張?zhí)煳?燕愛飛 楊 超 程 艷 賀志雄* 譚支良

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所公共技術(shù)中心，長沙410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

反芻動物小腸內(nèi)過瘤胃營養(yǎng)物質(zhì)的消化受到胰腺外分泌功能的限制[1]。胰腺淀粉酶分泌不足可導(dǎo)致40%的過瘤胃淀粉消化不完全[2]，表現(xiàn)出胰腺外分泌功能不足。開展胰腺腺泡細胞分離培養(yǎng)工作對于進一步從細胞分泌、配體結(jié)合、底物攝取、蛋白質(zhì)合成或第二代信使等角度解析反芻動物胰腺外分泌功能不足機制，并建立可能的營養(yǎng)調(diào)控策略具有重要意義。

在細胞水平上對胰腺外分泌功能的探索始于20世紀70年代[3]。并已逐步建立了各類動物的胰腺腺泡細胞分離方法，包括人、豬、牛和鼠類等[4-7]。然而，目前尚未見山羊胰腺腺泡細胞的原代細胞分離和培養(yǎng)方法相關(guān)報道。且在已有的培養(yǎng)方法中，消化各動物胰腺腺泡細胞所使用的消化酶和消化時間各有不同，鑒定工作也鮮有報道。

膠原酶是在細胞解離工作中被廣泛應(yīng)用的消化酶，本試驗主要評估不同濃度膠原酶Ⅳ和消化時間對山羊胰腺腺泡細胞的解離效果，優(yōu)化山羊胰腺腺泡細胞原代培養(yǎng)方法，以期快速分離出足量且活性良好的胰腺腺泡細胞并穩(wěn)定培養(yǎng)，為反芻動物胰腺外分泌功能的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

主要儀器包括：超凈工作臺(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)、恒溫搖床(KYC-100C，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(3111，Thermo Fisher公司，美國)、全自動細胞計數(shù)儀(Countess?Ⅱ FL，Thermo Fisher公司，美國)、倒置熒光顯微鏡(DMI3000B，Leica公司，德國)、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM880，Zesiss公司，德國)、共聚焦培養(yǎng)皿(BS-15-GJM，北京蘭杰柯科技有限公司)等。

主要試劑包括：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、無鈣鎂磷酸緩沖液(DPBS)、磷酸緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶消化液，均購自美國Gibco公司；膠原酶Ⅳ、重組人胰島素、表皮生長因子(EGF)，均購自德國Biofroxx公司；青鏈霉素混合液、慶大霉素、兩性霉素b、均購自北京索萊寶科技有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，購自北京凱詩源生物科技有限公司；兔抗羧肽酶A1(CPA1)(一抗)，購自美國Proteintech公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(二抗)，購自上海翊圣生物科技有限公司；通用固定液，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；牛血清蛋白(BSA)，購自北京伊塔生物科技有限公司；TritonX-100，購自美國Sigma公司；抗熒光淬滅劑[含染核試劑4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)]，購自江蘇碧云天生物研究所。

具體試劑配制如下：1)清洗液配制。向PBS(500 mL)中加入100×青鏈霉素混合液，使青鏈霉素混合液稀釋成10×，文中稱10×清洗液，將配制好的清洗液分裝成實驗室外用和內(nèi)用2部分，外用部分用于屠宰取樣時清洗胰腺組織，內(nèi)用部分用于消化解離時對胰腺組織反復(fù)清洗。試驗前配制，用前先預(yù)冷。2)轉(zhuǎn)移液配制。向DMEM/F12培養(yǎng)基(50 mL)中加入100×青鏈霉素混合液，使青鏈霉素混合液稀釋成10×，文中稱10×轉(zhuǎn)移液。取樣完成后將胰腺組織置于轉(zhuǎn)移液中運送至細胞培養(yǎng)室，轉(zhuǎn)移液起保護作用。試驗前配制，使用時全程置于冰上。3)培養(yǎng)基配制。用DMEM/F12培養(yǎng)基(500 mL)配制，在試驗過程中需用青鏈霉素混合液濃度不同的2種培養(yǎng)基，原代培養(yǎng)需將青鏈霉素混合液稀釋成10×，傳代培養(yǎng)稀釋成2×。此外還包含10%的FBS、10 μg/mL胰島素、10 ng/mL EGF、2.5 μg/mL慶大霉素、2.5 μg/mL兩性霉素b。試驗前配制。4)消化液配制。運用DMEM/F12培養(yǎng)基將膠原酶Ⅳ配制成1.0和0.5 mg/mL 2個濃度的消化液，且都添加終濃度為0.001 mol/mL的EGTA。試驗前配制，使用前37 ℃預(yù)熱。5)抗體稀釋。根據(jù)說明書用2%的BSA稀釋。

1.2 試驗動物

本研究的試驗過程根據(jù)中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物倫理委員會的指導(dǎo)進行。選取3月齡且健康狀況良好的雌性湘東黑山羊進行屠宰，屠宰前禁食4 h以上。放血完畢后及時解剖暴露胰腺，在用預(yù)冷的10×清洗液不斷沖洗的同時，迅速采取胰腺組織。適當(dāng)剔除血管及筋膜，反復(fù)用10×清洗液清洗4～5遍后放入預(yù)先配制的10×轉(zhuǎn)移液中，置于冰上及時帶回實驗室。

1.3 試驗方法

1.3.1 消化酶的消化效率

在正式進行山羊胰腺腺泡細胞分離培養(yǎng)前，先探索適宜的消化時間、消化酶濃度及消化酶種類，以尋求更高的消化效率。運用1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ作為山羊胰腺腺泡細胞消化解離的消化液，尋找在山羊胰腺組織上適宜的消化時間，設(shè)置15、20、25、30和35 min連續(xù)5個消化時間梯度；在得到適宜的消化時間后，進行1.0和0.5 mg/mL 2個濃度膠原酶Ⅳ消化液消化解離20 min后的比較；在驗證過膠原酶Ⅳ的適宜濃度及消化時間后，用0.25%胰蛋白酶作為消化液來對比1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ。消化解離結(jié)束后進行總細胞計數(shù)及細胞活率檢測。

具體操作步驟如下：1)預(yù)先用DMEM/F12配制50 mL濃度為1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ，配制10 mL濃度為0.5 mg/mL膠原酶Ⅳ及準備10 mL 0.25%胰蛋白酶。為得到更多的單細胞及減少細胞碎片，在3種消化液中添加EGTA，終濃度稀釋至0.001 mol/mL。2)將取回的胰腺組織帶回?zé)o菌細胞培養(yǎng)室，將胰腺組織從轉(zhuǎn)移液中出。由于胰腺組織樣品量有限，將采集的胰腺組織切分成1 g重量小塊。3)將切分稱重完的胰腺組織塊置于超凈工作臺上。在10 cm培養(yǎng)皿中加適量10×清洗液，將組織塊浸泡于其中，仔細剔除胰腺組織上多余的筋膜及脂肪組織。之后用清洗液重復(fù)清洗2～3遍，洗完后將每份胰腺組織剪切成1～3 mm3的小塊，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中再用清洗液清洗3～5遍。1 000 r/min離心2 min，去除多余液體。4)取5份清洗完的并剪碎的組織塊各添加10 mL 1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ消化液，用錫箔紙包裹離心管避光置于37 ℃、80 r/min的恒溫搖床上消化。設(shè)置15、20、25、30和35 min消化時間梯度。5)每個消化時間節(jié)點結(jié)束后迅速加入5 mL含10% FBS的DMEM/F12終止消化，反復(fù)吹打之后1 000 r/min離心5 min棄上清。6)再添加5 mL含F(xiàn)BS的DMEM/F12混勻沉淀，用70 μm的細胞篩過濾收集細胞懸液，取每個離心管收集到的少量懸液在顯微鏡下觀察消化狀態(tài)，每個離心管取3個平行樣用全自動細胞計數(shù)儀進行細胞活率檢測和細胞計數(shù)。7)再取2份清洗完且剪碎的組織塊置于15 mL無菌無酶離心管中，分別加入10 mL濃度為0.5 mg/mL膠原酶Ⅳ和10 mL 0.25%胰蛋白酶。用錫箔紙包裹避光置于37 ℃、80 r/min的恒溫搖床上消化20 min。之后重復(fù)步驟5)和6)。

1.3.2 原代山羊胰腺腺泡細胞分離

具體操作步驟如下：1)將采集的胰腺組織塊通過轉(zhuǎn)移液運回細胞培養(yǎng)實驗室。在無菌超凈工作臺上將胰腺組織取出，置于盛有清洗液的10 cm無菌培養(yǎng)皿中仔細剔除胰腺組織上多余的筋膜及脂肪組織。2)再用DPBS清洗3～5遍后將胰腺組織剪切成1～3 mm3的小塊，使其能夠被移液槍吸取。將剪好的胰腺組織塊轉(zhuǎn)移到15 mL無菌無酶離心管中，用含10×青鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗5～6遍，最后1 000 r/min離心5 min棄上清。3)添加上述試驗驗證出的膠原酶Ⅳ 10 mL，用錫箔紙裹上離心管避光置于37 ℃、80 r/min的恒溫搖床上消化20 min。4)消化結(jié)束后迅速加入5 mL含10% FBS的DMEM/F12終止消化，之后1 000 r/min離心5 min棄上清。5)添加5 mL含10% FBS、10×青鏈霉素混合液、2.5 μg/mL慶大霉素、2.5 μg/mL兩性霉素、10 μg/mL胰島素、10 ng/mL EGF的DMEM/F12混勻沉淀，用70 μm的細胞篩過濾收集細胞懸液。6)600×g、5 min離心，去上清，重懸接種到培養(yǎng)皿，調(diào)整接種密度為3×105個細胞/cm2，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 d后觀察貼壁及污染情況，若無問題則更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每天換1次液，整個過程中盡量避免劇烈晃動。

1.3.3 胰腺腺泡細胞的純化及傳代培養(yǎng)

在原代胰腺腺泡細胞傳第1代時進行細胞純化工作。采取差時消化、差速貼壁及細胞刮取等方法來對胰腺腺泡細胞進行純化。

差時消化：利用細胞之間對消化酶的敏感性存在差異以及胰腺腺泡細胞的自身特性對胰腺腺泡細胞進行純化。具體操作步驟如下：1)去除培養(yǎng)基后，靜置2 min，用加2 mL PBS輕輕沖洗，會有一定量的細胞脫落。2)迅速收集脫落的細胞到15 mL無菌無酶離心管中，加2 mL含10% FBS的DMEM/F12，輕輕吹打后1 000 r/min離心5 min棄上清，用1 mL培養(yǎng)基重懸細胞后接種。3)向步驟1)培養(yǎng)皿清洗過的細胞中加入1.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，搖晃鋪平后靜置2 min，不用放進培養(yǎng)箱。加3 mL含10% FBS的DMEM/F12終止消化，輕輕沖洗，將脫落的細胞收集到無菌離心管中輕輕吹打幾下，1 000 r/min離心5 min棄上清，用1 mL培養(yǎng)基重懸細胞后接種。4)向未脫落的細胞中加1.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中3 min；當(dāng)細胞完全消化脫落時加3 mL含10% FBS的DMEM/F12終止消化。1 000 r/min離心5 min棄上清，用1 mL培養(yǎng)基重懸細胞后接種。

差速貼壁：根據(jù)各細胞間貼壁的時間存在差異來純化得到胰腺腺泡細胞。具體操作步驟如下：1)結(jié)合上述差時消化接種的細胞，在接種后不同時間段觀察貼壁情況。2)若在各時間點觀察到有一定數(shù)量的貼壁細胞，則將懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿繼續(xù)貼壁，原培養(yǎng)皿加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞刮?。航?jīng)過差時消化和差速貼壁處理后，會有形態(tài)比較均一的細胞成片生長。將形態(tài)均一、成簇生長的細胞用細胞刮子刮落，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)?；蛘邔⒊螒B(tài)均一、成簇生長以外的細胞刮去，沖洗過后繼續(xù)培養(yǎng)。

經(jīng)過以上處理得到形態(tài)均一、純度較高的胰腺腺泡細胞后進行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)用含10% FBS、2×青鏈霉素混合液、2.5 μg/mL慶大霉素，2.5 μg/mL兩性霉素、10 μg/mL胰島素、10 ng/mL EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)。同時進行胰腺腺泡細胞鑒定工作。

1.3.4 胰腺腺泡細胞的鑒定

利用免疫熒光技術(shù)對所培養(yǎng)的胰腺腺泡細進行鑒定。具體操作步驟如下：1)將純化后的胰腺腺泡細胞接種到共聚焦小皿置于37 ℃、5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2)當(dāng)細胞貼壁生長至70%以上時棄培養(yǎng)基，用1～2 mL PBS浸洗3次，每次3 min。3)添加1～2 mL常溫的4%多聚甲醛后將培養(yǎng)皿置于4 ℃固定細胞30 min，固定結(jié)束后吸出多聚甲醛，緩慢加入PBS浸洗3次，每次5 min。4)配制0.2% TritonX-100(PBS配制)加1 mL至培養(yǎng)皿，室溫下通透20 min。吸出0.2% TritonX-100，再用PBS浸洗3次，每次5 min。5)加入1 mL 2% FBS，室溫下封閉1 h。封閉結(jié)束后吸出封閉液，切勿再次浸洗，向培養(yǎng)皿加入足量的一抗(CPA1稀釋比例根據(jù)說明書，用2% BSA稀釋)，置于4 ℃過夜。6)次日取出培養(yǎng)皿，每孔加入1～2 mL PBS，浸洗3次，每次5 min，吸出PBS，加入足量的熒光二抗(FITC標記山羊抗兔IgG稀釋比例根據(jù)說明書，用2% BSA稀釋)，室溫下孵育1 h。7)加入2 mL PBS，浸洗3次，每次5 min，吸出PBS，加入抗熒光淬滅劑，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

細胞計數(shù)及細胞活率檢測數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016進行初步整理后，采用SPSS 25.0軟件的獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。試驗結(jié)果以平均值和均值標準誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 消化酶消化效率對比

圖1-a顯示出各消化時間顯微鏡下觀察得到的消化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞團的數(shù)量并不多，存在更多數(shù)量的單個細胞。隨消化時間的增長，解離得到的細胞密度逐漸增加，但組織碎片也隨之增多。圖1-b顯示隨消化時間的逐步延長，消化得到的總細胞數(shù)從1.407×106個/mL逐步增長到5.262×106個/mL。圖1-c顯示細胞活率在消化20 min時達到91%，消化20 min后細胞活率逐漸降低，消化時間為35 min時細胞活率低至74%，為5個消化時間節(jié)點最低值。

圖2顯示了1.0和0.5 mg/mL 2個濃度膠原酶Ⅳ消化胰腺組織20 min后的比較結(jié)果。顯微鏡下觀察消化狀態(tài)見圖2-a，結(jié)果顯示0.5 mg/mL的膠原酶Ⅳ存在著比單個細胞數(shù)量還多的細胞碎片，且單個細胞數(shù)量也明顯沒有1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ充足。圖2-b顯示0.5 mg/mL的膠原酶Ⅳ消化得到的總細胞數(shù)為8.032×105個/mL，遠低于1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ消化得到的總細胞數(shù)(2.275×106個/mL)。同時圖2-c顯示0.5 mg/mL膠原酶Ⅳ消化的細胞活率(83%)也低于1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ消化的細胞活率(91%)。

a：消化狀態(tài)(100×)；b：總細胞數(shù)；c：細胞活率。

圖3-a顯示胰蛋白酶雖有較少的細胞碎片，但消化得到的總細胞數(shù)及細胞活率均低于膠原酶Ⅳ。圖3-b顯示0.25%胰蛋白酶解離胰腺組織20 min得到的總細胞數(shù)低于1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ消化得到的總細胞數(shù)。圖3-c顯示胰蛋白酶消化得到的細胞活率僅為80%，低于膠原酶Ⅳ消化得到的細胞活率(91%)。

2.2 山羊胰腺腺泡細胞的純化及傳代培養(yǎng)

在前述優(yōu)化的消化酶濃度和消化時間基礎(chǔ)上，我們進一步開展山羊胰腺腺泡細胞的純化和傳代培養(yǎng)。在1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ消化20 min后，用70 μm的細胞篩過濾收集細胞懸液，600 r/min多次離心后調(diào)整細胞懸液為3×105個細胞/cm2進行接種。接種后在顯微鏡下觀察，圖4-a顯示細胞形態(tài)不均一，以成團成簇生長的細胞為主，雜細胞較多。因此我們開展了細胞純化工作。

a：消化狀態(tài)(100×)；b：總細胞數(shù)；c：細胞活率。

a：消化狀態(tài)(100×)；b：總細胞數(shù)；c：細胞活率。

pancreatic acinar cells

當(dāng)原代細胞貼壁達90%以上后，我們通過差時消化、差速貼壁及細胞刮取等方法將原代細胞純化后在進行傳代培養(yǎng)。圖4-b顯示在純化后，各時間節(jié)點的細胞形態(tài)明顯更加均一，主要為成簇生長呈“鵝卵石”狀的細胞。圖4-c顯示傳代培養(yǎng)至第5代依然保持形態(tài)。

a：純化前各時間點山羊胰腺腺泡細胞；b：純化后各時間點山羊胰腺腺泡細胞；c：純化后第5代山羊胰腺腺泡細胞。

2.3 山羊胰腺腺泡細胞鑒定

通過免疫熒光技術(shù)利用抗原抗體反應(yīng)對山羊胰腺腺泡細胞進行鑒定。CPA1是胰腺腺泡細胞特異性表達的蛋白，因此我們選取CPA1作為目標蛋白。運用CPA1抗體作為一抗識別腺泡細胞中的CPA1，再用帶熒光的二抗與一抗結(jié)合來顯示CPA1蛋白。當(dāng)目標蛋白、一抗和二抗結(jié)合在一起，在激光共聚焦顯微鏡下激發(fā)熒光才能顯色呈陽性。若未顯色則說明目標蛋白與抗體沒有發(fā)生反應(yīng)。據(jù)此，首先設(shè)置了不加一抗僅用二抗孵育的對照組(圖5-a)，結(jié)果沒有激發(fā)綠色熒光，僅顯示經(jīng)染核試劑DAPI顯色的藍色細胞核部分，結(jié)果未顯示陽性。當(dāng)運用CPA1抗體對第1代細胞進行孵育，再與二抗結(jié)合時，細胞中的CPA1與CPA1抗體成功反應(yīng)，激發(fā)綠色熒光，結(jié)果顯示陽性(圖5-b)。之后又對第5代細胞進性鑒定，同樣顯示出陽性(圖5-c)。由此成功鑒定出本試驗分離并純化培養(yǎng)的細胞為山羊胰腺腺泡細胞。

a：空白對照(100×)；b：第1代細胞(200×)；c：第5代細胞(100×)

3 討 論

胰腺在各物種之間，以及各物種不同年齡階段的生長發(fā)育、功能機理都有著極大地差異。因此現(xiàn)今依舊沒有一個在各物種上能夠穩(wěn)定分離胰腺腺泡細胞原代培養(yǎng)的方法。當(dāng)前在已經(jīng)原代培養(yǎng)成功的胰腺腺泡上進行的研究也還存在著諸多疑問。例如，不同物種胰腺腺泡細胞上的膽囊收縮素(CCK)受體類型及分布存在差異，甚至于不具有CCK受體，且隨著生長發(fā)育也有一定變化，然而，反芻動物隨生長發(fā)育胰腺腺泡細胞上CCK受體圖譜未見報道[8]；胰腺腺泡細胞的自噬機制很大程度上影響著胰腺外分泌功能，然而，自噬的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制并未研究透徹[9]；胰腺內(nèi)分泌對胰腺外分泌影響的全部意義也尚不清楚[10]；腺泡細胞內(nèi)消化酶原提前激活的調(diào)控機制尚未得到統(tǒng)一解答[11]；原代培養(yǎng)胰腺腺泡不能穩(wěn)定傳代等存在一系列疑問[7]；原代培養(yǎng)的胰腺腺泡細胞進行細胞鑒定也鮮有報道。因此，山羊胰腺腺泡細胞分離培養(yǎng)方法的建立有助于對胰腺外分泌功能及其他生理機制在細胞水平上的研究。

在細胞分離的過程中能否得到數(shù)量足夠且形態(tài)完整活性良好的腺泡細胞，取決于消化酶的類型的使用。膠原酶和胰蛋白酶在一般消化解離細胞的工作中較為常見。與胰蛋白酶相比，膠原酶具有溫和的剪切力，膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，能夠更好地將組織塊解離成單個細胞[12]。本試驗還在消化液中運用了EGTA(一種鈣離子螯合劑，能夠破壞細胞間的連接而不影響細胞的完整性)，這進一步使得分離得到的細胞為單個細胞[13]。

自1972年胰腺腺泡細胞運用膠原酶被首次分離成功后，由此在報道的腺泡細胞解離工作中膠原酶被更為廣泛的使用[14]。但山羊的胰腺組織在消化解離的過程中可能與其他物種對消化液的要求有差異，因此膠原酶的消化時間及濃度需要驗證，確定適宜的消化時間及濃度，以期得到良好的山羊胰腺腺泡細胞。在人胰腺腺泡細胞的分離試驗中，研究人員運用0.8 mg/mL的膠原酶P消化人胰腺組織，但并沒有描述清楚具體的消化時間[4]。在小鼠和豬的胰腺腺泡細胞分離工作中，分別運用了2 mg/mL膠原酶ⅠA消化30 min和2 mg/mL膠原酶Ⅱ消化40 min得到胰腺腺泡細胞[5-6]。Jayaveni等[7]運用1 mg/mL膠原酶Ⅲ將剪碎的牛胰腺組織消化15 min或更長時間進行牛胰腺腺泡細胞的分離培養(yǎng)。在上述試驗中使用了不同類型的膠原酶，消化時間也各有差異，并且均沒有介紹消化后的總細胞數(shù)和細胞活率等消化效率指標。因此在本試驗中各指標需要進一步驗證，運用1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ作為消化液濃度，設(shè)置5個消化時間節(jié)點尋求適宜消化時間。由本試驗結(jié)果可以看出，得到的總細胞數(shù)隨著消化時間的延長逐漸增多。細胞活率在15 min時低于20 min，造成這樣的原因可是是由于在消化前對胰腺組織進行機械剪切，造成組織塊表面較多的損傷細胞。而20 min進一步消化出更多的未損傷細胞，所以20 min細胞活率高于15 min。而隨著消化時間的延長細胞活率逐漸降低，這應(yīng)該是消化過度造成的。因此選取總細胞數(shù)相對適宜、細胞活率較高的20 min進行后一步的試驗，因為較高的細胞活率可避免接種后的污染風(fēng)險。此外，在后期的試驗中希望在較短的培養(yǎng)時間能得到足量的第1代貼壁細胞，因此需尤其注重得到的細胞具有較高活力，使解離得到的細胞具有較高的貼壁效率。

在驗證適宜消化時間的過程中發(fā)現(xiàn)有細胞碎片的存在，因此嘗試將消化液濃度降低，將1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ降低到0.5 mg/mL，在消化20 min的情況下，結(jié)果顯示細胞碎片確實少了許多，但單個細胞數(shù)量及細胞活率并不理想。在其他胰腺腺泡細胞的原代培養(yǎng)工作中，研究人員們同樣也運用了1.0 mg/mL膠原酶，但膠原酶的類型不同[7]。由于胰腺自身的自噬、分泌消化酶等特異性，存在胰腺組織壞死及細胞損傷的情況[15]，因此本試驗并未嘗試用低濃度的消化酶去延長消化時間，以得到更多的單個細胞。另外，胰腺腺泡細胞的自我損傷也是細胞分離難度較高、細胞生長不穩(wěn)定的主要原因[11]，因此消化酶濃度和消化時間的把控極為重要。

在各種細胞培養(yǎng)的工作中，0.25%胰蛋白酶常作為原代細胞解離的消化液來使用，但在胰腺組織上的運用較為少見，Guo等[16]運用胰蛋白酶冷消化法解離犢牛胰腺腺泡細胞，但其消化時間相對較長。在與1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ對比的試驗中我們發(fā)現(xiàn)，0.25%胰蛋白酶在同等條件下消化效率并不如膠原酶Ⅳ，雖說在顯微鏡下觀察后發(fā)現(xiàn)0.25%胰蛋白酶消化得到的細胞碎片相對較少。但細胞碎片的問題經(jīng)過多次摸索發(fā)現(xiàn)，在600 r/min離心5 min，重復(fù)2次可以有效清除細胞碎片的存在。

胰腺腺泡細胞雖然在胰腺組織中占比極高，但是在原代培養(yǎng)的過程中不免會分離出胰腺中的其他細胞，因此在培養(yǎng)過程中對分離的腺泡細胞進行了細胞純化工作。分離的原代細胞主要依靠流式細胞術(shù)、差時消化、差速貼壁及細胞刮取等方法進行細胞純化。但由于物種的原因，山羊胰腺腺泡細胞進行基因編輯存在極高的難度，另外就是抗體的缺乏，導(dǎo)致在工作中難以運用流式細胞術(shù)來純化分離得到的山羊胰腺腺泡細胞。因此本試驗運用了差時消化、差時貼壁、細胞刮取等方法相結(jié)合來對腺泡細胞進行純化工作。這些手段相結(jié)合在保證成本的前提下，能夠得到較為純的細胞。雖說這3種方法主要依靠細胞形態(tài)來判斷純化得到的細胞，但本試驗在之后進行了細胞的鑒定工作。由此也可驗證純化細胞工作的可行性。

鑒于胰腺腺泡細胞分泌消化酶的特殊性，在之前各物種培養(yǎng)原代腺泡細胞時都討論了細胞存活時限[4-7]。早先原代培養(yǎng)的胰腺腺泡細胞存活時間比較短，隨著消化酶、消化時間和培養(yǎng)基等影響因素的不斷優(yōu)化，目前胰腺腺泡細胞的培養(yǎng)時間大概在2周左右。但體外培養(yǎng)細胞所需的條件肯定是存在缺陷的，因此原代細胞應(yīng)該總是處于一個應(yīng)激的狀態(tài)。近來也有報道，胰腺腺泡細胞極易化生為胰腺導(dǎo)管細胞[17]，如果長時間培養(yǎng)可能會導(dǎo)致這樣的情況發(fā)生。因此在本試驗中，我們更期望得到與原組織更為接近的細胞。所以在細胞量足夠的情況下更希望得到第1及第2代細胞。為保證細胞的活性，本試驗在培養(yǎng)基中添加了EGF，同為防止腺泡細胞自身分泌消化酶的影響，在培養(yǎng)基中添加了10%的特級FBS。在這些條件的影響下，保證了本試驗中胰腺腺泡細胞在第1代及第2代有了良好的完整性及活性。

在胰腺腺泡細胞分離成功后，由于考慮到胰腺腺泡細胞自身分泌胰蛋白酶可能造成其不容易貼壁，因此擔(dān)心分離培養(yǎng)的細胞是否是預(yù)期得到的胰腺腺泡細胞。盡管胰腺腺泡細胞的分離培養(yǎng)已有過一些報道，但鑒定工作并不多見。鑒于原代培養(yǎng)的山羊胰腺腺泡細胞分離培養(yǎng)及鑒定工作鮮有報道，另外也為了驗證純化工作的可行性，因此展開了山羊胰腺腺泡細胞的鑒定工作。一開始試驗效仿Jayaveni等[7]運用α-淀粉酶抗體來進行鑒定工作，但經(jīng)過多次試驗及調(diào)整并未顯示陽性，分析可能是物種的原因造成的。因此決定選用其他抗體進行鑒定。CPA1是一種在胰腺腺泡細胞中產(chǎn)生的鋅金屬蛋白酶，在飲食蛋白C端支鏈和芳香族氨基酸的裂解過程中發(fā)揮作用，最早于1929年從牛胰腺提取物中鑒定出該酶[18]。在醫(yī)學(xué)上，CPA1被確定為胰腺腺泡細胞癌的標志物，但在運用胰腺組織做免疫組化時，正常胰腺組織中的腺泡細胞也能被CPA1抗體染色呈陽性，且相較于胰蛋白酶等其他標志物具有更高的靈敏度[19-20]。受此啟發(fā)，本試驗運用CPA1抗體來進行山羊胰腺腺泡細胞的鑒定工作，這也是CPA1抗體首次運用于原代培養(yǎng)的胰腺腺泡細胞鑒定工作中。試驗結(jié)果驗證了胰腺腺泡細胞鑒定的可行性。

4 結(jié) 論

湘東黑山羊胰腺組織經(jīng)1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ消化20 min，得到2.275×106個/mL總細胞數(shù)及91%的細胞活率，相同條件下消化效率優(yōu)于0.5 mg/mL膠原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶。采用差時消化、差速貼壁和細胞刮取等方法純化原代細胞，得到活性良好且形態(tài)均一呈“鵝卵石”狀的山羊胰腺腺泡細胞。純化后的山羊胰腺腺泡細胞能夠穩(wěn)定傳5代以上，且形態(tài)不發(fā)生改變。通過兔抗CPA1作為一抗對第1代及第5代山羊胰腺腺泡細胞進行鑒定，結(jié)果顯示陽性。綜上所述，本試驗方法能夠在短時間內(nèi)成功分離并培養(yǎng)山羊胰腺腺泡細胞。