敖珍，覃發(fā)玠，羅迎春，龍俊訓(xùn)，譚紅

(1.貴州民族大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴陽(yáng)人文科技學(xué)院校團(tuán)委，貴陽(yáng) 550025；3.貴州省工程復(fù)合材料中心，貴陽(yáng) 550016；4.貴州科學(xué)院，貴陽(yáng) 550001；5.貴州省分析測(cè)試研究院，貴陽(yáng) 550014)

竹蓀是一種藥食兩用的真菌，別名竹笙、竹參、仙人笠，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和保健功效[1]，被美譽(yù)為“現(xiàn)代保健食品”、“山珍之王”、“真菌皇后”等[2]。在我國(guó)，有長(zhǎng)裙、短裙、黃裙、朱紅、紅托、皺蓋和刺托7個(gè)竹蓀品種。其中紅托竹蓀(Dictyophorarubrovalvata)形狀美麗、味道可口，在云南首次發(fā)現(xiàn)[3]后不久被馴化栽培成功，成為貴州、云南等地菌農(nóng)主要栽植的菌種之一。

多糖是具有生物活性的大分子[4]，常具有抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、調(diào)節(jié)免疫[7]等功效，廣泛存在于食用菌的細(xì)胞壁中。近年來(lái)，隨著食用菌被廣泛應(yīng)用于調(diào)味食品的開(kāi)發(fā)(如功能醋[8]、營(yíng)養(yǎng)醬[9-10]、調(diào)味劑[11]及保健食品[12]等)，紅托竹蓀也因含有豐富的活性物質(zhì)被多位學(xué)者研究。紅托竹蓀由菌蓋、菌柄和菌托組成，菌托中的活性成分比菌柄和菌蓋還多，但是生產(chǎn)者往往將菌托作為廢棄物丟棄，在污染環(huán)境的同時(shí)還造成了該珍稀菌種資源的浪費(fèi)。因此，有學(xué)者研究精深加工技術(shù)，用多種提取方法將活性物質(zhì)從紅托竹蓀中提取出來(lái)[13]，提升其附加值。其中熱水提取法[14]是較為經(jīng)典又高效的方法，此方法操作簡(jiǎn)便、安全、成本低，易于工業(yè)化。然而在紅托竹蓀多糖熱水提取法的文獻(xiàn)報(bào)道中，鮮見(jiàn)中試提取工藝優(yōu)化的研究。因此，本文對(duì)紅托竹蓀菌托多糖的中試提取工藝和中試提取的粗多糖的總還原力和DPPH自由基、OH自由基清除能力進(jìn)行了研究，為紅托竹蓀菌托多糖的工業(yè)化放大生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)支持，促進(jìn)了我國(guó)食用菌資源的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料

紅托竹蓀菌托：貴州金蟾大山生物科技有限公司。

1.2 試劑

95%食品級(jí)乙醇：貴陽(yáng)金精化工廠(chǎng)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：上海源葉生物科技有限公司；鐵氰化鉀：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；苯酚、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇、無(wú)水葡萄糖、磷酸鹽、三氯乙酸、硫酸、三氯化鐵：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水：貴州省分析測(cè)試研究院。

1.3 主要儀器與設(shè)備

中試熱水回流提取裝置 貴州科學(xué)院中試基地；藥材粉碎機(jī)、600 L暫存罐、單聯(lián)過(guò)濾器、單效濃縮器、刮板濃縮器、醇沉罐、真空脈沖干燥器 貴州省工程復(fù)合材料中心；723S可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；電子天平 沙鷹科學(xué)儀器(上海)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 紅托竹蓀菌托多糖含量的測(cè)定

參考NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》中的方法，以苯酚-硫酸法測(cè)定紅托竹蓀菌托多糖的含量。稱(chēng)取0.1 g無(wú)水葡萄糖溶于1 L容量瓶中，搖勻并定容。取6支試管，分別移取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水補(bǔ)足至1.0 mL。加入1.0 mL苯酚后，快速加入5.0 mL硫酸，充分混合，在30 ℃恒溫水浴30 min，于490 nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)(X)、吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為Y=11.478X+0.00168，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。

取1.0 mL樣品溶液按上述方法顯色測(cè)吸光度值A(chǔ)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出多糖含量，并按公式(1)計(jì)算多糖得率：

(1)

式中：C為多糖濃度，mg/mL；V為多糖提取液總體積，L；N為稀釋倍數(shù)；m為原料質(zhì)量，kg。

1.4.2 紅托竹蓀多糖中試提取流程

紅托竹蓀→稱(chēng)量→投入300 L提取罐→浸泡→加熱提取→管道抽濾→重復(fù)提取→收集濾液→取樣稀釋→測(cè)糖含量。

1.4.3 中試設(shè)備提取工藝穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)課題組實(shí)驗(yàn)室小試工藝進(jìn)行放大，稱(chēng)取3.0 kg的紅托竹蓀菌托原料，以料液比1∶20 (kg/L)加入純化水，在85 ℃下提取2 h，提取2次，重復(fù)3次，考察中試設(shè)備提取工藝的穩(wěn)定性。

1.4.4 單因素試驗(yàn)

稱(chēng)取紅托竹蓀菌托原料3.0 kg，投入300 L提取設(shè)備中，以提取液多糖得率為指標(biāo)，分別探究料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，kg/L)、提取次數(shù)(1，2，3，4，5次)、提取溫度(65，75，85，95 ℃)、提取時(shí)間(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)對(duì)多糖得率的影響。

1.4.5 正交試驗(yàn)

依據(jù)紅托竹蓀菌托中試提取的單因素結(jié)果，選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間為正交試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.4.6 抗氧化活性測(cè)試

1.4.6.1 總還原力的測(cè)定

參考蔡惠鈿等的方法并稍作修改，配制不同濃度(0.05，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mg/mL)的紅托竹蓀菌托多糖溶液，取9支試管各加入以上多糖溶液2.0 mL，再加入磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH為6.6)和鐵氰化鉀溶液(1%)各2.5 mL，使用渦旋振蕩器充分混合，50 ℃恒溫水浴。20 min后加入三氯乙酸溶液(10%)2.5 mL，離心8 min。用移液管取上清液2.5 mL，依次加入蒸餾水2.5 mL、三氯化鐵溶液(0.1%)0.5 mL，以蒸餾水為空白，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)吸光度值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

將菌托多糖用蒸餾水制成不同濃度(0.05，0.2，0.5，1.0，2.0 mg/mL)的溶液，將DPPH用無(wú)水乙醇配制成0.2 mmol/L的溶液。取5支試管分別加入1.0 mL不同濃度的多糖和1.0 mL DPPH溶液，渦旋混合，避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)吸光度，以蒸餾水為空白，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，按公式(2)計(jì)算清除率：

(2)

式中：A0為蒸餾水+DPPH溶液；A1為多糖溶液+DPPH溶液；A2為多糖溶液+蒸餾水。

1.4.6.3 羥基自由基清除率的測(cè)定[15]

將菌托多糖用蒸餾水配制成不同濃度(0.05，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL)的溶液，取8支試管分別加入1.0 mL不同濃度的多糖溶液，再依次加入1.0 mL FeSO4溶液(9.0 mmol/L)、1.0 mL水楊酸(9.0 mmol/L)和1.0 mL H2O2(8.8 mmol/L)。靜置10 min后，于510 nm處測(cè)其吸光度；以蒸餾水為空白，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，按公式(3)計(jì)算清除率：

(3)

式中：A0為FeSO4溶液+水楊酸溶液+H2O2溶液；A1為FeSO4溶液+水楊酸溶液+H2O2溶液+多糖溶液；A2為FeSO4溶液+水楊酸溶液+多糖溶液。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以 OriginPro 9.0 處理，以正交設(shè)計(jì)助手II V3.1專(zhuān)業(yè)版進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中試設(shè)備提取穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 中試提取工藝穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表2可知，固定所有提取條件一致，重復(fù)3次試驗(yàn)，紅托竹蓀菌托多糖得率在14%～15%之間，基本穩(wěn)定。并且多糖得率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.92%，在合理范圍內(nèi)，說(shuō)明使用該中試設(shè)備進(jìn)行提取基本穩(wěn)定。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取次數(shù)的確定

探究提取次數(shù)試驗(yàn)中，固定溫度為95 ℃，前3次：加水30倍，提取2 h；第4次：加水30倍，提取1 h；第5次：加水15倍，提取0.5 h。

由表3可知，紅托竹蓀菌托多糖的5次得率分別為14.68%、3.21%、0.90%、0.10%、0.01%。隨著提取次數(shù)的增加，提取的多糖逐漸減少，且第3次得率小于1%。

表3 多糖提取次數(shù)結(jié)果

由圖1可知，隨著提取次數(shù)的增加，所得多糖提取液顏色逐漸變淺。在第1次提取時(shí)，所得多糖提取液顏色較深，說(shuō)明里面含有大部分的糖，在第2次、第3次提取時(shí)，顏色變淺，說(shuō)明提取出的糖含量較低，在第4次、第5次時(shí)，顏色幾乎為無(wú)色，通過(guò)測(cè)量計(jì)算，可知多糖含量極低。在盡可能多獲得多糖的前提下，又考慮時(shí)間、人力、能耗等的影響，故選擇提取2次比較合適。

圖1 紅托竹蓀菌托多糖的提取次數(shù)試驗(yàn)取樣圖

2.2.2 料液比的確定

由圖2可知，加大用水量，提取液中多糖得率逐漸升高，在1∶35 (kg/L)時(shí)上升最迅速，在1∶40 (kg/L)時(shí)趨于平緩，考慮加水量過(guò)多不僅會(huì)使后續(xù)的濃縮操作時(shí)間延長(zhǎng)，而且會(huì)使能耗增加，因此選擇1∶35 (kg/L)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響

2.2.3 提取溫度的確定

由圖3可知，在65～85 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖得率不斷增大，在溫度達(dá)到95 ℃時(shí)多糖得率反而下降?？赡苁窃?5～85 ℃這個(gè)溫度段，溫度升高會(huì)導(dǎo)致分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)加快，分子間的相互碰撞增加，從而使多糖的溶出增加，但溫度過(guò)高會(huì)破壞多糖分子結(jié)構(gòu)，使其得率降低，故選擇提取溫度85 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

2.2.4 提取時(shí)間的確定

由圖4可知，提取時(shí)間在1.0～2.0 h時(shí)，多糖得率逐漸上升，在2.0 h時(shí)，多糖得率達(dá)到最高，但在2.0～2.5 h時(shí)，多糖得率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)槎嗵峭耆艹龊?，繼續(xù)進(jìn)行提取會(huì)使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致得率下降，因此選擇2.0 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4的極差分析結(jié)果可知，提取工藝對(duì)紅托竹蓀菌托多糖得率的影響主次順序?yàn)椋篈>C>B，即料液比>提取溫度>提取時(shí)間，并且可以得出A3>A2>A1，B3>B2>B1，C2>C3>C1，因此最優(yōu)組合為A3B3C2。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù) 表

2.3.2 方差分析結(jié)果

由表5可知，在顯著水平P=0.05時(shí)，料液比對(duì)多糖得率的影響較大，達(dá)到了顯著水平。

表5 方差分析結(jié)果

綜合表4和表5分析可知，紅托竹蓀菌托多糖的最佳中試提取工藝條件組合為A3B3C2，即料液比1∶35 (kg/L)、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間2.5 h。料液比是提取工藝的主要影響因素，在最佳工藝條件下，紅托竹蓀菌托多糖的得率為18.85%。

2.4 抗氧化活性結(jié)果

2.4.1 總還原力的測(cè)定結(jié)果

吸光度值越大，表示還原能力越強(qiáng)，由圖5可知，紅托竹蓀菌托多糖的總還原力隨濃度的增大逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為6.0 mg/mL時(shí)，多糖的總還原力可達(dá)Vc的50%。

圖5 多糖總還原力結(jié)果

2.4.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

由圖6可知，紅托竹蓀菌托多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)，多糖濃度從0.05 mg/mL升至2.0 mg/mL時(shí)，其清除率隨多糖濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度增加到2.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到80.22%，接近于Vc。由此可見(jiàn)，紅托竹蓀菌托多糖對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除作用。

圖6 多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.4.3 OH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

由圖7可知，濃度在0.05～4.0 mg/mL范圍內(nèi)，紅托竹蓀菌托多糖清除羥基自由基的能力逐漸增強(qiáng)，從0.83%提高到67.85%，在濃度為5.0 mg/mL時(shí)清除率可達(dá)陽(yáng)性對(duì)照Vc的72.13%。由此表明，紅托竹蓀菌托多糖對(duì)羥基自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

圖7 多糖對(duì)OH自由基的清除能力

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了紅托竹蓀菌托熱水回流的中試提取工藝，通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)，得出最佳中試提取條件為：提取次數(shù)2次，料液比1∶35 (kg/L)，提取時(shí)間2.5 h，提取溫度85 ℃。在此條件下，紅托竹蓀菌托提取液多糖得率為18.85%。此外，在抗氧化活性試驗(yàn)中，紅托竹蓀均表現(xiàn)出一定的活性。我國(guó)是食用菌生產(chǎn)大國(guó)，深加工是食用菌發(fā)展的方向之一，通過(guò)深加工技術(shù)可提升其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本工藝不僅能為紅托竹蓀菌托多糖的工業(yè)化精深加工提供數(shù)據(jù)支撐，還能為其他食用菌提供工業(yè)化方向，促進(jìn)食用菌資源的綜合利用。