萬(wàn)璐，閆佳佳，尤夢(mèng)瑤，鄭春英*

(1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080)

甘草是一種天然、低熱、安全的甜味劑[1]，含有甘草皂苷、甘草黃酮、甘草多糖等多種次生代謝產(chǎn)物[2]，具有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗病毒[5]等多種活性作用；現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于調(diào)味品、食品、醫(yī)藥等行業(yè)[6]。隨著甘草需求量的上漲及過(guò)度采挖，甘草已被列入國(guó)家《野生藥材資源保護(hù)管理?xiàng)l例》的二級(jí)保護(hù)植物[7]，盡管栽培種植在某種程度上緩解了甘草的匱乏，但甘草生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，種植戶資金回籠慢。因此，尋找生產(chǎn)甘草次生代謝產(chǎn)物的新方法已成為研究熱點(diǎn)。

植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物[8]，將甘草內(nèi)生菌作為發(fā)酵菌株，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘草次生代謝產(chǎn)物，這對(duì)開(kāi)發(fā)新資源，生產(chǎn)新型功能性調(diào)味品具有重要意義。本文以分離自甘草根部的內(nèi)生真菌GRE111為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物篩選及抑菌活性研究，并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，以便為采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘草次生代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌為內(nèi)生真菌GRE111：分離自黑龍江省大慶地區(qū)野生甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)根部；NA、PDA培養(yǎng)基的配制方法參考文獻(xiàn)[9-10]；金黃色葡萄球菌等11株受試菌：購(gòu)于黑龍江省微生物研究所；ITS序列通用引物ITS1、ITS4：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；除液相用甲醇為色譜純級(jí)別外，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FL2200型高效液相色譜儀 浙江溫嶺福立分析儀器有限公司；HZQ-C型空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

無(wú)菌條件下，取已活化的內(nèi)生真菌GRE111，加適量無(wú)菌水，制成 1×107CFU/mL種子液；取GRE111種子液，以5%(體積比)接種至裝液量為50 mL的PDA培養(yǎng)基后，置于空氣浴搖床培養(yǎng)14 d(28 ℃，140 r/min)，終止發(fā)酵，抽濾，取濾液，作為發(fā)酵液供試品備用。

1.3.2 內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分分析

內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分分析采用HPLC法。

HPLC檢測(cè)條件：Venusil XBP-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm); 流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸(85∶14∶1)；流速 1 mL/min; 柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

供試品液的制備：取1.3.1發(fā)酵液供試品10 mL，減壓回收至干(50 ℃，0.1 MPa)，加1 mL甲醇溶解后，過(guò)濾(0.22 μm微孔濾膜)，取濾液作為供試品溶液。

對(duì)照品液的制備：精密稱(chēng)取甘草次酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解后，制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液備用。

空白對(duì)照品液的制備：取PDA培養(yǎng)基10 mL，與供試品液的制備方法相同，制成空白對(duì)照品液。

HPLC分析：分別取供試品液、對(duì)照品液及空白對(duì)照品液各10 μL注入HPLC儀器。

1.3.3 內(nèi)生真菌GRE111抑菌活性分析

取1.3.1發(fā)酵液，凍干，稱(chēng)取適量，加甲醇溶解后制成0.1 mg/mL的甲醇提取物，分別以100 μg/mL鏈霉素和制霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，以甲醇溶液為空白對(duì)照，參考文獻(xiàn)[11]，采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液進(jìn)行抗菌活性分析。

1.3.4 內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵條件優(yōu)選

1.3.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

a.接種量對(duì)抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液分別按3%、4%、5%、6%、7%、8%(體積比)的比例接種到50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)14 d(28 ℃，120 r/min)，按1.3.3測(cè)定發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑菌活性(n=3)。

b.裝液量對(duì)抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量分別接入裝有20，30，40，50，60，70 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)14 d，其他操作同1.3.4.1中a。

c.初始pH值對(duì)抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)14 d，其他操作同1.3.4.1中a。

d.發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中，分別發(fā)酵培養(yǎng)8，10，12，14，16，18 d，其他操作同1.3.4.1中a。

e.搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中，分別發(fā)酵培養(yǎng)14 d，搖床轉(zhuǎn)速分別為100，120，140，160，180，200 r/min，其他操作同1.3.4.1中a。

f.發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，搖床溫度分別設(shè)定為22，24，26，28，30，32 ℃，其他操作同1.3.4.1中a。

g.碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響

分別選用0%、1%、2%、5%、10%(質(zhì)量和體積比)的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為碳源制備1.3.1中PDA培養(yǎng)基，并將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量分別接入裝有50 mL初始pH為7.0的培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)14 d，其他操作同1.3.4.1中a。觀察不同質(zhì)量濃度的碳源對(duì)抑菌活性的影響(n=3)。

h.氮源及其質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響

分別選用0%、0.5%、1%、1.5%、2%(質(zhì)量和體積比)的牛肉膏、酵母膏、蛋白胨為氮源，加入1.3.1中PDA培養(yǎng)基中，其他發(fā)酵培養(yǎng)條件同1.3.4.1中g(shù)。觀察不同質(zhì)量濃度的氮源對(duì)抑菌活性的影響(n=3)。

1.3.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果，選取碳源濃度、氮源濃度、接種量和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素作為實(shí)驗(yàn)因素，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件，因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平

1.3.5 內(nèi)生真菌GRE111的鑒定

內(nèi)生真菌GRE111形態(tài)學(xué)觀察：參考文獻(xiàn)[12]的方法，將GRE111置于平板PDA培養(yǎng)基上(28 ℃，14 d)，觀察其菌落形狀、顏色、濃密程度、培養(yǎng)基內(nèi)菌絲形態(tài)、是否產(chǎn)色素等；同時(shí)，取GRE111 PDA平板(培養(yǎng)時(shí)間3 d)，將無(wú)菌蓋玻片傾斜扦入該平板中，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后，取出，鑷取蓋玻片，置于顯微鏡下觀察，初步確定菌株的分類(lèi)地位[13]。

內(nèi)生真菌GRE111 ITS序列分析：參考文獻(xiàn)[14]的方法提取菌株GRE111 DNA，PCR產(chǎn)物純化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序工作。所測(cè)得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，利用MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定GRE111菌株的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分分析結(jié)果

采用HPLC法對(duì)內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 GRE111發(fā)酵液活性成分分析結(jié)果

由圖1可知，在內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液中含有甘草次酸，且空白對(duì)照無(wú)干擾，說(shuō)明內(nèi)生真菌GRE111為甘草次酸產(chǎn)生菌。

2.2 內(nèi)生真菌GRE111抑菌活性分析結(jié)果

對(duì)內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 GRE111抑菌活性分析結(jié)果(n=3)

由表2可知，甘草內(nèi)生真菌GRE111對(duì)10株致病菌均有一定的抑制作用，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑制作用最強(qiáng)。

2.3 內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵條件優(yōu)選結(jié)果

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 接種量對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

在不同接種量條件下，GRE111發(fā)酵液的抑菌活性結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著GRE111接種量的增加，其發(fā)酵液的抑菌活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)接種量為5%時(shí)，GRE111的抑菌活性最強(qiáng)，此后抑菌活性開(kāi)始減弱。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是隨著GRE111接種量的增加，菌株生長(zhǎng)密度增大，從而不利于抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.3.1.2 裝液量對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

不同裝液量對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同裝液量對(duì)抑菌活性的影響

由圖3可知，裝液量在20%～50%范圍內(nèi)變化時(shí)，GRE111抑菌活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)裝液量持續(xù)增加時(shí)，抑菌活性開(kāi)始減弱，這可能是由于裝液量的增加稀釋了抑菌活性物質(zhì)，從而使抑菌活性出現(xiàn)減弱的情況。

2.3.1.3 初始pH值對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

不同初始pH值對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同初始pH值對(duì)抑菌活性的影響

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵液初始pH值由4.0增至9.0時(shí)，GRE111抑菌活性出現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值為7.0時(shí)，發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為(26.71±0.04) mm左右，此后，隨著初始pH值的增加，GRE111抑菌活性開(kāi)始減弱。上述結(jié)果表明，GRE111最適初始pH值為7.0。

2.3.1.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌活性的影響

由圖5可知，GRE111的抑菌活性隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)，抑菌活性最強(qiáng)，但搖床轉(zhuǎn)速過(guò)快也會(huì)影響GRE111菌株的正常生長(zhǎng)。

2.3.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

GRE111在不同培養(yǎng)時(shí)間下的抑菌活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響

由圖6可知，在不同的發(fā)酵時(shí)間下GRE111的抑菌活性表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，這可能是由于GRE111菌株在發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，處于不同生長(zhǎng)期，使其產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的量有所不同。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為14 d時(shí)，GRE111的抑菌活性最強(qiáng)。

2.3.1.6 發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

不同發(fā)酵溫度對(duì)GRE111抑菌活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響

由圖7可知，GRE111的抑菌活性隨著發(fā)酵溫度的增加表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，28 ℃時(shí)發(fā)酵液的抑菌效果最好，此后，隨著溫度升高，發(fā)酵液的抑菌活性顯著下降，這可能是由于溫度過(guò)高不利于GRE111菌株抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.3.1.7 不同碳源對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

不同碳源對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 不同碳源質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響

由圖8可知，碳源不同，菌株GRE111的抑菌活性也不同，當(dāng)葡萄糖為碳源，且其含量達(dá)到2%時(shí)，GRE111菌株的抑菌活性最強(qiáng)，因此選用2%的葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源含量。

2.3.1.8 不同氮源對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

不同氮源對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 不同氮源質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響

由圖9可知，GRE111的抑菌活性與氮源的選擇和濃度有關(guān)。當(dāng)1%蛋白胨作為氮源時(shí)，GRE111菌株發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)，因此選用1%的蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

由表3和表4可知，影響GRE111抑菌活性的因素順序?yàn)樘荚促|(zhì)量濃度>氮源質(zhì)量濃度>接種量>發(fā)酵時(shí)間。其中碳源質(zhì)量濃度對(duì)GRE111抑菌活性的影響極顯著，氮源質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響顯著，發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性無(wú)顯著影響，GRE111的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C2D2，即碳源(葡萄糖)質(zhì)量濃度為1.0%，氮源(蛋白胨)質(zhì)量濃度為1.0%，接種量為5%(體積比)，培養(yǎng)時(shí)間為14 d。綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，GRE111的最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖2%，蛋白胨1%，裝液量50%，接種量5%，初始pH值7.0，培養(yǎng)時(shí)間14 d，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min。

分別采用最佳發(fā)酵條件及1.3.1發(fā)酵條件將內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，采用最佳發(fā)酵工藝條件培養(yǎng)GRE111后，其抑菌活性為(28.30±0.50) mm，比對(duì)照組的抑菌活性提高3.32 mm。

2.4 內(nèi)生真菌GRE111的鑒定結(jié)果

2.4.1 內(nèi)生真菌GRE111形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

GRE111菌落在培養(yǎng)7 d后，菌落直徑為7 cm左右，綠色，基質(zhì)黃色，菌落絮狀，菌絲密集，邊緣整齊，緊貼培養(yǎng)基，見(jiàn)圖10中a。GRE111產(chǎn)分生孢子，分生孢子的頂端形成掃帚狀的枝，最后一級(jí)分枝為小梗，由小梗形成鏈狀排列的分生孢子，見(jiàn)圖10中b。

a.GRE111菌落形態(tài) b.GRE111孢子顯微結(jié)構(gòu)

2.4.2 內(nèi)生真菌GRE111 ITS序列分析結(jié)果

甘草內(nèi)生真菌 GRE111 DNA,PCR擴(kuò)增后獲得1條500 bp的特異性條帶，將測(cè)序結(jié)果在 GenBank中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，然后用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖11)，內(nèi)生真菌 GRE111 序列與青霉屬產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum, No.AJ608949.1)的相似度達(dá)到了99%，序列的同源性相似度為 99%。

圖11 內(nèi)生真菌GRE111 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

綜合GRE111形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，將甘草內(nèi)生真菌GRE111鑒定為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。

3 結(jié)論

從甘草根部分離得到一株可以產(chǎn)甘草次酸的內(nèi)生真菌GRE111，甘草次酸是甘草甜素主要成分甘草酸的苷元，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種活性[15]。此外，該菌株具有較好的抑菌活性，發(fā)酵工藝經(jīng)優(yōu)化后，最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度1.0%，蛋白胨質(zhì)量濃度1.0%，初始pH值7.0，裝液量50%，接種量5%，培養(yǎng)時(shí)間14 d，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min；該條件下，GRE111抑菌活性比未優(yōu)化前提高了3.32 mm；內(nèi)生真菌GRE111鑒定為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。產(chǎn)黃青霉是一種重要的工業(yè)用真菌[16]，常用于抗生素、食品及飲料的生產(chǎn)。上述結(jié)果為采用內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵生產(chǎn)甘草次酸調(diào)味品奠定了基礎(chǔ)。