龔莉焰，李雙陽，楊思進(jìn)，白 雪*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一類血管慢性炎癥性疾病[1]，主要以他汀類藥物治療為主，長期服用存在肝腎損害風(fēng)險。而中藥毒副作用小，能整體調(diào)控患者臟腑功能，減輕臨床癥狀，具有良好的研究前景。

AS尚無確切的中醫(yī)病名，按照其發(fā)生部位及臨床表現(xiàn)，可納入“胸痹”、“中風(fēng)”等范疇。《醫(yī)林改錯》言：“治病之要，在明白氣血，……，所傷者無非氣血”，提倡的補(bǔ)氣活血化瘀法廣泛用于胸痹、中風(fēng)的治療[2,3]。基于此理論研制的蛭龍活血通瘀膠囊對AS、缺血性腦卒中、冠心病等疾病均有不錯療效[4-6]，但具體作用機(jī)制尚不清楚，本文擬用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討蛭龍活血通瘀膠囊治療AS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物主要活性成分篩選

利用中藥藥理數(shù)據(jù)庫TCMSP（https://tcmspw.com/）及相關(guān)文獻(xiàn)檢索蛭龍活血通瘀膠囊中大血藤、黃芪、人參、桂枝的主要活性成分（篩選標(biāo)準(zhǔn)：OB≥30%，DL≥0.18）。通過TCMID數(shù)據(jù)庫（http://tcm.cmu.edu.tw/）檢索水蛭的活性成分，并使用SwissADME進(jìn)行篩選（篩選標(biāo)準(zhǔn)：GI absorption：HIGH，Druglikeness中至少2個YES）。

1.2 中藥靶點(diǎn)的獲取

將所得活性成分通過SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget-prediction.ch/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。篩選標(biāo)準(zhǔn)：同時滿足3D相似性閾值設(shè)置為0.75、2D相似性閾值設(shè)置為0.45及Probability＞0。并利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行基因轉(zhuǎn)換。

1.3 疾病靶點(diǎn)的選擇

以“Atherosclerosis”為關(guān)鍵詞在DisGeNET（https://www.disgenet.org/）與GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點(diǎn)信息。

1.4 中藥復(fù)方—疾病靶點(diǎn)的獲取

將1.2項(xiàng)及1.3項(xiàng)所得靶點(diǎn)輸入Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）網(wǎng)址，獲取藥物與疾病的交集靶點(diǎn)及韋恩圖，并利用Cytoscape3.9.0軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。設(shè)置條件：蛋白質(zhì)種類“homo sapiens（人類）”，作用閾值 “medium confidence（0.400）”。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用CytoScape中Metascape組件對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG信號通路富集分析，并使用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）將富集結(jié)果可視化。

1.7 分子對接驗(yàn)證

在化源網(wǎng)（https://www.chemsrc.com/）中查找“藥物-成分-疾病-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”中靶點(diǎn)數(shù)前三的藥物化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu)，并通過ChemBioDraw 14及ChemBio3D Ultra 14轉(zhuǎn)化為 mol2 格式文件。篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值前3的基因，從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）獲取智人中適合的化合物蛋白晶體結(jié)構(gòu)的3D分子結(jié)構(gòu)pdb格式文件，再通過Auto Dock Tools 1.5.6軟件轉(zhuǎn)換為pdbqt格式。使用Auto Dock 4.2.6 軟件進(jìn)行分子對接、Pymol 2.4.1 軟件進(jìn)行對接結(jié)果可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分

經(jīng)TCMSP、TCMID及相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]篩選，共得蛭龍活血通瘀膠囊主要活性成分58個（去重后54個），其中大血藤5個、桂枝7個、黃芪21個（通過查閱文獻(xiàn)獲得黃芪總皂苷及黃芪多糖2種化學(xué)成分，雖然黃芪總皂苷不符合SwissADME篩選條件，但已有研究表明其具有降低氧化應(yīng)激損傷，神經(jīng)保護(hù)[8]，可改善AS小鼠脂代謝[9]，故也被納入研究范疇）、人參19個、水蛭6個，包括黃芪總皂苷、黃芪多糖、山奈酚、槲皮素等。合并去重后中藥靶點(diǎn)790個，疾病靶點(diǎn)182個，藥物與疾病交集靶點(diǎn)61個（見圖1）。

圖1 蛭龍活血通瘀膠囊與AS交集靶點(diǎn)

2.2 中藥有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖與疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

利用Cytoscape3.9.0繪制“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，共有121個節(jié)點(diǎn)、442條邊（見圖2）。靶點(diǎn)數(shù)前三的化合物分別是槲皮素、山奈酚及花生四烯酸。

圖2 藥物-成分-疾病-交集靶點(diǎn)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將61個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（已去除獨(dú)立靶點(diǎn)：ABCC9）（見圖3）。

圖3 蛭龍活血通瘀膠囊治療AS的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集結(jié)果

對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析，以count值為篩選依據(jù)，繪制GO Biological process（BP）、GO Cellular component（CC）及GO Mo-lecular function（MF）三合一柱形圖（見圖4）。結(jié)果表明，在生物過程方面，主要涉及炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、防御反應(yīng)調(diào)節(jié)、血管發(fā)育、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞遷移的正調(diào)控等；在細(xì)胞組分方面，主要涉及膜側(cè)、細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜外側(cè)、受體復(fù)合體等；在分子功能方面，主要涉及氧化還原酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、肽酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。

圖4 BP、CC、MF三合一柱形圖

2.5 KEGG富集結(jié)果

KEGG通路富集分析共獲取101條通路，主要涉及AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、IL-17信號通路、Apelin信號通路等。選取靶點(diǎn)數(shù)前20的信號通路繪制富集氣泡圖（見圖5）。

圖5 KEGG通路富集信息氣泡圖

2.6 分子對接結(jié)果

一般認(rèn)為，結(jié)合能越小，代表配體與受體間相互作用的親和力越強(qiáng)，發(fā)生作用的可能性越大。經(jīng)篩選，靶點(diǎn)數(shù)前三的主要活性成分是槲皮素、山奈酚及花生四烯酸，degree值前三的靶點(diǎn)是IL6、TNF、AKT1。從上述化合物與交集靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果（見附表）中不難發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸與AKT1（PDB ID：1INQ）、槲皮素與TNF（PDB ID：2AZ5）、山奈酚與AKT1（1UNQ）均具有良好的結(jié)合活性?；ㄉ南┧峥膳c活性位點(diǎn)附近的ASN-53、ARG-25、LYS-14、ARG-23四種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到AKT1、槲皮素可與ASP-45、GLY-24、ILE-136三種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF、山奈酚可與GLN-47、GLU-40、LYS-39三種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到AKT1上（見圖6）。

附表 分子對接結(jié)果（kcal/mol）

圖6 分子對接圖

3 討論

目前認(rèn)為，AS與高血脂、高血糖等高危因素刺激機(jī)體，產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷及功能失調(diào)所致局部斑塊、血栓形成有關(guān)[10]，提倡采用降脂、抗氧化等治療[11]。但長期用藥會產(chǎn)生肝腎功能損害、肌肉毒性反應(yīng)、血糖異常、腦卒中、胃腸道癥狀等不良反應(yīng)[12,13]。我國作為AS患病人數(shù)最多的地區(qū)之一[14]，在中藥防治由AS繼發(fā)的胸痹、中風(fēng)上有豐富的臨證經(jīng)驗(yàn)，在有效緩解癥狀的同時未增加不良反應(yīng)。蛭龍活血通瘀膠囊由大血藤、黃芪、桂枝、人參、水蛭等五味中藥組成，具有“補(bǔ)益氣血，益氣通絡(luò)”之功，可通過改善血脂[5]、抗炎、抗細(xì)胞焦亡[15]、保護(hù)血管內(nèi)皮[16]等達(dá)到治療AS的作用。

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出黃芪總皂苷、黃芪多糖、山奈酚、槲皮素等58個主要活性成分，可通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)血管內(nèi)皮等作用抑制AS發(fā)生發(fā)展[17-20]。IL6、TNF、AKT1、PTGS2、VEGFA、CCL2、MMP9、IL1B、NOS3、SERPINE1作為核心度前10位的關(guān)鍵靶點(diǎn)，在AS的治療中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。VEGFA是VEGF家族中常見的一類亞型，具有維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞完整、調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生成、修復(fù)受損血管的功能[21]。促炎因子IL6、IL1B與TNF可協(xié)同誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生。VEGF與VEGFR的結(jié)合可促進(jìn)AKT/PKB磷酸化，激活內(nèi)皮細(xì)胞NOS3（eNOS）的表達(dá)[22]，促使內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO。NO不僅促進(jìn)血管擴(kuò)張、抑制血小板等物質(zhì)與血管內(nèi)皮的聚集粘附、抑制纖維斑塊的形成，也能防止由促炎細(xì)胞因子和促動脈粥樣硬化因子（如活性氧（ROS））誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[23,24]。趨化因子CCL2具有調(diào)控白細(xì)胞遷移及炎癥細(xì)胞運(yùn)輸?shù)淖饔茫贏S病變血管內(nèi)膜中顯著表達(dá)[25]。 MMP-9具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的生理功能，可通過對Ⅳ、Ⅴ型明膠原的調(diào)控作用，加速動脈粥樣斑塊破裂及AS進(jìn)程[26]。

AGEs是晚期糖基化過程產(chǎn)生的一類異質(zhì)分子，參與體內(nèi)多種生理病理過程，RAGE為其細(xì)胞受體。當(dāng)機(jī)體受到高血糖、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等刺激時，AGEs產(chǎn)生增多。與內(nèi)皮細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS并進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）的表達(dá)。NF-κB通過作用于相關(guān)信號通路，致使TNF-α、IL-6等炎性因子不斷產(chǎn)生，損傷血管內(nèi)皮，發(fā)生血管炎癥反應(yīng)[27]，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向該部位的遷移、募集以及局部脂質(zhì)沉積，最終形成AS[28-30]。HIF-1作為缺氧誘導(dǎo)因子，其表達(dá)的增加可誘導(dǎo)人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥及凋亡反應(yīng)，從而促進(jìn)AS發(fā)展[31]。與此同時，還有研究觀察到Apelin對AS具有雙向調(diào)節(jié)作用，不僅能通過促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、血管新生、改變粥樣斑塊穩(wěn)定性以促進(jìn)AS的發(fā)展，也能通過減少內(nèi)皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)其消除、抑制內(nèi)皮細(xì)胞衰老等作用抑制AS的進(jìn)展[32,33]。分子對接結(jié)果顯示，除花生四烯酸與IL6結(jié)合活性稍差外，其余對接結(jié)果均具有良好的結(jié)合活性，說明槲皮素與山奈酚很可能是治療AS的關(guān)鍵成分。

本研究通過利用數(shù)據(jù)挖掘、生信分析等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)蛭龍活血通瘀膠囊可通過L6、TNF、VEGFA、CCL2、MMP9、NOS3等靶點(diǎn)作用于AGE-RAGE、HIF-1、Apelin等多條信號通路，在抗炎、抗氧化、促進(jìn)血管生成、抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮抗AS的作用，具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。但研究也存在不足，如可能遺漏部分生物利用度差但發(fā)揮良好作用的活性成分、對接成分偏少等，后期仍需進(jìn)一步開展細(xì)胞、動物等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。