王民炎，俞文仙，趙耘霄，陳益存，高 暝，吳立文，吳善群，汪陽東*

(1. 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2. 南京林業(yè)大學，江蘇 南京 210037；3. 杭州市富陽區(qū)農業(yè)農村局，浙江 杭州 311400；4. 福建省大田縣森林資源管理站，福建 大田 366100)

山蒼子（Litsea cubeba(Lour) Pers.）為樟科（Lauraceae）木姜子屬（LitseaLam.）落葉灌木或小喬木，是我國重要的香料植物資源之一。其植物精油具有特殊的芳香氣味及抗菌、抗蟲、抗氧化等多種特征，被廣泛用于香料、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)[1-3]。隨著生物學技術的發(fā)展及山蒼子基因組圖譜的完成，有助于解讀山蒼子中基因在各個組織、器官、個體在不同發(fā)育時期表達差異，全面理解基因分子生物學功能[4-5]。開展山蒼子基因功能研究，將山蒼子中重要的功能基因導入到山蒼子植株中進行表型鑒定和挖掘，已成為一種主要方法，其中組培再生體系和遺傳轉化體系的建立是重要研究內容。

植物再生體系是遺傳轉化的基礎，不同外植體再生能力有較大差異，尤其是木本植物生長周期長、再生困難，通過調整外源激素比例可提高其再生效率[6-9]。目前，有關山蒼子的腋芽器官離體再生和愈傷誘導研究已有一定的進展[10-13]，但由于遺傳轉化體系的缺乏，利用基因工程技術進行山蒼子遺傳改良的研究尚未展開。農桿菌介導法是植物遺傳轉化采用最多的一種方法，具有成本低、操作簡便、可重復性好等優(yōu)點。農桿菌介導遺傳轉化法原理：植物受傷部位產生酚類物質（乙酰丁香酮等），在酚類物質誘導下農桿菌聚集和vir誘導因子表達，促進T-DNA復合物產生，然后T-DNA復合物轉移并整合到植物細胞的基因組中[14-15]。遺傳轉化步驟主要包括農桿菌液準備、侵染和共培養(yǎng)、轉化組織的篩選和分化、轉化植株的檢測[16-19]。在篩選培養(yǎng)階段至少需要添加兩種抗生素進行篩選，一種能抑制農桿菌生長，另一種能殺死未轉化細胞并保留轉化成功的細胞。頭孢霉素能顯著抑制農桿菌生長，對植物生長影響較小，而潮霉素能顯著殺死未轉化的植物細胞組織，大幅降低假陽性的產生，這兩種抗生素被廣泛應用于植物的遺傳轉化[20-22]。然而，如抗生素濃度使用過度，會影響愈傷組織的正常生長和分化，甚至造成已轉化成功愈傷組織的死亡，且不同植物對抗生素忍耐性不同[23]。因此，選擇合適的抗生素濃度能顯著提升遺傳轉化的效率。

本研究以快繁的無菌組培苗為試驗材料，進一步優(yōu)化山蒼子組培再生過程，研究頭孢霉素和潮霉素對山蒼子再生的影響，初步建立山蒼子的遺傳轉化體系，為山蒼子種質資源繁育及基因功能研究和遺傳改良提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本研究以‘安徽3號’優(yōu)株為山蒼子組培苗材料，采集杭州市富陽區(qū)新沙島繁育基地的當年生帶芽莖段為外植體，經過消毒處理后在繼代培養(yǎng)基中誘導不定芽20～30 d左右，取不定芽更換至新的繼代培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，以繼代培養(yǎng)3～5 cm高的無菌苗進行愈傷誘導及生根等試驗，具體消毒過程及苗繼代培養(yǎng)基的配方參照林麗媛等方法[24]。試驗所需農桿菌菌株采用LBA4404；載體為pCAMBIA1300-GFP，帶綠色熒光蛋白標記（GFP）和潮霉素篩選標記；MS固體培養(yǎng)基（M519）；6-BA、IBA、TDZ、NAA、IAA先用1 mol ·L-1NaOH溶解加無菌水配制成1 mg·mL-1母液并4 ℃保存；卡那霉素、頭孢霉素、潮霉素用無菌水配制50 mg·mL-1母液并-20 ℃保存，乙酰丁香酮和利福平直接用二甲基亞砜溶解分別配制成200 mg·mL-1、20 mg·mL-1母液并-20 ℃保存。所有培養(yǎng)基pH調至5.8，除6-BA、IBA、TDZ、NAA激素外，其余激素和抗生素均滅菌冷卻至50 ℃左右加入。

1.2 山蒼子再生體系的建立

1.2.1 外源激素對愈傷組織分化的影響 將長至3～5 cm高的幼嫩組培苗去掉葉片和芽并切成0.5 cm左右的莖段，用鑷子將莖段夾至愈傷組織誘導培養(yǎng)基中（MS 4.43 g + 蔗糖30 g + 瓊脂粉7.5 g +6-BA 2.0 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1，pH 5.8），弱光培養(yǎng)3周，然后弱光繼代培養(yǎng)1周。在預實驗的基礎上，將繼代培養(yǎng)1周的愈傷組織接種至含有3種不同濃度的激素組合6-BA（0.1～2.0 mg·L-1）、IBA（0.01～0.10 mg·L-1）、TDZ（0.01～0.50 mg·L-1）MS培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，觀察愈傷組織生長和出芽情況。每個組合30個愈傷組織，進行3次以上獨立重復試驗。

1.2.2 外源激素對組培苗生根的影響 將長至3～5 cm高的幼嫩組培苗去掉基部的大部分愈傷組織，接種至含有3種不同濃度的激素組合NAA、6BA、IBA的1/2 MS培養(yǎng)基（1/2 MS 2.17 g + 蔗糖20 g，pH 5.8），光照培養(yǎng)并觀察苗狀態(tài)。

1.3 抗生素濃度的選擇

1.3.1 頭孢霉素對愈傷組織誘導及生長的影響 將誘導0.5 cm左右的莖段接種至含有0、200、300、500 mg·L-1頭孢霉素的愈傷誘導培養(yǎng)基中誘導愈傷組織，觀察愈傷組織誘導及生長狀態(tài)。

1.3.2 潮霉素對愈傷組織誘導及生長的影響 將誘導0.5 cm左右的莖段和繼代培養(yǎng)1周后的愈傷組織分別接種至含有0、5、10、20、30、50 mg·L-1潮霉素的愈傷誘導培養(yǎng)基和愈傷組織繼代培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織誘導及生長狀態(tài)。

1.4 農桿菌介導的山蒼子遺傳轉化

1.4.1 農桿菌菌液的制備 將目的載體質粒轉入農桿菌LBA4404中，2 d后挑單菌落接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 mg·L-1卡那霉素，20 mg·L-1利福平），28 ℃下200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜，取1 mL轉移至100 mL含相同抗生素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 h左右，至菌液OD值在0.5～0.8之間，3500 g離心5 min，用侵染液懸浮農桿菌OD600至0.6～0.8左右（MS 2.22 g·L-1+ 20 g·L-1蔗糖 + 10 g·L-1葡萄糖 + 10 mmol ·L-1MES + 200 mg·L-1AS）。

1.4.2 侵染及共培養(yǎng) 選取繼代培養(yǎng)1周長勢良好且鮮嫩的愈傷組織放入侵染液中侵染30 min，用漏勺將侵染后的愈傷組織放至無菌濾紙吸干多余水分，接種至共培養(yǎng)基中（MS 4.43 g·L-1+ 30 g·L-1蔗糖 + 10 g·L-1葡萄糖 + 1 mg·L-16BA + 0.1 mg·L-1IBA + 0.5 mg·L-1TDZ + 200 mg·L-1AS），于22～25 ℃暗培養(yǎng)2～3 d。

1.4.3 脫菌及篩選培養(yǎng) 將共培養(yǎng)好的愈傷放入無菌水中清洗3次，每次5 min，再用含300 mg·L-1頭孢霉素的無菌水清洗3次，每次5 min。放置無菌濾紙上完全干燥后，夾至篩選培養(yǎng)基中（MS4.43 g·L-1+ 30 g·L-1蔗糖 + 1 mg·L-16BA + 0.1 mg·L-1IBA + 300 mg·L-1頭孢霉素 + 5 mg·L-1潮霉素）。光照條件下篩選培養(yǎng)至剛好可見新的愈傷，然后不斷降低頭孢霉素濃度、增加潮霉素篩選濃度對抗性愈傷組織進行篩選培養(yǎng)，每15 d更換培養(yǎng)基。

1.4.4 誘導抗性愈傷組織分化 將1～2 cm抗性愈傷組織接種至愈傷分化培養(yǎng)基中（MS 4.43 g·L-1+ 30 g·L-1蔗糖 + 2 mg·L-16BA + 0.01 mg·L-1IBA + 0.05 mg·L-1TDZ）誘導不定芽，將分化出的芽接種至含20 mg·L-1潮霉素的繼代培養(yǎng)基中，進行擴繁。

1.5 轉基因植株的分子檢測

1.5.1 PCR鑒定 提取3 cm以上抗性苗葉片DNA（共16株），設計3對引物進行驗證，第1對引物為插入基因片段，擴增長度為904 bp（21/MAD31-272 bp PF: ATGAATCTGTGCAGT GAAGAAGGAA和eGFP-79 bp PR: CGTCGCCG TCCAGCTCGACCAG）；第2對引物為潮霉素基因片段，擴增長度為506 bp（PF: GCGTCTGCT GCTCCATACA和PR: TGACATTGGGGAGTTTA GCG）；第3對引物為T-DNA插入?yún)^(qū)外的卡那霉素基因片段，擴增片段長度為443 bp（PF: ATG TTGCTGTCTCCCAGGTCG和CGGTATAAAGG GACCACCTATGA）。

1.5.2 Southern Blot印跡雜交檢測 DNA提取方法參考艾德萊公司試劑盒說明書，Southern雜交檢測流程如下：取轉化得到的抗性愈傷組織和未轉化野生型愈傷組織的DNA，各 10 ug，采用Hind III限制酶酶切回收后，按照羅氏公司Southern Blot雜交試劑盒說明書DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I，依次進行DNA電泳分離和轉膜、使用地高辛標記的潮霉素基因進行雜交、洗膜和顯色、拍照等步驟。

2 結果與分析

2.1 外源激素對山蒼子組培再生的影響

2.1.1 外源激素對山蒼子愈傷組織分化的影響 誘導培養(yǎng)21 d的山蒼子愈傷組織置于6-BA、IBA、TDZ 3種不同激素配比培養(yǎng)基下培養(yǎng)。試驗顯示：6-BA濃度在1.0～2.0 mg·L-1時的愈傷組織生長狀態(tài)較好，且能保持持續(xù)分裂；IBA濃度在0.1 mg·L-1左右時有利于愈傷組織的增殖繼代，而在0.01 mg·L-1IBA低濃度時有利于愈傷組織的分化；TDZ有助于細胞生長及分裂，在加入0.05～0.50 mg·L-1TDZ后，愈傷組織表現(xiàn)出持續(xù)生長和分化，有效防止了褐化。外源激素組合為1.0 mg·L-16-BA +0.1 mg·L-1IBA + 0.5 mg·L-1TDZ有利于愈傷增殖繼代培養(yǎng), 愈傷組織僅在2.0 mg·L-16-BA + 0.01 mg·L-1IBA + 0.05 mg·L-1TDZ激素組合下出現(xiàn)分化，分化率在16.67%～36.67%之間（表1）。

表1 外源激素對山蒼子愈傷組織分化的影響Table 1 Effects of exogenous hormones on callus differentiation in L. cubeba

2.1.2 外源激素對山蒼子組培苗生根的影響 將長至高3～5 cm的山蒼子無菌苗去除基部愈傷組織，置于不同濃度的NAA、IBA、IAA配比下進行生根誘導。結果表明：NAA不能誘導苗生根，而IBA在適宜濃度下能誘導苗生根，但生根率較低，且基部有愈傷形成，阻礙了養(yǎng)分的運輸及根的形成，導致葉片掉落，苗生長狀態(tài)差。在培養(yǎng)基中僅添加IAA時植株生長狀態(tài)較好，基部無愈傷組織形成，在0.5 mg·L-1IAA時生根率達97.33%（表2）。

2.2 抗生素臨界濃度的選擇

2.2.1 頭孢霉素對愈傷組織誘導及生長的影響 頭孢霉素能抑制農桿菌的生長，濃度范圍一般控制在200～500 mg·L-1，濃度低于200 mg·L-1不能有效抑制農桿菌的生長，濃度高于500 mg·L-1時影響愈傷的生長及分化。本試驗在0、200、300、500 mg·L-1不同頭孢霉素濃度下誘導莖段愈傷，在濃度200～300 mg·L-1時愈傷組織顏色鮮綠保持正常，與不添加頭孢霉素保持一致。在濃度500 mg·L-1時愈傷組織顏色比正常愈傷更為深綠，出現(xiàn)老化狀態(tài)。因此，篩選培養(yǎng)前期選擇頭孢霉素濃度300 mg·L-1作為農桿菌抑制濃度，后期應不斷降低頭孢霉素濃度，防止對愈傷分化產生影響（表3）。

表3 不同濃度頭孢霉素對愈傷組織誘導及生長的影響Table 3 Effects of different concentrations of cefotaxime on callus induction and growth

2.2.2 潮霉素對愈傷組織誘導及生長的影響 潮霉素對愈傷組織誘導及生長影響較大，潮霉素濃度在5 mg·L-1時，能很大程度地誘導愈傷組織，但愈傷組織整體狀態(tài)差且誘導培養(yǎng)3周后愈傷組織全部褐化；隨著潮霉素濃度的增加，其濃度10 mg·L-1時已不能誘導愈傷組織（表4）。將繼代培養(yǎng)1周后的愈傷組織在含潮霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，隨著潮霉素濃度的增加愈傷組織死亡越多，10 mg·L-1濃度下愈傷組織出現(xiàn)大面積褐化死亡，濃度30 mg·L-1的愈傷組織表面已無可見愈傷。因此，綜合考慮遺傳轉化過程中多步驟操作及農桿菌對愈傷的影響，以潮霉素濃度5 mg·L-1為第1次篩選濃度，持續(xù)時間為7～10 d，潮霉素濃度20～30 mg·L-1作為愈傷組織臨界篩選濃度，持續(xù)時間應不短于2個月。

表4 潮霉素對山蒼子愈傷組織誘導及生長的影響Table 4 Effects of hygromycin on callus induction and growth of L. cubeba

2.3 農桿菌介導的山蒼子遺傳轉化及轉基因植株的分子檢測

山蒼子農桿菌遺傳轉化流程見圖1。首先在光照條件下誘導愈傷組織約21 d，并繼代培養(yǎng)7～10 d，然后采用農桿菌侵染繼代培養(yǎng)后的愈傷組織30 min，放置于無菌濾紙上超凈臺吹干至愈傷組織表面無水分；將侵染后愈傷組織轉移至共培養(yǎng)基黑暗共培養(yǎng)2～3 d至剛好肉眼可見農桿菌，立即用頭孢霉素清洗愈傷組織并吹干，此處應完全吹干至愈傷組織表面發(fā)白為止，防止農桿菌污染；轉移愈傷組織至含5 mg·L-1潮霉素篩選培養(yǎng)基初步篩選抗性愈傷組織30 d左右，再將愈傷組織轉移至含30 mg·L-1潮霉素進行繼代培養(yǎng)約60 d；最后將新長出的抗性愈傷組織在10 mg·L-1潮霉素下進行抗性愈傷組織分化約30～60 d，并將誘導出的芽繼代培養(yǎng)約60～90 d。從農桿菌侵染愈傷組織至產生抗性幼苗需要約7～9個月時間。

圖1 農桿菌介導的山蒼子遺傳轉化流程Fig. 1 Agrobacterium mediated genetic transformation process of L. cubeba

陽性苗的驗證首先采用PCR檢測目的基因的方法，共檢測了16株抗性幼苗，利用第1對和第2對引物均擴增出目的條帶，送北京擎科生物科技有限公司測序拼接后，與插入基因和載體的序列比對完全正確和無移碼突變，表明目的基因已插入山蒼子基因組中（圖2）。且通過第3對引物擴增未擴增出條帶，說明沒有農桿菌質粒的干擾，排除了假陽性的存在（圖2）。共計轉化了300個左右愈傷組織，得到約80個抗性愈傷，共2個愈傷分化，得到38株幼苗，轉化率為0.67%。

圖2 轉基因幼苗的PCR鑒定Fig. 2 PCR identification of transgenic plants

PCR結果主要是利用特異性引物的聚合酶鏈式反應，可能存在一定的假陽性。而Southern雜交法是當前鑒定外源基因整合及表達的權威方法，具有靈敏性高、特異性強、假陽性低的優(yōu)點。因此，通過Southern雜交試驗進一步驗證目的基因是否插入山蒼子基因組中。結果表明，轉化的抗性愈傷組織中有陽性條帶，外源基因已插入山蒼子基因組中（圖3）。

圖3 轉基因愈傷組織Southern鑒定Fig. 3 Southern identification of transgenic callus

3 討論

3.1 高效穩(wěn)定的山蒼子組培再生體系

山蒼子育種主要以提高果實產量及其品質為目標，利用遺傳轉化技術能將外源目的基因導入山蒼子中進行遺傳改良，有助于提高果實產量和品質，創(chuàng)制新的優(yōu)良種質資源。山蒼子全基因組測序的完成，對全面解析和利用山蒼子基因分子生物學功能具有重要意義[4]。目前山蒼子轉基因體系尚未建立，高效穩(wěn)定的離體再生體系又是影響遺傳轉化成功的一個重要因素。已有文獻報道中愈傷分化率較低，易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象且不穩(wěn)定，不利于開展山蒼子基因功能的研究[24]。因此，本研究優(yōu)化了莖段組織離體再生過程并初步建立山蒼子遺傳轉化流程。

不同植物再生效率具有較大差異，可通過調整激素的種類及配比促進植株再生[25-26]。細胞分裂素能增強細胞的分裂與膨大，生長素促使細胞的伸長，當細胞分裂素/生長素比例較高時能促進芽的分化，比例適中有利于愈傷組織的誘導與苗的生長，比例較低時促進根的生長[27-29]。先前研究表明，山蒼子愈傷組織誘導最適激素比例6-BA∶IBA為20∶1[24]。本試驗結果中也得到證實，6-BA濃度低于1.0 mg·L-1時愈傷組織生長較差，6-BA∶IBA比例在10∶1至20∶1時能誘導愈傷組織且正常生長繁殖。當降低IBA濃度使細胞分裂素/生長素比例達到200∶1時愈傷組織開始分化形成不定芽，而低于此比例愈傷不分化。因此，山蒼子愈傷組織誘導生長培養(yǎng)基6-BA濃度采用2.0 mg·L-1，IBA濃度采用0.1 mg·L-1，在愈傷分化階段應提高6-BA∶IBA的比值，采用2.0 mg·L-16BA和0.01 mg·L-1IBA濃度。TDZ是一種多功能性人工合成的植物類激素，能誘導芽和愈傷組織的形成與增殖，促進體細胞胚的發(fā)生，降低褐化，被廣泛應用于木本植物組織培養(yǎng)[30-31]。山蒼子愈傷組織分化較困難，長期培養(yǎng)易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。先前山蒼子組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，僅添加6-BA和IBA的激素組合，愈傷組織不能保持持續(xù)的增殖繼代，而本研究中添加0.05～0.50 mg·L-1濃度范圍的TDZ后能有效地保存愈傷組織的繼代繁殖能力，褐化現(xiàn)象降低。同時，只有在TDZ存在時，愈傷組織才能分化出不定芽，表明TDZ是一種對山蒼子高效再生的激素，在遺傳轉化過程中發(fā)揮重要作用。

不定芽生根是組培再生過程形成完整植株的重要步驟，發(fā)達粗壯的根系有利于幼苗的移栽成活和植株的生長。細胞分裂素能抑制植株生根，而生長素有利于植株生根[32-34]。已有山蒼子組培生根文獻報道中，NAA、IBA、IAA 3種生長激素不同組合均能誘導生根，但生根過程中植株下部葉片脫落，基部有愈傷形成，根數(shù)量少且形成一個長的主根，移栽成活率低[11-12,35-36]。本研究3種激素試驗發(fā)現(xiàn)，IAA有助于山蒼子不定芽生根，單獨添加IAA誘導生根率達97.33%，且較少有葉片的衰老掉落現(xiàn)象。這可能是誘導生根過程中，在不定芽底部產生傷口后，添加高活性生長素NAA、IBA誘導了愈傷組織形成，阻礙整個植株吸收培養(yǎng)基養(yǎng)分，表現(xiàn)出葉片掉落，甚至出現(xiàn)植株死亡的現(xiàn)象（活性NAA>IBA>IAA）。試驗中基本無側根產生，但移栽穴盆1個月后能產生大量的側根，形成發(fā)達的根系。原因可能是植物具有適應環(huán)境的能力，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分比在土壤中更易吸收，不需要產生更多的側根吸收營養(yǎng)來保證植株的正常生長發(fā)育，或由于培養(yǎng)基中某種元素成分相對豐富抑制了側根的發(fā)育，具體原因有待研究。同時存在誘導生根過程中過小的苗大部分死亡，過大組培苗也不能誘導生根的現(xiàn)象，且移栽成活率不高。因此，應充分考慮植株大小、生根時間和移栽過程，提高植株存活率。

3.2 山蒼子遺傳轉化體系的建立

遺傳轉化過程中抗生素臨界濃度的選擇十分重要?？股貪舛冗^高不利于愈傷組織的分化及芽的正常生長，過低不能有效篩選出抗性植株。頭孢霉素對農桿菌抑制范圍一般選擇在200～500 mg·L-1[37-39]。本試驗中，發(fā)現(xiàn)頭孢霉素濃度在500 mg·L-1時愈傷組織顏色較深綠，成熟過早不利于愈傷的分化。200～300 mg·L-1濃度范圍愈傷組織與不添加頭孢霉素無顯著性差異，因此選擇頭孢霉素濃度300 mg·L-1作為農桿菌臨界濃度，但后期步驟中應不斷降低濃度，減少頭孢霉素對愈傷分化增殖的影響。

潮霉素能顯著抑制非轉化植株的生長，假陽性低，被廣泛應用于遺傳轉化體系中，且隨轉化過程不斷調整抗生素濃度，以達到最佳轉化目的。大多數(shù)文獻報道中，一般采用先高后低的原則，即先使用高濃度潮霉素最大程度地殺死非轉化細胞，降低后期篩選的工作量，保證極少的嵌合體存在。而后因潮霉素不斷累積毒害作用，應適當降低潮霉素濃度，保證愈傷分化及芽的生長[40-43]。本試驗前期預實驗結果發(fā)現(xiàn)，在篩選培養(yǎng)初期階段，由于采用高濃度的潮霉素和農桿菌對愈傷的雙重毒害，愈傷褐化嚴重，并局部出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象，轉化的愈傷已不能存活。因此，在高濃度潮霉素篩選前，先采用5 mg·L-1低濃度潮霉素預篩選7～10 d左右，保證已轉化愈傷的正常生長，再使用30 mg·L-1高濃度潮霉素進行篩選，愈傷20～30 d后有抗性愈傷的產生。

在遺傳轉化過程中，外源基因導入植物細胞的頻率較低，通常只有小部分細胞獲得了外源DNA，而目的整合到基因組并實現(xiàn)表達的轉化細胞則更少。必須采用多種方法反復印證，才能精確篩選和鑒定出轉基因植株，包括基因組、轉錄、翻譯水平上的檢測。PCR檢測具有方便快速、需求更少樣本進行轉基因植株驗證的優(yōu)點。本試驗前期采用PCR方法對插入片段進行檢測，較準確地篩選出陽性植株且測序驗證，并大概率排除了農桿菌殘留的污染。但PCR檢測仍可能存在假陽性，某些未轉化植株操作在DNA提取過程中的污染也能擴增出相應的片段。Southern雜交法是進行核酸序列分析、重組子鑒定及檢測外源基因整合表達的有力手段，具有靈敏性高、特異性強的特點，可清除操作過程中的污染以及轉化愈傷組織中質粒殘留所引起的假陽性信號[44-45]。本研究中，通過Southern雜交方法檢測到陽性條帶，證實了目的基因已插入山蒼子基因組中。山蒼子是一種次生代謝產物豐富的木本油料植物，在遺傳轉化過程中極易產生褐化導致遺傳轉化困難，轉化效率較低。因此，后續(xù)將進一步提高農桿菌轉化效率，如侵染農桿菌菌液濃度、時間、共培養(yǎng)時間及AS濃度的條件優(yōu)化，尤其在遺傳轉化過程中減少愈傷組織褐化方面進行重點研究。

4 結論

植物組培再生體系和遺傳轉化體系是培育優(yōu)良種質資源的重要基礎。本研究優(yōu)化了山蒼子組培再生體系，愈傷分化率為16.67%～36.67%，生根率為97.33%。對農桿菌介導的山蒼子遺傳轉化體系進行初步研究，確定了遺傳轉化過程中最適頭孢霉素和潮霉素濃度，且已成功將目的基因導入山蒼子基因組中，初步建立山蒼子遺傳轉化體系，為進一步開展基因功能研究及遺傳改良提供了技術支持。