聶黎行，劉 瑞，張 燁，陳 佳*，李 靜，戴 忠，馬雙成

（1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；3.鄂爾多斯市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017010）

中藥注射劑作為我國(guó)特有的新劑型，具有起效快、作用強(qiáng)等特點(diǎn)，在心腦血管疾病、感染性疾病、惡性腫瘤、危重疾病、疑難雜癥的治療方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1-3]。生脈注射液由紅參、麥冬、五味子3味藥組成，具有益氣養(yǎng)陰，復(fù)脈固脫的功效，臨床上用于氣陰兩虧，脈虛欲脫的心悸、氣短，四肢厥冷、汗出、脈欲絕及心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等疾病的治療[4-6]。本次新型冠狀病毒肺炎疫情，中醫(yī)藥在緩解癥狀、提高治愈率、降低病亡率，促進(jìn)機(jī)體康復(fù)等環(huán)節(jié)取得明顯成效[7-9]，生脈注射液也被列為《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》（第四～七版）重型患者救治推薦用藥。

中藥的化學(xué)成分是其發(fā)揮臨床功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，《中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求》（國(guó)食藥監(jiān)注[2007]743號(hào)）規(guī)定：“中藥注射劑中所含成分應(yīng)基本清楚，多成份制成的注射劑，需要分別建立大類(lèi)成份的測(cè)定，所測(cè)成份應(yīng)大于總固體量的80 %”。本文在前期化學(xué)成分類(lèi)別系統(tǒng)預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上[10]，采用多種技術(shù)和手段首次對(duì)生脈注射液中的大類(lèi)成分進(jìn)行全面地定量分析，進(jìn)一步闡明了本品的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制、藥效及作用機(jī)制等研究提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AE240（十萬(wàn)分之一）電子天平，F(xiàn)D-1冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)），DZ-2BC型真空干燥箱（天津泰斯特），KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司），8453紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Agilent公司），L15/11馬弗爐（Nabertherm公司），DL53型自動(dòng)電位滴定儀（Mettler公司）。

1.2 材料

分析純乙醇、乙酸乙酯、鹽酸、硫酸、蒽酮、香草醛（北京化學(xué)試劑公司）。氫氧化鈉滴定液（0.01004 mol/L，國(guó)家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心）。AB-8型大孔樹(shù)脂（天津允開(kāi)樹(shù)脂），001*1型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（天津興南允能）。D-果糖（批號(hào)：111504-201703）、人參皂苷Re（批號(hào)：110754-202129）、五味子醇甲（批號(hào)：110857-201815）、蘋(píng)果酸（批號(hào)：190013-201702）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。7批生脈注射液由A、B、C 3個(gè)廠家提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 總固體的測(cè)定

因生脈注射液含糖量高，如采用常規(guī)的烘干法測(cè)定總固體，糖在高溫下分解產(chǎn)生水，水蒸發(fā)后造成總固體量偏低，故采用冷凍-減壓干燥法測(cè)定。精密量取本品2.0 ml于干燥置入恒重的西林瓶，-20 ℃冷凍干燥48 h，取出，置于裝有五氧化二磷的真空干燥箱中，室溫放置24 h，取出，迅速精密稱(chēng)定重量，計(jì)算總固體含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 大類(lèi)成分的定量分析

2.2.1 總糖的含量測(cè)定 樣品經(jīng)大孔樹(shù)脂純化，采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定生脈注射液中總糖含量[11]。取果糖對(duì)照品12 mg，精密稱(chēng)定，加水溶解并定容至10 ml，即得對(duì)照品貯備液。精密吸取上述對(duì)照品貯備液0.2，0.4，0.8，1.0和1.2 ml，分別加水稀釋并定容至10 ml，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。分別吸取各系列對(duì)照品溶液1 ml，精密加水1 ml，搖勻，精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱(chēng)取蒽酮0.1 g，加80 %硫酸溶液100 ml使溶解，搖勻）6 ml，搖勻。至100 ℃水浴加熱15 min，立即至冰浴中冷卻15 min，取出測(cè)定。照紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0401），以相應(yīng)試劑為空白，在626 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。精密量取生脈注射液1 ml，加于預(yù)先處理好的AB-8大孔樹(shù)脂柱（柱內(nèi)徑約8 mm，高約19 cm），用水80 ml沖洗，洗脫液收集于100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取上述溶液2 ml，加水稀釋并定容至10 ml，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液1 ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備項(xiàng)下的方法，依法測(cè)定吸光度，以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

方法學(xué)考察：按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備方法，進(jìn)行線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，果糖在0.0250～0.1504 mg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為y=5.773x+0.009，r=0.9996。取同一供試品溶液（批號(hào)：09122603），分別連續(xù)測(cè)定6次，平均吸光度為0.5146，RSD為0.1 %，表明方法精密度良好。取同一批次樣品（批號(hào)：09122603），平行制備6份供試品溶液，依法測(cè)定，總糖含量平均值為43.12 mg/ml，RSD為1.3 %，表明方法重復(fù)性良好。取顯色后的同一供試品溶液（批號(hào)：09122603），置于冰浴中，分別于15，30，60，90，120，150，180 min取出測(cè)定，平均吸光度為0.5185，RSD為0.4 %，表明供試品溶液冰浴放置3 h，基本穩(wěn)定。精密量取已知含量的本品（批號(hào)：09122603）0.5 ml，精密加入果糖對(duì)照品約25 mg，混勻，按供試品制備方法制得加樣回收溶液，平行制備6份，依法測(cè)定，平均回收率為101.2 %，RSD為2.4 %，表明方法準(zhǔn)確。

2.2.2 總皂苷的含量測(cè)定 樣品經(jīng)大孔樹(shù)脂純化，采用香草醛-硫酸比色法測(cè)定生脈注射液中總皂苷含量[12]。取人參皂苷Re對(duì)照品17.5 mg，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并定容至10 ml，即得對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 ml，置入具塞試管，揮發(fā)溶劑至干，精密加入8 %香草醛乙醇溶液0.5 ml、72 %硫酸5.0 ml，搖勻，60 ℃水浴加熱1 h，置冰浴中冷卻15 min，取出，放至室溫。照紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0401），以相應(yīng)試劑為空白，在538 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。精密量取生脈注射液1 ml，加于預(yù)先處理好的AB-8大孔樹(shù)脂柱（柱內(nèi)徑約8 mm，高約19 cm），分別用水80 ml，20 %乙醇40 ml沖洗，再用75 %乙醇70 ml洗脫，收集75 %乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 ml量瓶，稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液1 ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備項(xiàng)下的方法，依法測(cè)定吸光度，以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

方法學(xué)考察：按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備方法，進(jìn)行線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，人參皂苷Re在0.0155～0.1399 mg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為y=7.026x+0.002，r=0.9996。取同一供試品溶液（批號(hào)：09122603），分別連續(xù)測(cè)定6次，平均吸光度為0.4812，RSD為0.2 %，表明方法精密度良好。取同一批次樣品（批號(hào)：09122603），平行制備6份供試品溶液，依法測(cè)定，人參皂苷Re含量平均值為1.97 mg/ml，RSD為1.8 %，表明方法重復(fù)性良好。取顯色并冰浴冷卻后的同一供試品溶液（批號(hào)：09122603），置于室溫，分別于15，30，60，90，120，150，180 min測(cè)定，平均吸光度為0.5372，RSD為2.0 %，表明供試品溶液冰浴放置3 h，基本穩(wěn)定。精密量取已知含量的本品（批號(hào)：09122603）0.5 ml，精密加入人參皂苷Re對(duì)照品約0.9 mg，混勻，按供試品制備方法制得加樣回收溶液，平行制備6份，依法測(cè)定，平均回收率為101.8 %，RSD為2.4 %，表明方法準(zhǔn)確。

2.2.3 總木脂素的含量測(cè)定 樣品經(jīng)大孔樹(shù)脂柱分離和乙酸乙酯萃取，采用比色法測(cè)定生脈注射液中總木脂素含量[13]。取五味子醇甲對(duì)照品10 mg，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并定容至25 ml，搖勻，即得對(duì)照品溶液。分別精密量取上述對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度。照紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0401），以相應(yīng)試劑為空白，在254 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。精密量取本品1 ml，加于預(yù)先處理好的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱（柱內(nèi)徑約8 mm，高約19 cm），分別用水200 ml、20 %乙醇200 ml、乙醇100 ml洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，再加5 mol/L的鹽酸溶液0.5 ml，搖勻，用乙酸乙酯萃取4次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 ml，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液1 ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備項(xiàng)下的方法，依法測(cè)定吸光度，以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

方法學(xué)考察：按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備方法，進(jìn)行線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，五味子醇甲在0.0045～0.0452 mg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為y=3.349x+0.030，相關(guān)系數(shù)（r）=0.9996。取同一供試品溶液（批號(hào)：09122603），分別連續(xù)測(cè)定6次，平均吸光度為0.1543，RSD為0.04 %，表明方法精密度良好。取同一批次樣品（批號(hào)：09122603），平行制備6份供試品溶液，依法測(cè)定，總木脂素含量平均值為0.17 mg/ml，RSD為0，表明方法重復(fù)性良好。取同一供試品溶液（批號(hào)：09122603），分別于15，30，60，90，120，150，180 min測(cè)定，平均吸光度為0.1547，RSD為0.3 %，表明供試品溶液放置3 h，基本穩(wěn)定。精密量取已知含量的本品（批號(hào)：09122603）0.5 ml，精密加入五味子醇甲對(duì)照品約0.08 mg，混勻，按供試品制備方法制得加樣回收溶液，平行制備6份，依法測(cè)定，平均回收率為95.9 %，RSD為2.7 %，表明方法準(zhǔn)確。

2.2.4 總酸的含量測(cè)定 采用電位滴定法測(cè)定總酸含量[14-15]。取蘋(píng)果酸對(duì)照品25 mg，精密稱(chēng)定，加水溶解并定容至50 ml，搖勻，即得對(duì)照品溶液。精密量取上述對(duì)照品溶液1 ml，加水30 ml，置于自動(dòng)電位儀上，用氫氧化鈉滴定液滴定（電極DG 111-SC），隨行空白實(shí)驗(yàn)?？鄢瞻缀螅蟮妹? ml蘋(píng)果酸對(duì)照品溶液所消耗的氫氧化鈉滴定液體積為7.54 ml。而蘋(píng)果酸含3個(gè)羧基，由公式（V堿=3C酸V酸/C堿）計(jì)算理論消耗量為7.46 ml，實(shí)測(cè)值與理論值基本吻合，表明電位滴定法可準(zhǔn)確反映供試品溶液中酸的含量。精密量取生脈注射液2 ml，加于預(yù)先處理好的001*1型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱（樹(shù)脂約10 ml），加水90 ml洗脫，收集流出液和洗脫液置入100 ml量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液25 ml置入100 ml滴定杯，加水10 ml，置于自動(dòng)電位儀上，用氫氧化鈉滴定液滴定（電極DG 111-SC），同法測(cè)定空白溶液。以ΔE/ΔV-V繪制一階導(dǎo)數(shù)曲線(xiàn)，每1 ml 氫氧化鈉滴定液（0.01004 mol/L）相當(dāng)于0.6606 mg蘋(píng)果酸，生脈注射液中的總有機(jī)酸含量以蘋(píng)果酸計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

方法學(xué)考察：取同一批樣品（批號(hào)：09122603）制得的供試品溶液，分別連續(xù)測(cè)定6次，消耗氫氧化鈉滴定液的平均體積為6.8948 ml，RSD為0.3 %，表明方法精密度良好。取同一批次樣品（批號(hào)：09122603），平行制備6份供試品溶液，依法測(cè)定，總酸含量平均值為9.1108 mg/ml，RSD為1.6 %，表明方法重復(fù)性良好。取同一供試品溶液（批號(hào)：09122603），分別于0，2，4，6，12 h測(cè)定，消耗氫氧化鈉滴定液的平均體積為6.8954 ml，RSD為2.0 %，表明供試品溶液放置12 h，基本穩(wěn)定。精密量取已知含量的本品（批號(hào)：09122603）1 ml，精密加入蘋(píng)果酸對(duì)照品溶液（9.0248 mg/ml）1 ml，混勻，按供試品制備方法制得加樣回收溶液，平行制備6份，依法測(cè)定，平均回收率為99.9%，RSD為1.4 %，表明方法準(zhǔn)確。

2.2.5 總無(wú)機(jī)成分的含量測(cè)定 精密量取生脈注射液2 ml，至熾灼至恒重的坩堝中，緩緩熾灼至完全炭化，放冷至室溫，加硫酸0.5 ml使?jié)駶?rùn)，低溫加熱至硫酸蒸氣除盡后，于600 ℃熾灼使完全灰化，移至干燥器內(nèi)，放冷至室溫，精密稱(chēng)定后，再于600 ℃熾灼至恒重，即得，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 生脈注射液大類(lèi)成分含量/mg·ml-1（n=2）

3 討論

本研究以冷凍-減壓干燥法測(cè)定總固體含量，采用比色法、電位滴定法、熾灼殘?jiān)ǖ确椒y(cè)定總糖、總皂苷、總木脂素、總酸、總無(wú)機(jī)成分等大類(lèi)成分的含量。結(jié)果表明，3個(gè)廠家的7批生脈注射液總固體、總糖、總皂苷、總木脂素、總酸、總無(wú)機(jī)成分含量分別在37.7～78.1，25.87～56.90，1.33～1.97，0.07～0.24，1.71～9.11，1.62～8.62 mg/ml之間；不同批次樣品的總皂苷、總木脂素含量波動(dòng)范圍較小，總固體、總糖、總酸、總無(wú)機(jī)成分含量差異較大。7批樣品總糖、總皂苷、總木脂素、總酸、總無(wú)機(jī)成分占總固體百分比分別在55.2 %～74.1 %，2.2 %～3.8 %，0.2 %～0.5 %，3.7 %～11.7 %，3.1 %～11.0 %之間，占比最高的是總糖，其次為總有機(jī)酸和總無(wú)機(jī)成分，再次為總皂苷，占比最低的為總木脂素，各大類(lèi)成分含量總和均占總固體含量80 %以上（見(jiàn)圖1），達(dá)到了《中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求》（國(guó)食藥監(jiān)注[2007]743號(hào)）的規(guī)定，在一定程度上明確了生脈注射液的物質(zhì)組成和相對(duì)比例，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開(kāi)展的單個(gè)化學(xué)成分的含量測(cè)定將另文報(bào)道。

圖1 7批生脈注射液中各大類(lèi)成分占總固體的百分比

本文建立的方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，能夠系統(tǒng)、全面地揭示生脈注射液的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，可推廣用于其它中藥注射液的質(zhì)量評(píng)價(jià)。研究結(jié)果不僅為后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究提供了有價(jià)值的參考，同時(shí)也為提高生脈注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、保證用藥安全以及品種的二次開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。