李 莉，李 碩

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100029）

蜂花粉是由蜜蜂將采集的花粉粒摻入少量的花蜜和自身腺體分泌物混合而成的花粉團(tuán)[1-2]，其中含有多種重要的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)[3-4]。除了能提供豐富的營養(yǎng)外，蜂花粉還具有抗炎、抗疲勞、增強免疫力等功能特性[5-7]，自古以來就被當(dāng)做營養(yǎng)和保健品食用。由于花粉的含水量、水活度和pH值非常適宜微生物如細(xì)菌、真菌和酵母等的繁殖，是天然的培養(yǎng)基，因此蜂花粉在采集、儲存和銷售過程中很容易滋生霉菌而有可能產(chǎn)生真菌毒素[2,8-9]。真菌毒素有較高的生物毒性，如致癌、致畸和肝腎毒性等，攝入被真菌毒素污染的食品會對人類健康造成極大危害[10-13]。

目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中，有關(guān)蜂花粉中真菌毒素的測定方法主要是液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，涉及的真菌毒素種類多為單一種類如赭曲霉毒素A或黃曲霉毒素B族和G族等[14-16]，尚未有多種真菌毒素同時測定的報道。蜂花粉中真菌毒素的提取和凈化方法多采用免疫親和柱凈化技術(shù)，但由于免疫親和柱檢測專屬性較高，且操作繁瑣，不適用于多種毒素的提取凈化，不利于大樣本量的快速篩查。QuEChERS快速樣品前處理技術(shù)可以實現(xiàn)多種雜質(zhì)的快速高效去除，具有簡便快速的特點，近年成為食品中真菌毒素檢測的常用方法[17-26]。本研究利用改良后的QuEChERS前處理技術(shù)，結(jié)合超高效液相質(zhì)譜檢測方法，建立了同時測定蜂花粉中多種真菌毒素的檢出方法，可實現(xiàn)大批量樣品高通量快速篩查。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AL 204分析天平（美國Mettler Toledo公司）；Vortex Genie 2渦旋混勻器（美國Scientific Industries公司）；CF 16RXII離心機(jī)（日本日立公司）；LC 20AC-LCMS 8060超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（日本島津公司）；KQ-3200DE超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

伏馬毒素B1、B2、B3（FB1、FB2、FB3）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/ml，青島普瑞邦公司）；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/ml，青島普瑞邦）；赭曲霉毒素A、B、C（OTA、OTB、OTC）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/ml，青島普瑞邦）；乙腈（色譜純，德國 Merck）；甲酸（質(zhì)譜級，F(xiàn)isher Scientific公司）；乙酸（質(zhì)譜級，F(xiàn)isher Scientific）；實驗用水均為超純水；MPFCQuEChERS超濾型凈化柱（高脂類，北京綠綿）；Waters DisQuE 凈化管（2 ml，美國Waters）；QuEChERS提取鹽包（4 g MgSO4和1 g NaCl，北京綠綿）；蜂花粉樣品購自網(wǎng)絡(luò)平臺。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫 Poroshell 120 SB-C18色譜柱（100 mm× 2.1 mm，2.7 μm）；流動相A：0.1 %甲酸水溶液，流動相B：0.1 %甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序為：0～1 min，10 %～20 % B；1～9 min，20 %～40 % B；9～12 min，40 %～95 % B；12～14 min，95 % B；14～14.1 min，95 %～10 % B；14.1～16 min，10 % B。柱溫40 ℃，流速：0.3 ml/min，進(jìn)樣量：5 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ion，ESI），電離模式：正離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（multi reaction monitoring，MRM）模式；接口電壓4.0 kV；接口溫度300 ℃；碰撞氣為氬氣，霧化氣流量 3 L/min，干燥氣流量10 L/min，加熱氣流量10 L/min，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM模式下10種毒素的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確移取伏馬毒素B1、B2、B3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4 ml，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml，赭曲霉毒素A、B、C混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml置入10 ml，棕色量瓶，用50 %乙腈水溶液定容至刻度，配制成伏馬毒素B1、B2、B3質(zhì)量濃度為2 μg/ml，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A、B、C質(zhì)量濃度為1 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-20 ℃避光保存。臨用時以空白蜂花粉基質(zhì)提取液將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取粉粹過篩后的蜂花粉樣品2.5 g置入50 ml聚丙烯離心管，加入 20 ml乙腈-水-甲酸溶液（75:20:5，v/v/v），旋渦混勻30 s，室溫下超聲提取30 min。隨后加入4 g MgSO4和1 g NaCl，劇烈振搖1 min，10 000 r/min 離心5 min。取上清1 ml，過MPFC-QuEChERS高脂類超濾型凈化柱凈化后，經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾，續(xù)濾液作為待測溶液。

2.4 線性范圍考察

按2.3.2項步驟提取蜂花粉空白基質(zhì)溶液，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成系列濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測定，以目標(biāo)組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相關(guān)系數(shù)和回歸方程，見表2。結(jié)果表明，10種真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r在0.9990～0.9999范圍內(nèi)。

2.5 檢出限和定量限

根據(jù)加標(biāo)回收試驗結(jié)果，以3倍信噪比確定10種化合物的檢出限為1～1.8 μg/kg，以10倍信噪比確定定量限為3～6 μg/kg，結(jié)果見表2。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）是指由于脂類、鹽類等內(nèi)源性物質(zhì)或表面活性劑、緩沖鹽等外源性物質(zhì)與目標(biāo)化合物同時進(jìn)入質(zhì)譜時，對目標(biāo)化合物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，按照對結(jié)果影響不同，分為基質(zhì)增強效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)[27-29]。本實驗通過計算相同濃度下，空白基質(zhì)加標(biāo)溶液中10種化合物的峰面積與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)化合物峰面積的比值，考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，除伏馬毒素B1、B2、B3外，其他7種毒素呈現(xiàn)不同程度的離子抑制作用（基質(zhì)效應(yīng)在29.2 %～70.5 %之間）（見表2）。為了減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，實驗采取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正的方法進(jìn)行定量分析。

表2 10種真菌毒素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限

2.7 回收率和精密度

向蜂花粉空白樣品中加入低、中、高3個濃度水平的10種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平重復(fù)測定6次，計算加標(biāo)回收率和精密度（見表3）。10種毒素的平均回收率在71.3 %～106.5 %之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.0 %～9.5 %。

表3 不同添加水平下的回收率和精密度（n=6）

2.8 實際樣品檢測

按照本研究建立的方法對從網(wǎng)絡(luò)購物平臺購買的25批蜂花粉樣品進(jìn)行測定，25批蜂花粉中均未檢出黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、B、C和伏馬毒素B1、B2、B3。對檢測結(jié)果分析，推測可能由于購買的樣品產(chǎn)地多為中國北方區(qū)域，氣候相對干燥，不利于霉菌的生長或孢子的產(chǎn)生，未生成毒素，這也和文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[16]。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本實驗考察了0.1 %甲酸溶液-乙腈體系和5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈體系兩種流動相對10種毒素的洗脫分離效果，發(fā)現(xiàn)以0.1 %甲酸溶液-乙腈體系為流動相時得到的基線平穩(wěn)，噪音小，目標(biāo)化合物的響應(yīng)更高。因此選擇0.1 %甲酸溶液-乙腈體系為流動相進(jìn)行梯度洗脫。10種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM總離子流圖見圖1。

圖1 10種真菌毒素的總離子流圖

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于10 種真菌毒素均屬于極性化合物，采用電噴霧離子源時都有較高的響應(yīng)，因此選用ESI 模式。對10種真菌毒素分別在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，所有化合物在正離子模式下響應(yīng)更高，因此選擇采用正離子掃描方式。通過液質(zhì)聯(lián)用儀分析軟件的自動質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化模式，對目標(biāo)化合物在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下的定性、定量離子及相應(yīng)的電壓和碰撞能進(jìn)行優(yōu)化，即可得到最優(yōu)的質(zhì)譜條件。

3.3 樣品提取溶液的選擇

蜂花粉基質(zhì)較復(fù)雜，富含蛋白質(zhì)、脂類、黃酮類化合物和色素等成份，提取溶劑直接影響目標(biāo)化合物的提取效率。實驗通過空白基質(zhì)加標(biāo)的方式，考察了乙腈、75 %乙腈溶液和50 %乙腈溶液3種提取溶液的提取效果。結(jié)果表明，4種黃曲霉毒素和3種赭曲霉毒素用純乙腈或75 %乙腈溶液提取，回收率較好，用50 %乙腈溶液提取時回收率小于40 %；3種伏馬毒素用75 %乙腈溶液或50 %乙腈溶液時，回收率大于70 %，用純乙腈提取時回收率小于50 %。綜合考慮后選擇75 %乙腈溶液作為提取溶劑。

由于伏馬毒素類化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羧基，水溶性強，對酸敏感，提取溶劑中加入適量的酸可提高回收率。對含有不同濃度甲酸或乙酸的提取溶液進(jìn)行考察，結(jié)果見圖2。當(dāng)提取液中甲酸含量為5 %時，10種真菌毒素的回收率在70 %～120 %之間，滿足回收率實驗要求。因此最終選擇乙腈-水-甲酸溶液（75:20:5，v/v/v）作為樣品的提取溶劑。此外，在提取體系中加入適量MgSO4和NaCl可促進(jìn)乙腈和水相更好的分層，在鹽析作用下容易從水相中萃取極性較弱的毒素，同時還能減少干擾雜質(zhì)的引入有利于樣品溶液的進(jìn)一步凈化。

圖2 不同提取溶液對10 種真菌毒素的提取效率（n=6）

3.4 凈化方式的選擇

蛋白質(zhì)、脂類、黃酮類物質(zhì)和色素是松花粉中主要的基質(zhì)干擾，目前常用的真菌毒素的凈化方式多采用免疫親和柱或富集濃縮型固相萃取小柱（SPE）的方法，免疫親和柱雖然特異性強，但是往往只能針對特定種類的毒素，且價格昂貴，操作繁瑣；傳統(tǒng)固相萃取小柱需要經(jīng)過活化、上樣、淋洗、洗脫等步驟，所用有機(jī)試劑較多且耗時較長，這兩種凈化方式均不適用于多種真菌毒素的快速篩查。

本文采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方式，向空白蜂花粉基質(zhì)中添加2種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)提取溶液提取后，分別采用Waters DisQuE 凈化管和綠綿MPFC-QuEChERS凈化，考察2種不同的QuEChERS凈化方法的凈化效率。結(jié)果表明，經(jīng)MPFC-QuEChERS凈化后的10種毒素回收率為71.3 %～101.9 %，經(jīng)DisQuE 凈化后黃曲霉毒素和赭曲霉素回收率為81.1 %～99.8 %，滿足回收率要求，但是3種伏馬毒素的回收率均低于50 %。因此實驗最終選擇MPFC-QuEChERS凈化柱進(jìn)行樣品的凈化（見表4）。

表4 不同凈化方法下10 種毒素的回收率（n=3）

4 結(jié)論

本研究建立的蜂花粉中10種真菌毒素的檢測方法和傳統(tǒng)免疫親和柱凈化方法相比，具有操作簡便，快捷高效，適用于不同種類毒素同時檢測的優(yōu)點，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，適用于大批量蜂花粉樣品中真菌毒素的快速篩查分析。