陳名君，侯囡嵩，林 儼，劉玉軍，黃 勃*

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥20036；2. 安徽省科學(xué)技術(shù)研究院，合肥 230031）

毛竹Phyllostachys edulis是一種地域分布廣，經(jīng)營周期短，經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)良樹種。其具有產(chǎn)量高、用途廣和筍材兩用等特點(diǎn)，使其具有重要的市場價(jià)值，同時(shí)毛竹鞭根發(fā)達(dá)，更新繁茂，防風(fēng)固沙、保持水土能力強(qiáng)，持續(xù)利用時(shí)間長，又具有重要的生態(tài)價(jià)值[1]。毛竹林在中國栽培歷史悠久，種植面積廣，是我國南方重要的森林類型之一。毛竹在生長過程中受到眾多害蟲危害，如大竹象Cyrtotrachelus longimanus、竹筍禾夜蛾Oligia vulgaris、竹筍泉蠅Pegomyia phyllostachys、雙櫛蝠蛾Bipectilus zhejiangensis[2]、篩胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis[3]、黃脊竹蝗Ceracris kiangsu[4]等，對毛竹的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。

綠僵菌屬M(fèi)etarhizium Sorokin是以金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae為模式種建立的真菌，其有性型在最新的系統(tǒng)分類地位隸屬于子囊菌門 Ascomycota、糞菌綱 Sordariomycetes、肉座菌目 Hypocreales、麥角菌科Clavicipitaceae、異蟲草屬M(fèi)etacordyceps。2013年Kepler等[5]提出應(yīng)用MzIGS3基因能夠有效將金龜子綠僵菌復(fù)合種鑒定到種水平。隨后Kepler等[6]將綠僵菌和有性型的蟲草聯(lián)系起來，并分析了綠僵菌屬M(fèi)etarhizium, 普奇尼亞菌屬Pochonia，野村菌屬Nomuraea和擬青霉屬Paecilomyces之間的關(guān)系，將異蟲草屬 Metacordyceps中的很多種重新歸入綠僵菌屬，包括野村菌屬 Nomuraea和最近新描述的屬Chamaeleomyces。Luangsa-ard等[7]根據(jù)綠僵菌新分類系統(tǒng)，采取多基因分子系統(tǒng)學(xué)和經(jīng)典分類技術(shù)結(jié)合，在泰國熱帶森林發(fā)現(xiàn)綠僵菌新種M. chaiyaphumense, M. kalasinense, M. prachinense,M. samlanense和M.takense；以及和Metarhizium屬相近的新屬Nigelia。目前綠僵菌分類系統(tǒng)取得了突破性的進(jìn)展，這為本研究提供了可靠的技術(shù)保證。

有研究表明，綠僵菌對多種毛竹害蟲有顯著的防治效果。林春穆等[2]篩選出能有效控制浙江雙櫛蝠蛾的金龜子綠僵菌；楊華等[4]研制出對黃脊竹蝗具有極大防治潛力的綠僵菌微膠囊劑；葉碧歡等[3]測定了平沙綠僵菌對竹林重要地下害蟲篩胸梳爪叩甲幼蟲具有極顯著的趨避作用。近年來越來越多的研究表明，綠僵菌還具有植物內(nèi)生、植物病害拮抗、植物生長促進(jìn)和根際定殖等一系列作用。Hu等[8]首次報(bào)道金龜子綠僵菌在甘藍(lán)根際具有定殖能力。Wyrebek等[9]研究了加拿大安大略省不同植物根際綠僵菌的分布情況，分離出羅伯茨綠僵菌M. robertsii、棕色綠僵菌M. brunneum和貴州綠僵菌M. Guizhouense 3種綠僵菌，且并非隨機(jī)分布，而與植物種類具有嚴(yán)格的相關(guān)性。

生態(tài)位寬度反映了物種利用資源的能力和多樣性的大小，空間生態(tài)位寬度較高，說明該物種分布區(qū)域較為廣泛；時(shí)間生態(tài)位寬度較高，說明該物種適溫范圍較廣[10]。生態(tài)位重疊指數(shù)反映了不同物種對資源利用程度在空間、時(shí)間維度上的相似程度，其值介于0～1，其值越大代表物種生態(tài)位重疊越高，當(dāng)生態(tài)位重疊指數(shù)大于0.6時(shí)，視為顯著重疊[11]。研究毛竹根際綠僵菌屬真菌物種多樣性及在毛竹根際的生態(tài)分布，不僅具有重要的理論意義，而且對于保護(hù)和促進(jìn)綠僵菌在毛竹根際的自我維持，更合理的利用該菌控制毛竹林地上地下害蟲也具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

選擇素有“竹海”之稱的安徽省廣德市笄罩山，于2018年秋、冬和2019年春、夏4個(gè)季節(jié)分別前往采集。在笄罩山海拔100、250和400 m處分別選取陰坡和陽坡設(shè)置6個(gè)樣地，每個(gè)樣地約100 m2，每個(gè)樣地內(nèi)隨機(jī)選取10株齡期和大小基本一致的毛竹，用鐵鍬挖出毛竹距表土5～20 cm深處的根系，盡可能地去除根表多余的土壤，然后再裝入標(biāo)記好的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室及時(shí)分離處理。在一年的4個(gè)季節(jié)共采集4次。

1.2 綠僵菌屬真菌的分離

毛竹根系用無菌蒸餾水沖洗去除多余的土壤，緊緊附著在根部的土壤可保留。取2 g的根樣品，剪成0.5 cm小段，放入裝有10 mL蒸餾水的三角瓶中，置于搖床上搖勻1 h。取勻漿樣品（100 μL）接種在選擇性培養(yǎng)基（20 g/L葡萄糖、200 g/L馬鈴薯、20 g/L瓊脂、0.2 g/L氯霉素、0.2 g/L放線菌酮、0.5 g/L多果腚和0.01 g/L結(jié)晶紫）上并涂布均勻，每樣品設(shè)置3次重復(fù)。將已接種培養(yǎng)皿放在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第10 d開始，陸續(xù)從培養(yǎng)皿上挑取出所有真菌菌落，純化培養(yǎng)。對純化得到的菌株，通過形態(tài)特征鑒定和分子測序，確定其種類[12]。

1.3 形態(tài)觀察

依據(jù)經(jīng)典分類研究方法，將分離純化的菌株，接種至1/4 SDAY培養(yǎng)基上，記錄菌株直徑、菌株顏色質(zhì)地等參數(shù)并拍照。將剛產(chǎn)孢的菌株在光學(xué)顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形狀、菌絲等特征，并記錄孢子大小、瓶梗大小和菌絲寬度等，然后進(jìn)行物種鑒定。

1.4 DNA提取

將純化并經(jīng)形態(tài)鑒定的菌株，接種到帶有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基（20 g/L葡萄糖、200 g/L馬鈴薯、20 g/L瓊脂）上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，取0.05～0.1 g菌絲備用。用改良的CTAB法[13]提取基因組DNA。利用核酸測定儀檢測基因組DNA質(zhì)量，并于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增和測序

本試驗(yàn)用于PCR擴(kuò)增的引物是：MzIGS3-1F（cgt ggc tcc tga cca tgg ttg c）和MzIGS3-4R（gcg ggg gag ccg act tgg a）。PCR 擴(kuò)增以 25 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行，其中包括 2.5 μL Buffer，0.5 μL dNTP，正反向引物各 1 μL，0.2 μL Taq 聚合酶，1 μL 模板 DNA 和 18.8 μL PCR 水。測序所使用的引物為：MzIGS3-2F（5′-gtg gct cct gac cat ggt tgc-3′）和 MzIGS3-3R（5′-cgg ggg agc cga ctt gga ttt-3′）。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性30 s，TM值減去3 ℃～5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離，EB染色后于凝膠成像系統(tǒng)檢測拍照并送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.6 生態(tài)位寬度和重疊

式中，Pij＝nij/Nij即種i在第j個(gè)資源狀態(tài)下的個(gè)體數(shù)占該種所有個(gè)體數(shù)的比例。其中，在計(jì)算時(shí)間生態(tài)位寬度、時(shí)間生態(tài)位重疊時(shí)，j表示某個(gè)調(diào)查月份；在計(jì)算空間生態(tài)位寬度、空間生態(tài)位重疊時(shí)，j表示某個(gè)樣地。R為總樣地?cái)?shù)或總調(diào)查月份次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠僵菌屬真菌分離鑒定結(jié)果

通過對安徽省廣德市笄罩山毛竹根系綠僵菌的采集分離，經(jīng)形態(tài)特征初步鑒定，共從毛竹根際分離出164株可能為綠僵菌屬真菌的菌株。經(jīng)提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將測序得到的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較。經(jīng)鑒定共獲得綠僵菌163株，其中羅伯茨綠僵菌的多度最高，為98株，相對多度為0.601；其次為一種待鑒定綠僵菌，多度和相對多度分別為47和0.288，平沙綠僵菌有11株，貴州綠僵菌最少，僅有7株。4種綠僵菌菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)詳見圖1。

圖1 四種綠僵菌在SDAY/4培養(yǎng)基上菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)（標(biāo)尺＝10 μm）Fig. 1 Colony morphology of four Metarhizium species on SDAY/4 and mature conidiogenous cells and conidia (Bar=10 μm)

2.2 毛竹根際綠僵菌屬真菌空間分布情況

圖2結(jié)果表明，從綠僵菌的海拔分布來看，海拔100和400 m處的毛竹根際綠僵菌屬真菌多樣性明顯高于海拔250 m處。在設(shè)置的3個(gè)海拔梯度中，海拔100 m處分離得到的根際綠僵菌菌株最多，其中羅伯茨綠僵菌為優(yōu)勢種；其次是400 m處，優(yōu)勢種是一種待鑒定綠僵菌；250 m海拔處分離得到的根際綠僵菌菌株最少。羅伯茨綠僵菌在毛竹根際的數(shù)量隨著海拔的升高而遞減。一種待鑒定綠僵菌和平沙綠僵菌在毛竹根際的數(shù)量在海拔250 m處最低，而貴州綠僵菌的數(shù)量則隨著海拔的增高而略有上升。

圖2 毛竹根際綠僵菌空間分布情況Fig. 2 Summary of the spatial distribution of the Metarhizium species in the rhizosphere of Phyllostachys edulis

從綠僵菌的坡向分布來年，陰坡處的毛竹根際綠僵菌多樣性高于陽坡處。4種綠僵菌中，平沙綠僵菌只在陰坡處分離得到，可能有較強(qiáng)的坡向偏好。其他3種綠僵菌均未發(fā)現(xiàn)有較明顯的坡向偏好。

2.3 毛竹根際綠僵菌的時(shí)間分布情況

研究一年中4個(gè)季節(jié)毛竹林根際綠僵菌分布情況，發(fā)現(xiàn)9月綠僵菌最多，其中羅伯茨綠僵菌為優(yōu)勢種；3月分離得到的綠僵菌中一種待鑒定綠僵菌和羅伯茨綠僵菌較多；6月分離得到的綠僵菌中最多的是一種待鑒定綠僵菌；12月分離得到的綠僵菌最少。由圖3可以看出，除羅伯茨綠僵菌外，其余3種綠僵菌在毛竹根際的數(shù)量隨季節(jié)的變化而遞減，而羅伯茨綠僵菌在夏季毛竹根際分布達(dá)到峰值。

圖3 毛竹根際綠僵菌時(shí)間分布情況匯總Fig. 3 Summary of the temporal distribution of Metarhizium species in the rhizosphere of Phyllostachys edulis

2.4 毛竹根際綠僵菌時(shí)空生態(tài)位寬度

同種綠僵菌的空間生態(tài)位寬度呈現(xiàn)明顯的季節(jié)變化。一種待鑒定綠僵菌和貴州綠僵菌在春、夏季節(jié)中，空間生態(tài)位寬度較高，在秋季和冬季的各月中則較低；羅伯茨綠僵菌在春、秋季中，空間生態(tài)位寬度較高，在夏、冬季中則較低；而平沙綠僵菌僅在春季生態(tài)位寬度略高。羅伯茨綠僵菌的空間生態(tài)位寬度在春、秋、冬三季中均為最高的，然而在春季一種待鑒定綠僵菌的空間生態(tài)位寬度最高?？傮w來看，春季中毛竹根際的綠僵菌空間生態(tài)位寬度最高，4種綠僵菌中，貴州綠僵菌的時(shí)間生態(tài)位寬度最低，其余3種綠僵菌的時(shí)間生態(tài)位寬度差異較小，其中時(shí)間生態(tài)位寬度最高的是一種待鑒定綠僵菌（表1）。

表1 毛竹根際綠僵菌的時(shí)空生態(tài)位寬度值Table 1 The spatial niche width and the temporal niche width of Metarhizium species in the rhizosphere of Phyllostachys edulis

2.5 毛竹根際綠僵菌時(shí)空生態(tài)位重疊

不同綠僵菌間的空間生態(tài)位重疊值呈現(xiàn)一定的季節(jié)變化。在春季，一種待鑒定綠僵菌和貴州綠僵菌的空間生態(tài)位重疊值最高；而在夏季和秋季中，平沙綠僵菌和羅伯茨綠僵菌的空間生態(tài)位重疊值最高；在冬季中，待鑒定綠僵菌和平沙綠僵菌空間生態(tài)位重疊值最高（表2）。

表2 毛竹根際綠僵菌的空間生態(tài)位重疊值Table 2 The spatial niche overlap of Metarhizium species in the rhizosphere of Phyllostachys edulis

不同綠僵菌間的時(shí)間生態(tài)位重疊值差異較大，分布在0.31～0.92。其中待鑒定綠僵菌和貴州綠僵菌的時(shí)間生態(tài)位重疊值最高，而貴州綠僵菌和羅伯茨綠僵菌的時(shí)間生態(tài)位重疊值最低（表3）。

表3 毛竹根際綠僵菌的時(shí)間生態(tài)位重疊值Table 3 The temporal niche overlap of Metarhizium species

3 討論

本文從毛竹根際共分離出4種綠僵菌，分別是羅伯茨綠僵菌、平沙綠僵菌、貴州綠僵菌和一種待鑒定綠僵菌，其中羅伯茨綠僵菌的數(shù)量最多，其次是待鑒定綠僵菌。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，美國和加拿大所分離出的根際綠僵菌中，羅伯茨綠僵菌均是分布最廣泛的，與本文的研究結(jié)果一致[16,17]。但在研究日本筑波縣5月和6月森林不同植物根際綠僵菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢種為平沙綠僵菌[18]，其差異可能是由于研究季節(jié)較單一，未能全面反映一年中植物根際綠僵菌分布情況。另外，也可能與植物種類、土壤環(huán)境、植被坡向等因素有關(guān)。

周芳純等[19]研究發(fā)現(xiàn)，夏末、秋初和初春是毛竹的快速生長時(shí)期。在本實(shí)驗(yàn)中3月和9月分離出大量的羅伯茨綠僵菌，明顯多于另外兩個(gè)月，然而其他幾種綠僵菌則沒有表現(xiàn)出此種情況，說明羅伯茨綠僵菌可能與毛竹生長有一定的協(xié)同或者促進(jìn)關(guān)系。Sasan和Bdochka[20]研究發(fā)現(xiàn)羅伯茨綠僵菌的孢子能粘附在柳枝稷和菜豆根表，并能促進(jìn)其根系生長。Liao等[21]研究發(fā)現(xiàn)羅伯茨綠僵菌作為根際微生物促進(jìn)了植物對氮的吸收并增強(qiáng)了植物抗病性，同時(shí)羅伯茨綠僵菌寄生昆蟲后，可將從昆蟲中吸收的氮營養(yǎng)物質(zhì)傳給植物，還可分泌各種有機(jī)酸溶解土壤中的固態(tài)磷和二氧化碳[22]供植物生長發(fā)育之用，且可以消除土壤中的鉛污染，也能幫助植物吸收土壤中的鐵和鋅[23]。綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)羅伯茨綠僵菌確實(shí)對植物生長有促進(jìn)作用。

從毛竹根際綠僵菌的時(shí)空分布情況可以看出，根際綠僵菌的優(yōu)勢種在不同海拔和不同季節(jié)不完全相同，因此無法證明綠僵菌和植物之間存在特定的相關(guān)性，這一觀點(diǎn)與日本學(xué)者Nishi等[18]研究結(jié)果一致。根際優(yōu)勢綠僵菌可能是由植物生長環(huán)境因素綜合決定的。Bidochka等[24]研究發(fā)現(xiàn)綠僵菌對植物種類的偏好可能是由于其對熱生長偏好的差異以及對紫外線輻射的適應(yīng)能力而不是對植物物種本身的適應(yīng)性。因?yàn)樗麄兯蛛x出的羅伯茨綠僵菌與棕色綠僵菌相比更喜歡高溫，并且對紫外線輻射具有更高的抵抗力。Fisher等[25]同樣認(rèn)為生境才是決定綠僵菌種類的原因，而不是植物種類。他們研究中所采集的圣誕樹根際綠僵菌種類與其他三種植物根際的綠僵菌種類明顯不同，因?yàn)樗麄儾蓸狱c(diǎn)相比其他植物的采樣點(diǎn)的區(qū)域范圍更小。本文僅研究了毛竹根際綠僵菌分布情況，且在分離過程中可能存在一定的誤差，要想進(jìn)一步證明綠僵菌和植物是否存在特定的相關(guān)性，今后還需要進(jìn)一步對不同植物的根際綠僵菌進(jìn)行更為詳盡的研究。