黃建蓉，李秋萌，姚逸澄，宋豐林，徐金瑞，王志江，侯方麗

(廣東藥科大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，廣東 中山 528453)

美拉德反應(yīng)在食品加工中廣泛存在，除賦予產(chǎn)品獨(dú)特的色、香、味外，還能產(chǎn)生有益的生物活性物質(zhì)，增強(qiáng)食品的抗氧化活性[1-3]。面包、蛋糕、餅干等焙烤食品在高溫烘焙階段發(fā)生美拉德反應(yīng)，對(duì)于產(chǎn)品的色澤和風(fēng)味發(fā)揮著重要作用，其反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性值得關(guān)注。焙烤食品生產(chǎn)常用牛乳或乳粉、果葡糖漿等為原料，其中所含的酪蛋白與果糖或葡萄糖在高溫條件下即可以發(fā)生美拉德反應(yīng)，本文研究了在常用的烘焙工藝條件下，酪蛋白-葡萄糖體系發(fā)生美拉德反應(yīng)得到的產(chǎn)物的抗氧化活性，并與茶多酚和蘆丁的抗氧化活性進(jìn)行比較，可為進(jìn)一步探討焙烤食品的抗氧化活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

酪蛋白(分析純)：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖(分析純)：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；茶多酚(純度≥98%)、蘆丁(純度≥95%)、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ，純度≥98.5%)：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；三氯化鐵、硫酸亞鐵、無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水乙醇(均為分析純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；冰醋酸(分析純)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；鹽酸(分析純)：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SC-80C全自動(dòng)色差計(jì) 北京康光光學(xué)儀器有限公司；AE124C電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DGX-9053B-2干燥箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 上海亞榮生化儀器廠；SB-25-12DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)提取物制備

按照3∶1的比例稱(chēng)取酪蛋白和葡萄糖，并按二者總質(zhì)量的15%加入蒸餾水混合均勻，以模擬真實(shí)焙烤食品體系烘烤前的配料組成狀態(tài)，置于蒸發(fā)皿中，在130 ℃烘烤30 min。反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻至室溫，用SC-80C色差計(jì)的反射樣品測(cè)定模式檢測(cè)反應(yīng)前后體系的色差值L*、a*、b*，并根據(jù)下式計(jì)算總色差△E。

△E=(△L*2+△a*2+△b*2)1/2。

式中：L*表示亮度數(shù)值；a*表示紅色到綠色兩種原色之間的變化區(qū)域；b*表示黃色到藍(lán)色兩種原色之間的變化區(qū)域；△L*表示明度差異；△a*表示紅/綠差異；△b*表示黃/藍(lán)差異。

酪蛋白-葡萄糖反應(yīng)混合物加入適量蒸餾水或60%乙醇超聲提取10 min，然后全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中，按混合物質(zhì)量∶定容體積為1∶10的比例用相應(yīng)溶劑定容，經(jīng)過(guò)濾分別得到酪蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)水提物溶液和醇提物溶液。取一定量的提取物溶液真空冷凍干燥至恒重，稱(chēng)量計(jì)算得到溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.3.2 紫外可見(jiàn)吸收光譜分析

紫外可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定參考文獻(xiàn)[4]的方法并略作調(diào)整。酪蛋白-葡萄糖MRPs水提物溶液稀釋5倍，醇提物溶液稀釋10倍，分別以蒸餾水和60%乙醇為基線，在250～500 nm范圍掃描溶液紫外可見(jiàn)吸收光譜，此為反應(yīng)后光譜。以未經(jīng)烘烤的酪蛋白-葡萄糖體系為對(duì)照，按1.3.1中制備MRPs提取物溶液的方法制備對(duì)照液，同法掃描紫外可見(jiàn)吸收光譜，即為反應(yīng)前光譜。

1.3.3 熒光光譜分析

熒光光譜的測(cè)定參考文獻(xiàn)[5]的方法并略作調(diào)整。設(shè)置熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，熒光激發(fā)波長(zhǎng)345 nm，掃描360～560 nm發(fā)射光譜。按1.3.2項(xiàng)方法制備光譜掃描用樣液，分別得到反應(yīng)前后MRPs水提取和醇提物熒光光譜圖。

1.3.4 總抗氧化能力測(cè)定——FRAP法

參考文獻(xiàn)[6]的方法并略作調(diào)整。將0.2 mol/L pH 3.6的醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1(體積比)混合，攪拌均勻得FRAP工作液。

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將1 mmol/L 的FeSO4溶液稀釋5倍，分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL于9支試管中，用蒸餾水補(bǔ)至2 mL；加入3 mL FRAP工作液，混勻；于37 ℃反應(yīng)10 min，在593 nm 處測(cè)定吸光度。以FeSO4溶液濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線。

MRPs水提物總抗氧化能力測(cè)定：將水提物原液分別稀釋10，20，30，50，100倍，分別取2 mL于5支試管中，各加入3 mL FRAP工作液，混勻；于37 ℃反應(yīng)10 min，在593 nm 處測(cè)定吸光度。將吸光度代入FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到FeSO4濃度(mmol/L)，以FeSO4濃度數(shù)值表示FRAP值。FRAP值越大，總抗氧化能力越強(qiáng)。

茶多酚總抗氧化能力測(cè)定：配制濃度為26.7 mg/mL的茶多酚水溶液，分別稀釋20，25，30，35，40，45，50倍，同法測(cè)定茶多酚FRAP值。

MRPs醇提物總抗氧化能力測(cè)定：將醇提物分別稀釋10，20，30，50，100倍，同法測(cè)定醇提物FRAP值。

蘆丁總抗氧化能力測(cè)定：用60%乙醇配制濃度為25 mg/mL的蘆丁溶液，分別稀釋2，2.5，3，3.5，4，4.5，5倍，同法測(cè)定蘆丁FRAP值。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[7-8]的方法并略作調(diào)整。將MRPs水提物分別稀釋2.5，5，8，10，15，20倍，加上原液一共7個(gè)濃度梯度。各取1 mL至7支具塞試管中，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液，搖勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，記為Ai。另取7支試管，分別加入1 mL 7個(gè)濃度梯度的樣液和2 mL無(wú)水乙醇，搖勻，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，記為Aj。另取1支試管，加入1 mL蒸餾水和2 mL 0.1 mmol/L的DPPH·乙醇溶液，搖勻，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，記為A0。用下式計(jì)算DPPH·清除率。

清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100。

茶多酚DPPH·清除率的測(cè)定：將26.7 mg/mL茶多酚分別稀釋5，8，10，20，25，30，40，50，100倍，加上原液一共10個(gè)濃度梯度。同法測(cè)定和計(jì)算茶多酚對(duì)DPPH·的清除率。

MRPs醇提物DPPH·清除率的測(cè)定：將MRPs醇提物分別稀釋2.5，5，8，10，15，20倍，加上原液一共7個(gè)濃度梯度。同法測(cè)定和計(jì)算MRPs醇提物對(duì)DPPH·的清除率。

蘆丁DPPH·清除率的測(cè)定：將25 mg/mL的蘆丁60%乙醇溶液，分別稀釋1.67，2.5，5，25，50，250，500倍，加上原液一共8個(gè)濃度梯度。同法測(cè)定和計(jì)算蘆丁對(duì)DPPH·的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系建立

2.1.1 酪蛋白-葡萄糖體系反應(yīng)前后色澤變化

酪蛋白-葡萄糖(3∶1)反應(yīng)前色差參數(shù)L*=86.15、a*=-0.83、b*=10.33，經(jīng)過(guò)130 ℃烘烤30 min后，色差參數(shù)L*=60.02、a*=14.99、b*=33.31，反應(yīng)后明度值L*明顯減小，紅綠值a*、黃藍(lán)值b*明顯增大，反應(yīng)后與反應(yīng)前色差△E=31.34。烘烤對(duì)美拉德反應(yīng)的發(fā)生有重要作用，食品色澤的改變是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物生成的宏觀體現(xiàn)，色差參數(shù)值的變化可以作為判斷美拉德反應(yīng)進(jìn)程的依據(jù)之一。在該焙烤條件下，酪蛋白與葡萄糖發(fā)生了明顯的美拉德反應(yīng)，使得體系褐變，顏色發(fā)生了明顯變化。

2.1.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物提取液制備

按照1.3.1項(xiàng)方法，得到MRPs水提液濃度為25.55 mg/mL，MRPs醇提液濃度為25.90 mg/mL。

2.2 酪蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物光譜分析

2.2.1 紫外可見(jiàn)吸收光譜

研究表明[9-11]，大多數(shù)美拉德反應(yīng)在紫外區(qū)294 nm附近都有特征光吸收，而且294 nm光吸收在顏色形成前出現(xiàn)，此處的吸收是美拉德反應(yīng)中間階段通過(guò) Strecker裂解產(chǎn)生的酮類(lèi)、醛類(lèi)等無(wú)色小分子中間物，這些物質(zhì)作為美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物與熒光化合物相比穩(wěn)定很多，是褐色素形成的前體，其主要為吡喃、呋喃、吡啶、糠醛等及其衍生物，此處的吸光強(qiáng)度可間接反映無(wú)色小分子物質(zhì)的產(chǎn)生情況，吸光度值越大，中間產(chǎn)物越多。由圖1可知，MRPs水提物和醇提物均在289 nm處出現(xiàn)吸收峰，在此波段下出現(xiàn)強(qiáng)吸收，說(shuō)明該體系發(fā)生了糖類(lèi)脫水分解并且發(fā)生裂解而產(chǎn)生一些酮類(lèi)及醛類(lèi)無(wú)色小分子。在360～490 nm區(qū)間的光吸收主要是由美拉德反應(yīng)高級(jí)階段產(chǎn)生的類(lèi)黑素引起，在420 nm處吸光度值的變化可用來(lái)表征類(lèi)黑素生成程度。反應(yīng)后體系在420 nm處吸光度增加，說(shuō)明美拉德反應(yīng)高級(jí)階段產(chǎn)物的生成，吸光度的變化體現(xiàn)出反應(yīng)的褐變程度。

圖1 酪蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)前后紫外可見(jiàn)吸收光譜

2.2.2 熒光光譜

一些在美拉德反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的小分子熒光物質(zhì)，其典型光譜特征為激發(fā)波長(zhǎng)340～370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420～440 nm[12]。美拉德反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度與紫外光吸收強(qiáng)度的發(fā)展表現(xiàn)為不同的動(dòng)力學(xué)行為，所以熒光小分子物質(zhì)被認(rèn)為是不同于具有紫外光吸收物質(zhì)的小分子產(chǎn)物，熒光中間小分子體比無(wú)色中間體反應(yīng)活性更高，更易參與高級(jí)階段合成類(lèi)黑素等物質(zhì)。由圖2可知，在激發(fā)波長(zhǎng)為345 nm時(shí)，MRPs水提物和醇提物最強(qiáng)熒光發(fā)射波長(zhǎng)在426 nm處，符合美拉德反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的特征。

圖2 酪蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)前后熒光光譜

與反應(yīng)前的水提物相比，反應(yīng)前醇提物出現(xiàn)了較強(qiáng)熒光，原因在于乙醇和水作為常用的有機(jī)溶劑，本身都不具有熒光特性，但當(dāng)乙醇分子與水分子結(jié)合后會(huì)通過(guò)氫鍵形成閉合或者不閉合的鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)，從而具有了熒光特性[13-14]，因此在413 nm處出現(xiàn)了60%乙醇水溶液的熒光峰。由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有熒光特性，反應(yīng)后提取物熒光強(qiáng)度明顯增大，反應(yīng)后醇提物在413 nm處的熒光峰消失，熒光峰出現(xiàn)在美拉德產(chǎn)物特征峰426 nm的位置。

2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性

2.3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物總抗氧化能力

總抗氧化能力測(cè)定FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。以y表示593 nm處的吸光度，x表示FeSO4濃度(mmol/L)，得到線性回歸方程y=6.415x+0.1249(R2=0.9952)，在0.02～0.18 mmol/L范圍內(nèi)吸光度與FeSO4濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖3 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖4可知，MRPs水提物、茶多酚、MRPs醇提物和蘆丁的FRAP值均隨著各自濃度的增加而增大，并呈良好的線性關(guān)系，以y表示FRAP值，x表示樣液濃度(mg/mL)，回歸方程分別為y=0.0506x+0.0116(R2=0.9969)，y=1.1305x+0.044(R2=0.9949)，y=0.0627x+0.015(R2=0.9958)，y=0.0862x+0.0089(R2=0.9668)。要達(dá)到FRAP值為0.11，MRPs水提物、茶多酚、MRPs醇提物和蘆丁所需濃度分別為1.945，0.0584，1.515，1.173 mg/mL。在1 mg/mL濃度下，MRPs水提物和MRPs醇提物的FRAP值分別為0.062和0.078。MRPs總抗氧化能力與茶多酚差距較大，與蘆丁較為接近，醇提物的總抗氧化能力略強(qiáng)于水提物。

圖4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物總抗氧化能力

2.3.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖5可知，MRPs水提物、MRPs醇提物和蘆丁對(duì)DPPH自由基的清除率均隨著各自濃度的增加而增大，在低濃度范圍內(nèi)增幅較大，在高濃度范圍內(nèi)增幅變緩，并呈良好的對(duì)數(shù)相關(guān)關(guān)系，用y表示DPPH自由基清除率(%)，x表示樣液濃度(mg/mL)，得到回歸方程分別為y=23.531ln(x)+18.522(R2=0.987)，y=21.091ln(x)+22.58(R2=0.9884)，y=13.212ln(x)+74.559(R2=0.9468)，由此計(jì)算IC50分別為3.810，3.670，0.156 mg/mL。茶多酚對(duì)DPPH自由基清除能力在0.0534～0.1335 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈線性增長(zhǎng)，線性回歸方程為y=906.54x-40.234(R2=0.9861)，濃度在0.1335～2.67 mg/mL范圍內(nèi)，清除率幾乎不變，約為80%。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算得到茶多酚IC50為0.0995 mg/mL。MRPs對(duì)DPPH自由基的清除能力與茶多酚和蘆丁差距較大，醇提物對(duì)DPPH自由基的清除能力略強(qiáng)于水提物。

圖5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除作用

3 結(jié)論

酪蛋白-葡萄糖在烘焙條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)，體系色澤發(fā)生明顯變化，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物水提物和60%乙醇提取物的紫外可見(jiàn)分光光譜圖在420 nm處吸光度比反應(yīng)前增大，在289 nm處出現(xiàn)吸收峰，熒光發(fā)射光譜峰值出現(xiàn)在426 nm處，符合美拉德反應(yīng)生成物的特征。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力與濃度均有量效關(guān)系，分別呈線性相關(guān)關(guān)系和對(duì)數(shù)相關(guān)關(guān)系，醇提物的總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力均略強(qiáng)于水提物。