王可堯，任仙娥，楊鋒，黃永春，張昆明，劉純友，黃承都

(廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)營養(yǎng)價值高且不含膽固醇，因其具有良好的理化性質(zhì)和加工特性而被充分應用于食品工業(yè)中[1-3]。豌豆分離蛋白(pea protein isolate，PPI)生物價高，富含促進人體肌肉增長的賴氨酸和可以提鮮調(diào)味的谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸[4]，其亞基組成和SPI相似，且不含過敏原，但因PPI功能性較SPI差，且SPI在植物蛋白中優(yōu)勢較多，其在食品領(lǐng)域中利用率低[5]，因此考慮在PPI中添加有較好功能特性的SPI，制備出一種低脂、低膽固醇和高營養(yǎng)價值的SPI和PPI復合熱促凝膠。熱促凝膠的形成大致分為三步:首先,在一定強度的熱處理后，蛋白分子間共價鍵或次級鍵遭到破壞，亞基逐漸去折疊，功能基團暴露；其次,蛋白分子間彼此靠近，通過分子間相互作用發(fā)生聚集；最后,聚集的蛋白相互交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[6]。

SPI和PPI作為植物蛋白中應用最為廣泛的兩種蛋白質(zhì)，將兩者共混應用于植物基食品的開發(fā)中有利于提高食品的總營養(yǎng)價值，為消費者提供健康新選擇。本文以植物混合蛋白凝膠為模型研究不同蛋白濃度和不同比例下(11%、14%、17%)復合SPI和PPI熱促凝膠特性，利用流變儀模擬凝膠形成的全過程，利用質(zhì)構(gòu)儀測定其成膠強度，通過凝膠的持水率結(jié)果來判斷凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的優(yōu)良程度。研究在17%濃度下復合熱促凝膠的分子間作用力大小和類型，探索凝膠結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異的原因，最后利用掃描電子顯微鏡來觀察其微觀結(jié)構(gòu)差異，從而為設計植物基食品的結(jié)構(gòu)和功能提供理論指導，為開發(fā)新類型不同種類植物基食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白含量≥90%)：山東禹王生態(tài)實業(yè)有限公司；豌豆分離蛋白(蛋白含量≥80%)：煙臺雙塔食品股份有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

MCR 72旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利Anton Paar有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司；JXN-26高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特股份有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司；LGJ-10D臺式冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；Phenom ProX掃描電子顯微鏡 上海復納科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 復合凝膠流變學分析

配制蛋白濃度分別為11%、14%、17%，蛋白質(zhì)比例(SPI和PPI的比例)分別為1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1的SPI和PPI混合蛋白溶液，使用2 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，磁力攪拌2 h，使其充分溶解。

采用旋轉(zhuǎn)流變儀模擬凝膠形成全過程。選用PP50平行板(直徑50 mm；間隙值1 mm)，上樣后刮除多余液體，在轉(zhuǎn)子四周滴加硅油以防止溫度過高使水分蒸發(fā)。整個過程中溫度掃描參數(shù)為：1 Hz和應變0.5%，以2 ℃/min的速度從25 ℃升高至95 ℃，然后在95 ℃下保溫30 min，再以2 ℃/min的速度降溫至25 ℃，記錄儲能模量(G′)和損耗模量(G″)隨時間和溫度的變化情況[7]。

1.3.2 復合熱促凝膠的制備

將上述配制好的混合蛋白溶液分裝至玻璃瓶中，封上蓋子，于恒溫水浴鍋中95 ℃熱處理30 min，冰水浴冷卻到室溫后，于4 ℃過夜保存，測試前需于室溫下放置30 min。

1.3.3 復合凝膠強度的測定

利用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀對制得的凝膠樣品進行凝膠強度測定。條件設定為：探頭類型P/0.5；測試前速度5.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s和測試后速度5.0 mm/s；觸發(fā)力為3 g。探頭下壓至10 mm時出現(xiàn)的最大的力定義為凝膠強度。

1.3.4 復合凝膠持水率的測定

稱取約5 g復合凝膠樣品裝入10 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速10000 r/min離心10 min，用濾紙小心吸出離心后樣品瀝出的水分，稱取重量，持水率計算公式為：

式中：W1為樣品質(zhì)量(g)，A為蛋白濃度，W2為樣品瀝出水分后的質(zhì)量(g)。

1.3.5 復合凝膠分子間作用力的測定

參照Tanger等[8]的測定方法，并稍作調(diào)整。用大蒜壓榨器將蛋白濃度為17%的復合凝膠樣品壓碎，分別稱取0.5 g樣品于三角燒瓶中，加入20 mL S1(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.5)，置于恒溫搖床中振蕩1 h使其充分溶解，于10000 r/min離心15 min得上清液；取沉淀加入20 mL S2(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液+2 g/L SDS，pH 7.5)振蕩、離心后得上清液；再取沉淀加入20 mL S3(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液+2 g/L SDS+15 g/L二硫蘇糖醇，pH 7.5)振蕩、離心后得上清液，向上述各步離心后所得上清液中加入20 mL 20 g/dL的三氯乙酸，離心取沉淀加入1 mol NaOH溶解，離心得上清液，采用福林酚比色法測定其可溶性蛋白質(zhì)含量。溶解于S1的蛋白質(zhì)含量代表靜電作用的貢獻，溶解于S2的蛋白質(zhì)含量代表疏水相互作用的貢獻，溶解于S3的蛋白質(zhì)含量代表二硫鍵的貢獻。

1.3.6 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

將17%的復合凝膠樣品冷凍干燥后取小塊顆粒，使用導電雙面膠將其固定在樣品臺上，通過離子濺射噴金處理，噴金時間為20 s。噴金結(jié)束后，將樣品臺放入掃描電子顯微鏡后對凝膠微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)進行觀察記錄。測試條件為加速電壓10 kV，放大倍數(shù)300倍。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

文中實驗數(shù)據(jù)均重復3組，每組至少3個平行。通過SPSS 22.0軟件Duncan檢驗法進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，實驗結(jié)果以平均數(shù)±標準差的形式表示，圖片通過Origin 8.0軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合凝膠流變學性質(zhì)

儲能模量G′代表固體性質(zhì)，與凝膠彈性有關(guān)；損耗模量G″代表液體性質(zhì)，與凝膠黏性相關(guān)[9]。11%、14%和17%濃度下不同蛋白比例的SPI和PPI復合蛋白熱促凝膠形成曲線隨時間和溫度的變化情況見圖1。

圖1 SPI與PPI復合凝膠流變學

由圖1可知，在升溫-保溫-降溫的熱循環(huán)過程中，復合蛋白的G′和G″變化趨勢基本一致。

在11%、14%和17%濃度下，SPI和PPI的比例為1∶0和3∶1時，以及在14%和17%濃度下，SPI和PPI的比例為1∶1時，復合凝膠的G′值始終大于G″值，且在升溫過程中，G′和G″表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，此過程包括凝膠形成、凝膠消弱和凝膠提高3個階段[10]。由于SPI黏度大，一開始G′值就大于G″值，表現(xiàn)出固體性質(zhì)。隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間和蛋白質(zhì)與水之間的氫鍵斷裂，體系的黏度下降，因此，G′值和G″值隨溫度的增加反而不斷下降。PPI的變性溫度大約在75～85 ℃，而SPI的變性溫度在85～95 ℃，在保溫階段，95 ℃已達到SPI和PPI完全失活溫度，復合蛋白的高級結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團、巰基、二硫鍵等基團暴露，蛋白分子間交聯(lián)聚集轉(zhuǎn)變?yōu)楦佑行虻哪z網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，G′值和G″值持續(xù)增加。在降溫階段，隨著溫度的下降，凝膠結(jié)構(gòu)G′值和G″值持續(xù)增加，凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)進一步穩(wěn)固。

在11%濃度下，SPI和PPI蛋白比例為1∶1時，在14%濃度下，蛋白比例為1∶3時，以及在17%濃度下，蛋白比例為1∶3和0∶1時，體系初始的G′小于G″，這可能是因為隨著豌豆蛋白比例的增加，體系的黏度降低。隨著溫度的升高，G′增加的速度大于G″，G′和G″出現(xiàn)交點，標志著三維網(wǎng)絡開始建立，此時的溫度和時間被稱為成膠溫度和成膠時間。隨后，G′開始大于G″，蛋白分子間發(fā)生聚集交聯(lián)，模量增加，凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)不斷加強，在該階段二硫鍵促進分子間重排，形成穩(wěn)固的凝膠結(jié)構(gòu)。在降溫階段，凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)主要由氫鍵來維持，較低溫度下有利于氫鍵的形成，G′和G″持續(xù)增加。

在11%濃度下，當SPI和PPI蛋白比例為1∶3和0∶1時，以及在14%濃度下，蛋白比例為0∶1時，G″值一直處于大于G′值的狀態(tài)，凝膠未形成，此時的濃度未達到形成凝膠的濃度。在不同濃度下，隨著蛋白濃度的增加，同一比例下最終形成凝膠的儲能模量值不斷增加。在不同的比例下，隨著PPI的增加，最終形成凝膠的儲能模量值不斷下降，這可能是由于PPI稀釋了有較強SPI凝膠的G′值，說明SPI凝膠樣品相比PPI凝膠具有較高的類固體性質(zhì)，因此可通過調(diào)控不同的SPI和PPI濃度及比例，降低PPI的成膠濃度。

2.2 復合凝膠強度的測定

分析不同蛋白濃度下SPI和PPI以不同比例混合形成的復合熱促凝膠強度，結(jié)果見表1。

表1 SPI 與PPI復合熱促凝膠強度(g)

由表1可知，隨著蛋白濃度的增加，凝膠強度顯著升高(P<0.05)；同一濃度下，隨著PPI比例的增加，凝膠強度顯著下降(P<0.05)。蛋白濃度是熱促凝膠形成的決定性因素之一[11]，蛋白濃度越高，凝膠強度越大，其原因主要是隨著蛋白濃度的增加，熱誘導可暴露更多的活性基團數(shù)目，提高了蛋白分子間交聯(lián)聚集的機會，因此形成了更致密的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，凝膠強度也隨之增大[12]，這與流變最終的儲能模量測定結(jié)果一致。對于SPI，僅通過熱處理方式自發(fā)形成凝膠的蛋白臨界濃度為8%，而對于PPI，形成凝膠所需的最低蛋白濃度為16%[13]，當?shù)陀谧畹统赡z蛋白濃度時，蛋白樣品僅靠加熱的方式無法形成凝膠。因此，當?shù)鞍诐舛葹?1%、SPI和PPI蛋白比例為1∶3和0∶1時，以及蛋白濃度為14%、SPI和PPI蛋白比例為0∶1時，復合蛋白不能通過熱處理自發(fā)成膠。當復合蛋白濃度為17%時，均能形成熱不可逆的凝膠樣品。此外，在不同比例下，由于PPI含硫氨基酸含量較SPI少[14]，SPI對復合體系凝膠強度起主要作用，隨著PPI添加量的增大，稀釋了有較強凝膠特性的SPI，凝膠強度不斷降低。

2.3 復合凝膠持水率分析

持水率是指蛋白凝膠網(wǎng)絡有效固定水分子的能力強弱，是反映凝膠網(wǎng)絡優(yōu)良的重要指標[15]。不同蛋白比例和蛋白濃度下復合熱促凝膠的持水率見表2。

表2 SPI與PPI復合熱促凝膠持水率(%)

由表2可知，隨著蛋白濃度的增加，凝膠持水率變化趨勢與儲能模量、凝膠強度結(jié)果一致，說明蛋白濃度的增加使蛋白分子間交聯(lián)密切，有利于形成致密的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，而凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)越致密、有序，持水率越高。單一SPI凝膠在11%、14%和17%濃度下和復合SPI和PPI在蛋白濃度為14%和17%、蛋白比例為3∶1時，持水率均接近100%，說明在高濃度下SPI和少量添加PPI形成的凝膠結(jié)構(gòu)十分致密，在高速離心力作用下不受破壞，幾乎沒有水分滲出。隨著PPI比例的持續(xù)增加，復合凝膠持水率顯著降低(P<0.05)。一方面可能是由于PPI的溶解度低于SPI[16]，PPI在形成凝膠網(wǎng)絡時不易更好地結(jié)合水分子，因此持水率下降。另一方面，PPI比SPI含硫氨基酸含量少，形成的凝膠強度低，因此凝膠結(jié)構(gòu)持水率低于SPI。

2.4 復合凝膠形成的分子間作用力分析

形成和維持蛋白質(zhì)熱促凝膠的主要作用力包括靜電作用、疏水相互作用等非共價鍵和二硫共價鍵[17]，分子間作用力的大小、類型不同凝膠結(jié)構(gòu)性質(zhì)也會有所差異[18]。通過添加不同的變性劑，采用逐步溶解的方法，測得上清液中蛋白質(zhì)的溶解性大小，可間接反映維持凝膠穩(wěn)定的靜電作用、疏水相互作用和二硫鍵大小[19]。17%蛋白濃度下復合凝膠形成的分子間作用力結(jié)果見圖2。

圖2 SPI與PPI復合凝膠分子間作用力

由圖2可知，靜電作用隨著PPI蛋白比例的增高而顯著升高(P<0.05)；疏水相互作用先升高后降低，在SPI和PPI的比例為1∶3時達到最大；二硫鍵顯著降低(P<0.05)。在熱誘導中，二硫鍵是維持SPI凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的主要作用力，靜電作用和疏水相互作用對維持PPI凝膠網(wǎng)絡貢獻較大，因此SPI形成的凝膠結(jié)構(gòu)較PPI更為穩(wěn)固。靜電作用隨著PPI含量的增加不斷增大，在pH 8.0實驗條件下，pH遠離SPI和PPI蛋白等電點，蛋白質(zhì)表面帶有大量的凈負電荷，此時靜電斥力占主導，蛋白質(zhì)間難以聚集成膠，當靜電斥力與吸引力主要是疏水相互作用達到平衡時，才有可能形成凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，而當引力大于斥力時，形成高度脫水收縮的不透明凝膠結(jié)構(gòu)。在熱處理過程中，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)打開，疏水基團暴露，疏水相互作用增強，隨著PPI比例的增加，疏水相互作用顯著增高(P<0.05)，可能是由于PPI中疏水性氨基酸的含量高于SPI[20]，但單一PPI蛋白凝膠疏水相互作用略有降低，可能是由于95 ℃遠高于PPI的變性溫度，蛋白聚集程度增高，一部分的疏水基團因聚集作用重新被包埋在蛋白分子內(nèi)，導致疏水相互作用有所降低。二硫鍵是形成蛋白凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的主要作用力，二硫鍵隨著PPI含量的增加不斷降低，可能是由于PPI含硫氨基酸含量小于SPI，此結(jié)果導致PPI凝膠儲能模量、硬度和持水率均小于SPI。

2.5 復合凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

利用掃描電子顯微鏡對17%蛋白濃度下凝膠微觀結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果見圖3。

圖3 SPI與PPI復合凝膠微觀結(jié)構(gòu)

由圖3可知，不同比例下凝膠的微觀結(jié)構(gòu)有較大的差異。SPI凝膠表面質(zhì)密、孔洞均勻，蛋白質(zhì)分子間從各個角度進行交聯(lián)，相互交織，形成穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)。當SPI和PPI的比例為3∶1時，凝膠孔徑變大，說明少量PPI的加入導致SPI凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)變差。當SPI和PPI的比例為1∶0和3∶1時，凝膠微觀結(jié)構(gòu)立體感更強，可能導致凝膠強度、持水率更好。隨著PPI組分的增加，凝膠結(jié)構(gòu)越趨于片層狀，形成不規(guī)則的斷層，使總體結(jié)構(gòu)顯得粗糙。分析不同比例下凝膠微觀結(jié)構(gòu)差異的原因，可能是隨著PPI比例的增加，維持凝膠分子間作用力的不同，主要是二硫鍵含量的減少，導致凝膠質(zhì)地變差。

3 結(jié)果與討論

本文以SPI和PPI為原料，通過對11%、14%和17%濃度下復合熱促凝膠特性的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白濃度越高，儲能模量、凝膠強度和持水率越高。同時，兩種植物蛋白的凝膠性差異較大，隨著PPI比例的增加，復合蛋白最終形成凝膠的儲能模量、凝膠強度和持水率呈不斷下降的趨勢，形成的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)質(zhì)地越來越松散、零碎，蛋白間交聯(lián)度減弱，凝膠性能逐漸變差。分析復合熱促凝膠分子間作用力發(fā)現(xiàn)疏水相互作用和二硫鍵對SPI凝膠貢獻較大，靜電作用和疏水相互作用對PPI凝膠貢獻較大，分子間作用力的類型不同暗示著SPI和PPI凝膠性能不盡相同，因此通過在PPI中添加SPI可提高PPI的凝膠特性，提高PPI在食品工業(yè)中的利用率，同時也為不同植物基蛋白產(chǎn)品的復配研究提供了理論依據(jù)。