=0.043）與胰腺癌預(yù)后相關(guān)。多因素Cox回歸分析示在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，ANXA5基因高表達(dá)是胰腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P=0.03），在我院49例樣本中顯示ANXA5高表達(dá)（P=0.041）是胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。根據(jù)我院49例胰腺癌樣本ANXA5表達(dá)的免疫組化評(píng)分（計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)）進(jìn)一步分析其和臨床病理參數(shù)的關(guān)系，ANXA5的表達(dá)與患者臨床分期（P=0.000 94）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）有關(guān)（圖3）；根據(jù)ANXA5表達(dá)陽(yáng)性率（四格表χ2分析）提示ANXA5表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.001），而與性別、年齡、組織分化、臨床分期、神經(jīng)浸潤(rùn)無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表1）。

圖3 GSE21501與TCGA中單多因素Cox回歸分析及49例樣本中ANXA5表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 A：GSE21501中單多因素Cox回歸分析；B：TCGA中單多因素Cox回歸分析；C：49例樣本中單多因素Cox回歸分析；D-I：49例樣本中ANXA5表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Figure 3 Univariate and multivariate Cox regression analysis of TCGA and GSE21501 and the relationship between ANXA5 expression and clinicopathological parameters in 49 samples A: Univariate and multivariate Cox regression analysis in GSE21501; B: Univariate and multivariate Cox regression analysis in TCGA; C: Univariate and multivariate Cox regression analysis in the 49 samples; D-I: The relationship between ANXA5 expression and clinicopathologic parameters in the 49 samples

2.4 胰腺癌中ANXA5基因通路富集分析

為了解胰腺癌患者ANXA5基因通路富集情況，使用GSEA4.1.0軟件進(jìn)行基因集富集分析，結(jié)果顯示，在GSE21501數(shù)據(jù)集（P＜0.01）與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（P=0.04）均富集到TGF-β通路（圖4）。

圖4 GSEA富集分析中TGF-β通路情況 A：GSE21501；B：TCGAFigure 4 Enrichment analysis of the TGF-β pathway in GSEA A: GSE21501; B: TCGA

2.5 ANXA5基因與TGF-β通路及EMT的相關(guān)性

TGF-β通路促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制之一是誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），為了解ANXA5基因與TGF-β通路及EMT的關(guān)系，在GSE21501數(shù)據(jù)集與TCGA中選取TGF-β通路及EMT的相關(guān)基因，采用R軟件繪制相關(guān)性熱圖，結(jié)果顯示，ANXA5基因與TGF-β通路的TGFB1、TGFBR1、TGFBR2、SMAD4基因均正相關(guān)（結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），且在GSE21501數(shù)據(jù)集中，ANXA5基因與上皮標(biāo)志物E-cadherin（CDH1）呈負(fù)相關(guān)，與間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin（CDH2）、VIM基因呈正相關(guān)，由此可表明ANXA5基因與TGF-β通路及腫瘤EMT轉(zhuǎn)化有高度相關(guān)性（圖5）。

圖 5 ANXA5基因與TGF-β通路及EMT相關(guān)基因的相關(guān)性熱圖 A：GSE21501；B：TCGAFigure 5 Heat map of the relationship of the ANXA5 gene with the TGF-β pathway and EMT related genes A: GSE21501;B: TCGA

3 討 論

胰腺癌是消化道惡性程度最高的腫瘤，診斷主要依靠高分辨率超聲、內(nèi)鏡超聲、計(jì)算機(jī)斷層掃描或磁共振成像，除手術(shù)外，目前不能切除的胰腺癌主要以化療[15]為主，包括單藥吉西他濱，吉西他濱加納米顆粒白蛋白結(jié)合紫杉醇，和FOLFIRINOX（葉酸，5-氟尿嘧啶，伊立替康，奧沙利鉑），盡管如此，胰腺癌患者的預(yù)后仍然很差[16-17]。因此，挖掘新的生物標(biāo)志物并研究胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制是改善胰腺癌患者生存預(yù)后的重要措施。

ANXA5基因位于染色體4q28-q32，為1.6 kb長(zhǎng)，分子量為35.8 kDa，包括12個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，參與多種生理病理過(guò)程[18]。近期研究[19]發(fā)現(xiàn)在接受常規(guī)化療的兒童急性髓系白血病患者中，ANXA5的高表達(dá)與不良結(jié)局相關(guān)。另外研究[12]發(fā)現(xiàn)相較于癌旁正常組織，內(nèi)源性ANXA5在胃癌組織中表達(dá)顯著降低，但是無(wú)法解釋的是ANXA5高表達(dá)的胃癌患者的總生存率顯著低于ANXA5低表達(dá)的胃癌患者，ANXA5基因敲除可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)抑制胃癌細(xì)胞凋亡。目前在胰腺癌中尚缺乏針對(duì)ANXA5基因的研究，本研究基于生物信息學(xué)技術(shù)，在GEO數(shù)據(jù)集及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析了ANXA5在胰腺癌中的表達(dá)情況，并通過(guò)Kaplan-Meier生存率曲線評(píng)估其過(guò)表達(dá)對(duì)胰腺癌預(yù)后的價(jià)值。分析結(jié)果表明，ANXA5在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，且高表達(dá)ANXA5基因的胰腺癌患者的預(yù)后更差。進(jìn)一步單多因素的Cox回歸分析表明，ANXA5高表達(dá)可以作為判斷胰腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素。在49例胰腺癌患者組織中ANXA5的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且此基因高表達(dá)預(yù)示著較差的預(yù)后，與上述數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致。并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)要明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，表明了ANXA5與胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示ANXA5的高表達(dá)可能與胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)。本研究結(jié)果與ANXA5在胃癌組織的研究說(shuō)明ANXA5在不同癌癥中既可以發(fā)揮抑癌基因作用，又具有促癌基因作用。

在小鼠肝癌研究[11]發(fā)現(xiàn)ANXA5可以通過(guò)ERK2/c-Jun/pc-Jun（Ser73）和ERK2/E-cadherin途徑介導(dǎo)小鼠肝癌Hca-F細(xì)胞的體外惡性行為，證明ANXA5是肝癌Hca-F細(xì)胞系淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的重要分子和肝癌的潛在治療靶標(biāo)。在前列腺癌細(xì)胞中，ANXA5通過(guò)抑制NF-κB p65磷酸化來(lái)抑制COX-2的表達(dá)，ANXA5可能在細(xì)胞對(duì)促炎刺激的炎癥反應(yīng)中具有重要的保護(hù)作用，因此，將ANXA5的抗炎作用應(yīng)用到前列腺癌治療中，可以達(dá)到抑制腫瘤發(fā)展和改善耐藥的效果[20]。然而，目前尚不清楚ANXA5在胰腺癌組織高表達(dá)的具體作用機(jī)制。GSEA基因集富集分析顯示，在GSE21501數(shù)據(jù)集與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)均富集到TGF-β通路，提示ANXA5基因可能通過(guò)TGF-β通路在胰腺癌中發(fā)生作用。

TGF-β信號(hào)通路參與到許多疾病的發(fā)病機(jī)制，如結(jié)締組織疾病、纖維化和癌癥[21]，參與了肝癌[22]、肺癌[23]、胃癌[24]等腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。在小鼠模型中，通過(guò)抑制膽固醇途徑可誘導(dǎo)TGF-β信號(hào)通路，從而促進(jìn)胰腺癌基層分化[25]。所以檢測(cè)胰腺癌中TGF-β信號(hào)通路活性具有重要作用。TGF-β信號(hào)通路活性檢測(cè)主要包括TGFB1、TGF-β受體（TGFBR1、TGFBR2）及SMAD4基因[26-28]。有證據(jù)[29]顯示，TGF-β通路促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制之一是誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。EMT的標(biāo)志是E-cadherin的缺失和Ncadherin、vimentin、slug、snail等的上調(diào)，這些對(duì)實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)和侵襲特性至關(guān)重要，并允許細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)遷移并在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移[30-31]。本研究中，通過(guò)繪制ANXA5基因與TGF-β通路相關(guān)基因及EMT標(biāo)志物的相關(guān)性熱圖，結(jié)果顯示ANXA5基因與胰腺癌TGF-β通路相關(guān)基因及腫瘤EMT標(biāo)志物高度相關(guān)，表明ANXA5基因可能通過(guò)TGF-β通路及誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，高表達(dá)ANXA5可以作為判斷胰腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，其機(jī)制可能是通過(guò)TGF-β通路促進(jìn)胰腺癌EMT轉(zhuǎn)化，有望成為胰腺癌診治的新靶點(diǎn)，但本研究關(guān)于ANXA5在胰腺癌中的作用機(jī)制僅為生物信息學(xué)分析，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。