蔣春艷

(龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 福建龍巖 364000)

生物防治中應(yīng)用較廣的微生物主要有綠僵菌Metarhiziumspp.、球孢白僵菌Beauveriabassiana和蠟蚧輪枝菌Verticilliumlecanii等[1]。綠僵菌屬M(fèi)etarhiziumSorokin隸屬于真菌門Eumycota,絲孢科Hyphomycetaceae。該屬真菌是一類非常重要的環(huán)境微生物[2],1879年Metchnikoff首先大量繁殖綠僵菌防治奧地利麗金龜AnisopliaaustriacaHerbst,此后綠僵菌就成為了害蟲微生物防治的主角之一[3]，并成為生防領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。綠僵菌侵染寄主是寄主與病原菌之間生理生化相互作用的結(jié)果[4],其中包括寄主保護(hù)酶類活性發(fā)生一定變化。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是昆蟲體內(nèi)3種重要的保護(hù)酶。SOD幾乎存在于所有有氧呼吸的生物體內(nèi),是一類重要的保護(hù)酶[1]。但是SOD穩(wěn)定性不高,外界溫度的變化、外源物質(zhì)的侵入等都易導(dǎo)致SOD活性喪失[1]。POD存在于動(dòng)植物體的細(xì)胞中,主要功能是催化過(guò)氧化物對(duì)各種物質(zhì)的氧化,是一類以過(guò)氧化氫為電子受體的氧化還原酶,可以通過(guò)消除毒性物質(zhì)和過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)的作用[1]。CAT催化細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的分解防止其過(guò)氧化,從而起到防御作用,是一種重要的機(jī)體保護(hù)酶[1]。李世廣等[5]研究了菜青蟲Pierisrapae感染金龜子綠僵菌后體內(nèi)幾種保護(hù)酶活性的變化,結(jié)果表明,用金龜子綠僵菌處理后菜青蟲體內(nèi)SOD、POD和CAT均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),反映出菜青蟲在金龜子綠僵菌侵染初期防御能力增強(qiáng),后期降低。王倫等[6]用印楝素處理的食物喂養(yǎng)光肩星天牛Anoplophoraglabripennis成蟲,結(jié)果表明SOD活性呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),在第3天時(shí)達(dá)到最高,但處理組的酶活性一直都略高于對(duì)照組。宋漳等[7]研究發(fā)現(xiàn)馬尾松毛蟲Dendrolimuspunctatus3～4齡幼蟲被金龜子綠僵菌侵染后1～4 d,體壁組織以及血淋巴中POD活性均有明顯的減弱趨勢(shì)。林忠蓮等研究發(fā)現(xiàn)磷化氫對(duì)谷蠹Rhyzoperthadominica、玉米象Sitophiluszeamais成蟲體內(nèi)的CAT活性有明顯的抑制作用[8]。劉玉娣等[9]用抑太保處理小菜蛾P(guān)lutellaxylostella幼蟲5 h后2、3、4齡幼蟲的CAT活性降至最低,證明小菜蛾2、3、4齡幼蟲的 CAT和 POD活性與耐藥性存在著一定的相關(guān)性。殺蟲劑可通過(guò)干擾昆蟲體內(nèi)的相關(guān)酶活性來(lái)擾亂昆蟲的防御體系,使昆蟲不能正常代謝,直至死亡[10-13],因此農(nóng)藥對(duì)昆蟲體內(nèi)相關(guān)酶活性的抑制能力是衡量其防治效果的重要指標(biāo)。

黃曲條跳甲Phyllotretastriolata(Fabricius)是十字花科蔬菜上的一種重要害蟲。目前其在我國(guó)福建、廣東和臺(tái)灣等地大量發(fā)生[14],阻礙蔬菜正常生長(zhǎng)或影響其品質(zhì),造成一定經(jīng)濟(jì)損失。由于黃曲條跳甲成蟲善于跳躍,極易躲避殺蟲劑,造成防效下降。農(nóng)民為了控制該蟲的為害,加大用藥量,增加用藥頻率,從而加速了其抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展。綠僵菌是對(duì)黃曲條跳甲有高致病力的病原菌[15]。由于綠僵菌侵染率高,對(duì)人畜環(huán)境安全,且可大量繁殖,可作為防治黃曲條跳甲的生防菌。目前有關(guān)綠僵菌侵染昆蟲后昆蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性變化方面的研究也有不少,而金龜子綠僵菌侵染黃曲條跳甲后保護(hù)酶活性方面的研究少見報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定金龜子綠僵菌CQMa421處理黃曲條跳甲后其體內(nèi)保護(hù)酶活性的變化,探討黃曲條跳甲與金龜子綠僵菌相互作用機(jī)理,為尋找黃曲條跳甲抗藥性治理措施,延緩其抗性發(fā)展,及黃曲條跳甲綠色防控提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試蟲源

黃曲條跳甲成蟲從福建省龍巖市蔬菜種植基地和龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保室蔬菜大棚中十字花科蔬菜上采集,蔬菜種植基地在采集黃曲條跳甲前至少15 d未噴施農(nóng)藥,植保研究室蔬菜大棚中蔬菜播種后未噴施農(nóng)藥。采集的成蟲于室內(nèi)以新鮮未施用藥劑的‘上海青’葉片飼養(yǎng)72 h,饑餓2 h以上再進(jìn)行藥劑處理, ‘上海青’(隆之喜種業(yè)有限公司生產(chǎn))種植于龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保室大棚。

1.1.2供試藥劑及試劑

80億孢子/mL金龜子綠僵菌CQMa421可分散油懸浮劑(OD)，重慶聚立信生物工程有限公司生產(chǎn)。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過(guò)氧化物酶(POD)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒均為蘇州科銘生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3真菌分離及分生孢子懸浮液配制

將金龜子綠僵菌CQMa421可分散油懸浮劑接入PDA培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱于(25±1)℃和L∥D=12 h∥12 h下培養(yǎng)并進(jìn)行多次分離純化。純化后的金龜子綠僵菌經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)孢后,將分生孢子粉刮下,用含0.1%吐溫-80的無(wú)菌水,配成1.6×109個(gè)/mL孢子懸浮液,待用。

1.2 方法

1.2.1試蟲處理

采用浸葉法處理試蟲。金龜子綠僵菌CQMa421孢子懸浮液用無(wú)菌水配制成5個(gè)濃度,即1×108、2×108、4×108、8×108、1.6×109個(gè)/mL。將新鮮、未施用任何藥劑的‘上海青’葉片在孢子懸浮液中浸漬約15 s后取出,自然晾干后置于透明塑料瓶中,每瓶接入200頭左右蟲齡、大小一致的黃曲條跳甲成蟲,用80目防蟲網(wǎng)封口,置于溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度70%～80%,光周期L∥D=14 h∥10 h的人工氣候箱內(nèi),以含0.01%吐溫-80無(wú)菌水作空白對(duì)照,分別于24、48、72、96 h和120 h時(shí)取出活蟲大約0.1 g,放入冰箱冷凍用于酶活性測(cè)定。

1.2.2酶液制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g試蟲放入研磨杯中,加入 1 mL 酶提取液,冰浴下進(jìn)行組織勻漿。于4℃下,8 000 r/min離心10 min,取上清液作為酶源,置于冰上待測(cè)。

1.2.3酶活性測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定均按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。SOD活性測(cè)定:將90 μL待測(cè)酶液和各測(cè)試試劑按順序加入測(cè)定管中充分搖勻,室溫靜置30 min后加入1 mL玻璃比色皿中,測(cè)定各管560 nm下吸光度;POD活性測(cè)定:工作液在25℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱10 min以上,將50 μL待測(cè)酶液和950 μL工作液加入1 mL玻璃比色皿中混勻,測(cè)定470 nm下1 min時(shí)和2 min后的吸光度,將每毫升反應(yīng)體系中每分鐘OD470變化0.01定義為1個(gè)酶活力單位;CAT活性測(cè)定:將工作液在25℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱10 min,將35 μL待測(cè)酶液和1 mL工作液加入1 mL石英比色皿中混勻,室溫下立即測(cè)定240 nm下初始吸光度和1 min后的吸光度，將每克組織每分鐘催化1 nmol H2O2降解定義為1個(gè)酶活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示;DPS軟件進(jìn)行方差分析和Tukey法多重比較進(jìn)行差異顯著性分析,利用Excel 2007作出酶活性圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 金龜子綠僵菌對(duì)黃曲條跳甲體內(nèi)SOD活性的影響

由圖1可得出,不同濃度金龜子綠僵菌CQMa421處理黃曲條跳甲成蟲后,其體內(nèi)SOD活性出現(xiàn)不同程度的變化。120 h內(nèi),各濃度處理后,SOD活性都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在48 h時(shí)SOD活性顯著增強(qiáng),與其他時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的活性值差異顯著(P<0.05),到120 h時(shí)恢復(fù)到接近24 h時(shí)的活性,而空白對(duì)照組在測(cè)定期間SOD活性差異不顯著,處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

圖1 金龜子綠僵菌處理黃曲條跳甲后體內(nèi)SOD活性變化Fig.1 Changes of SOD activity in Phyllotreta striolata treated by Metarhizium anisopliae

不同濃度金龜子綠僵菌CQMa421處理后，同一時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的黃曲條跳甲SOD活性不同。各處理組在24 h時(shí)SOD活性略低于對(duì)照,對(duì)照組為62.23 U/g,處理組按處理濃度由低到高其SOD活性分別為60.63、58.6、60.37、60.03 U/g和59.1 U/g,各處理組間差異不顯著。48 h時(shí)各處理濃度下SOD活性都顯著高于對(duì)照,處理濃度越高,SOD活性越高,其中濃度1.6×109個(gè)/mL金龜子綠僵菌CQMa421處理后黃曲條跳甲SOD活性達(dá)76.67 U/g,為對(duì)照組的1.21倍,各處理間存在顯著差異(P<0.05)。72 h開始SOD活性出現(xiàn)下降趨勢(shì),到120 h時(shí)各處理組SOD活性回到對(duì)照水平。

2.2 金龜子綠僵菌對(duì)黃曲條跳甲體內(nèi)POD活性的影響

金龜子綠僵菌CQMa421孢子懸浮液處理黃曲條跳甲后72 h內(nèi)不同濃度處理在同一時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的POD活性差異不顯著，且同一濃度處理的POD活性隨時(shí)間也沒有顯著變化，但處理后96 h時(shí)各處理組POD活性均達(dá)到峰值,即濃度1×108、2×108、4×108、8×108、1.6×109個(gè)/mL 孢子懸浮液處理后POD活性分別為1 020、1 066.67、1 240、1 086.67 U/g和1 166.67 U/g,顯著高于其他時(shí)間的POD活性，也顯著高于對(duì)照的POD活性(306.67 U/g)，分別為對(duì)照的3.33、3.48、4.04、3.54倍和3.80倍；到120 h時(shí)POD活性恢復(fù)到對(duì)照水平。對(duì)照組120 h內(nèi)POD活性較穩(wěn)定,各時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異(圖2)。

2.3 金龜子綠僵菌對(duì)黃曲條跳甲體內(nèi)CAT活性的影響

金龜子綠僵菌侵染后，黃曲條跳甲體內(nèi)CAT活性總體表現(xiàn)為先上升并在處理后120 h時(shí)恢復(fù)至正常水平,對(duì)照組在不同時(shí)間CAT活性差異不顯著。各處理組CAT活性隨時(shí)間變化差異較大。1×108、2×108、4×108個(gè)/mL處理在48 h,8×108個(gè)/mL和1.6×109個(gè)/mL處理在72 h CAT活性上升達(dá)到最大值，其中8×108個(gè)/mL金龜子綠僵菌處理后，CAT活性由48 h的107.52 nmol/(min·g),上升到72 h的116.96 nmol/(min·g),為同時(shí)間對(duì)照的1.13倍,隨后降低;96 h時(shí),濃度為1×108、2×108、4×108個(gè)/mL處理組CAT活性較72 h有所升高;120 h時(shí),各處理組CAT活性均降低(圖3)。

圖2 金龜子綠僵菌處理黃曲條跳甲后體內(nèi)POD活性變化Fig.2 Changes of POD activity in Phyllotreta striolata treated by Metarhizium anisopliae

金龜子綠僵菌處理后24 h,黃曲條跳甲CAT活性略高于對(duì)照;48 h時(shí)CAT活性開始上升,除濃度為8×108個(gè)/mL外,其他處理組都顯著高于對(duì)照;72 h時(shí)濃度為8×108和1.6×109個(gè)/mL處理組顯著高于其他處理和對(duì)照(P<0.05),120 h時(shí)所有處理組CAT活性下降,除濃度為1.6×109個(gè)/mL外,其他處理組CAT活性與對(duì)照相當(dāng)。

圖3 金龜子綠僵菌處理黃曲條跳甲后體內(nèi)CAT活性變化Fig.3 Changes of CAT activity in Phyllotreta striolata treated by Metarhizium anisopliae

3 結(jié)論與討論

昆蟲細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除主要靠SOD、POD和CAT三者協(xié)調(diào)調(diào)控,當(dāng)昆蟲受到外界各種脅迫時(shí)可以誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)這3種保護(hù)酶含量升高,協(xié)同調(diào)控作用使活性氧處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),以降低活性氧自由基對(duì)機(jī)體的傷害,維持昆蟲正常生長(zhǎng)發(fā)育。黃訓(xùn)兵等研究了4種植物源化合物對(duì)亞洲小車蝗Oedaleusasiaticus保護(hù)酶活性的影響,結(jié)果顯示保護(hù)酶活性均與對(duì)照差異顯著[16];宋程飛等研究了綠薄荷Menthaspicata莖、葉乙醇提取物對(duì)小菜蛾幼蟲3種保護(hù)酶的影響,結(jié)果表明,隨著提取物作用時(shí)間的增加,小菜蛾體內(nèi)3種保護(hù)酶活性均表現(xiàn)為先升高后下降[17];張勝蘭等研究了蟬花IsariacicadaeSLGY-2 對(duì)斜紋夜蛾Spodopteralitura生長(zhǎng)發(fā)育及體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響,結(jié)果表明,斜紋夜蛾在抵御蟬花SLGY-2 侵染過(guò)程中,蟲體內(nèi)3種保護(hù)酶均出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),且隨著菌株孢子濃度增加,酶活性逐漸上升,但最終表現(xiàn)為下降[18];李會(huì)平等測(cè)定了桑天牛Aprionagermari幼蟲感染白僵菌后體內(nèi)主要保護(hù)酶活性的變化,結(jié)果表明,桑天牛幼蟲感染白僵菌后,體內(nèi)SOD、POD和CAT活性在接種初期迅速提高,但在接種后期均出現(xiàn)不同程度下降[19]。

本文研究不同濃度金龜子綠僵菌處理黃曲條跳甲不同時(shí)間對(duì)SOD、POD和CAT活性的影響,結(jié)果表明,金龜子綠僵菌處理后黃曲條跳甲體內(nèi)SOD、POD和CAT 的活性均有升高,并出現(xiàn)一定的變化規(guī)律。黃曲條跳甲取食處理葉片后,24 h內(nèi)金龜子綠僵菌孢子還未萌發(fā),SOD活性與對(duì)照組相差不大,或低于對(duì)照;隨著取食時(shí)間增加,孢子萌發(fā)并在黃曲條跳甲體內(nèi)繁殖,O2濃度增加,蟲體內(nèi)的HO-濃度增加,蟲體迅速作出免疫防衛(wèi)反應(yīng),48 h時(shí)SOD為被激活且活性明顯上升,以減輕過(guò)氧離子對(duì)蟲體的毒害,隨后金龜子綠僵菌在蟲體內(nèi)大量繁殖,使得SOD合成受到抑制,自我防衛(wèi)能力迅速下降,表現(xiàn)為SOD活性急劇下降,120 h時(shí)回到正常水平。前期可能由于金龜子綠僵菌產(chǎn)生的毒素少,POD活性在72 h內(nèi)上升很緩慢,隨著金龜子綠僵菌孢子在體內(nèi)大量繁殖,毒素急劇增加,機(jī)體迅速啟動(dòng)免疫系統(tǒng)使POD活性快速上升,以維持機(jī)體正常生理功能,96 h到達(dá)最高值,隨著毒素在體內(nèi)越集越多,使得POD合成受阻,活性逐漸下降。金龜子綠僵菌處理48～72 h時(shí)，黃曲條跳甲CAT活性上升到最高,但最終不敵金龜子綠僵菌在體內(nèi)的生長(zhǎng)和增殖速度,所以侵染后期CAT活性逐漸下降,最終黃曲條跳甲走向死亡,低濃度處理組CAT活性出現(xiàn)了一定的反彈,這可能是昆蟲抵御有毒物質(zhì)的抗性反應(yīng),生產(chǎn)上我們應(yīng)該再施一次藥,或者增加處理濃度,以提高防治效果。本文結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致?？梢?這3種保護(hù)酶在黃曲條跳甲抵抗綠僵菌引起的氧化脅迫中發(fā)揮了重要作用。本試驗(yàn)初步分析了金龜子綠僵菌 CQMa421 對(duì)黃曲條跳甲3種保護(hù)酶活性的影響,其對(duì)黃曲條跳甲的生防潛力還需進(jìn)一步研究。