羅明楚, 石小翠, 孫 朋, 魯建美, 宋興震, 賈慧珍, 吳 敏, 許又凱

( 1. 熱帶植物資源可持續(xù)利用重點實驗室 中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園， 云南 勐臘 666303； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049 )

拔毒散()為錦葵科黃花稔屬植物，主要分布在四川、貴州、云南和廣西等地(中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會，1982)。在中國云南傣族地區(qū)，拔毒散作為一種傳統(tǒng)藥用植物，具有悠久的使用歷史，其莖葉常用于治療諸瘡腫毒、皮膚瘙癢、跌打損傷、刀槍傷等疾病(李維峰等，2006；段立綱等，2013)。然而，圍繞這些藥效的相關(guān)研究卻鮮有報道?；瘜W(xué)成分研究方面，國內(nèi)學(xué)者通過分離鑒定，發(fā)現(xiàn)該植物主要的化合物類型為甾體類的蛻皮激素(姚春所，2000；曲世津，2006；雷春，2008)。為了深入研究該植物化學(xué)資源，尋找與傳統(tǒng)藥用價值相關(guān)的抗炎活性成分，本研究利用經(jīng)典的色譜學(xué)分離手段和核磁共振波譜技術(shù)對拔毒散的化學(xué)成分進(jìn)行了分離和鑒定，共得到16個單體化合物，并利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7炎癥模型評價化合物的抗炎活性，以期明確該植物抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，并為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

1.1.1 材料 拔毒散的地上部分于2020年5月13日采集自云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣勐侖鎮(zhèn)，由中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園高級實驗員肖春芬老師鑒定，植物標(biāo)本保存于中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園標(biāo)本館(No.153662)；RAW 264.7細(xì)胞購于中國科學(xué)院昆明動物所細(xì)胞庫。

1.1.2 儀器和試劑 ESI-MS(UPLC-IT-TOF，日本島津制作所)；500 MHz 核磁共振波譜儀(Avance III 500，德國Brucker公司)；600 MHz 核磁共振波譜儀(Avance III 600，德國Brucker公司)；半制備型HPLC配備 Waters 600 泵(Waters 2996二極管陣列紫外檢測器)，色譜柱為YMC-Pack ODS-A (250 mm × 10 mm，S-5 μm，3 mL·min)；柱層析硅膠(200～300 目，青島海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20 (40～70 μm，瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司)；微孔樹脂MCI (CHP20/P120，75～150 μm，日本三菱公司)。

生物安全柜(BSC-1100II B2-X，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(QP-80，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；倒置生物顯微鏡(NIB-100，寧波永新光學(xué)股份有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，美國Thermo公司)。

T25培養(yǎng)瓶、離心管、96孔板(美國Corning公司)；胎牛血清FBS(美國Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶(以色列Biological Industries公司)；脂多糖、地塞米松(美國Sigma公司)；Griess試劑、MTS(美國Promega公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取與分離 將采集的拔毒散陰干并粉碎后，得到樣品3.1 kg，用95%的乙醇常溫浸提7 d，合并提取液并減壓濃縮，重復(fù)3次，共得到浸膏182 g。加水分散浸膏成混懸液，用乙酸乙酯萃取得到粗樣60 g，再將其置于微孔樹脂MCI色譜柱中，用不同梯度的甲醇∶水體系(30∶70，50∶50，70∶30，90∶10)依次洗脫，TLC點板合并極性相同的部分，得到Fr. 1～Fr. 4四個組分。取Fr. 2(8 g)置于硅膠色譜柱中，用不同梯度乙酸乙酯和丙酮以及二氯甲烷和甲醇反復(fù)洗脫，再經(jīng)過Sephadex LH-20 (甲醇)洗脫、半制備HPLC(乙腈∶水)梯度洗脫，得到得到化合物(8.5 mg)、(3.0 mg)、(11.2 mg)、(10.8 mg)、(6.1 mg)、(4.4 mg)、(6.5 mg)、(2.4 mg)、(2.6 mg。取Fr.3(2 g)和Fr. 4(8 g)分別置于硅膠色譜柱中用不同梯度二氯甲烷和甲醇反復(fù)洗脫，結(jié)合Sephadex LH-20 (甲醇)以及半制備HPLC，分別得到化合物(3.4 mg)、(2.8 mg)、(4.1 mg)、(3.2 mg)、(4.8 mg)和化合物(3.5 mg)、(11.0 mg)，化合物結(jié)構(gòu)圖見圖1。

1.2.2 抗炎活性實驗 RAW 264.7細(xì)胞使用DMEM完全培養(yǎng)基(10%FBS，1%青霉素、鏈霉素)，在37 ℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，按密度為每毫升1×10個均勻種入96孔板，每孔100 μL。貼壁培養(yǎng)18 h后，空白組加入完全培養(yǎng)基，模型組加入含終濃度為1 μg·mL脂多糖(LPS)的完全培養(yǎng)基，實驗組在模型組的基礎(chǔ)上加入終濃度為50 μmol·L的待測化合物，陽性對照為地塞米松(dexamethasone，Dex)。處理24 h后，按照Griess試劑的標(biāo)準(zhǔn)操作處理。同一批次的細(xì)胞按照MTS法測定細(xì)胞活力。

所有實驗均設(shè)置3個復(fù)孔，結(jié)果以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用 SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和 Dunnett’s 多重比較檢驗來分析實驗的數(shù)據(jù)，<0.05接受為顯著性差異。采用回歸分析的方法計算IC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物黃色針狀晶體，分子式為CHO。ESI-MS：449 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 8.10 (2H, d,=8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.89 (2H, d,=8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.42 (1H, d,=2.1 Hz, H-8), 6.22 (1H, d,=2.1 Hz, H-6), 5.15 (1H, d,=7.8 Hz, H-1″), 3.83-3.42 (6H, overlap, H-2″-6″)。C NMR (125 MHz, CDOD): 179.69 (C-4), 166.03 (C-7), 163.08 (C-5), 161.60 (C-4′), 159.06 (C-9), 158.51 (C-2), 135.57 (C-3), 132.36 (C-2′, 6′), 122.69 (C-1′), 116.10 (C-3′, 5′), 105.67 (C-10), 104.94 (C-1″), 99.87 (C-6), 94.73 (C-8), 77.13 (C-5″), 75.02 (C-3″), 73.01 (C-2″), 70.01 (C-4″), 61.98 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(李昉等，2010)基本一致，故鑒定為kaempferol-3---D-glucopyranoside。

化合物黃色無定型粉末，分子式為CHO。ESI-MS：595 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 8.08 (2H, d,=8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d,=8.8 Hz, H-3′, 5′), 6.42 (1H, d,=2.0 Hz, H-8), 6.22 (1H, d,=2.0 Hz, H-6), 5.14 (1H, d,=7.2 Hz, H-1″), 4.52 (1H, d,=1.6 Hz, H-1?), 1.13 (3H, d,=6.2 Hz, H-6?)。C NMR (125 MHz, CDOD): 179.41 (C-4), 166.24 (C-7), 163.07 (C-5), 161.53 (C-4′), 159.39 (C-2), 158.62 (C-9), 135.51 (C-3), 132.38 (C-2′, 6′), 122.77 (C-1′), 116.14 (C-3′, 5′), 104.63 (C-10), 104.58 (glc C-1″), 102.44 (rha C-1?), 100.05 (C-6), 94.91 (C-8), 78.15 (glc C-3″), 77.23 (glc C-5″), 75.77 (glc C-2″), 73.89 (rha C-4?), 72.29 (glc C-4″), 72.10 (rha C-3?), 71.45 (rha C-2?), 69.74 (rha C-5?), 68.56 (glc C-6″), 17.92 (rha C-6?)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(馮衛(wèi)生等，2007)基本一致，故鑒定為kaempferol-3--rutinoside。

化合物黃色粉末，分子式為CHO。ESI-MS：303 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 7.74 (1H, d,=2.1 Hz, H-2′), 7.64 (1H, dd,=8.4, 2.1 Hz, H-6′), 6.89 (1H, d,=8.5 Hz, H-5′), 6.40 (1H, d,=2.0 Hz, H-8), 6.19 (1H, d,=2.0 Hz, H-6)。C NMR (125 MHz, CDOD): 177.34 (C-4), 165.66 (C-7), 162.53 (C-9), 158.26 (C-5), 148.77 (C-2), 146.24 (C-3′), 137.24 (C-3), 124.15 (C-1′), 121.66 (C-6′), 116.22 (C-5′), 115.98 (C-2′), 104.50 (C-10), 99.25 (C-6), 94.41 (C-8)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(周威等，2013)基本一致，故鑒定為槲皮素(quercetin)。

化合物白色針晶，分子式為CHO。ESI-MS：481 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.77 (1H, d,=2.5 Hz, H-7), 3.91 (1H, d,=3.0 Hz, H-3), 3.80 (1H, ddd,=12.1, 4.5, 3.1 Hz, H-2), 3.27 (1H, dq,=10.6, 1.4 Hz, H-22), 3.11 (1H, ddd,=10.4, 7.4, 2.5 Hz, H-9), 1.17 (3H, s, 27-OCH), 1.16 (3H, s, 26-OCH), 1.15 (3H, s, 21-OCH), 0.93 (3H, s, 19-OCH), 0.85 (3H, s, 18-OCH)。C NMR (125 MHz, CDOD): 206.44 (C-6), 167.97 (C-8), 122.13 (C-7), 85.21 (C-14), 78.40 (C-22), 77.89 (C-20), 71.29 (C-25), 68.69 (C-2), 68.50 (C-3), 51.77 (C-5), 50.51 (C-17), 49.85 (C-13), 42.38 (C-24), 39.26 (C-10), 37.35 (C-1), 35.06 (C-9), 32.84 (C-4), 32.50 (C-15), 31.77 (C-12), 29.71 (C-27), 28.95 (C-26), 27.32 (C-16), 24.41 (C-19), 21.51 (C-11), 21.49 (C-23), 21.05 (C-21), 18.05 (C-18)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Darwish & Reinecke, 2003)基本一致，故鑒定為20-hydroxyecdysone。

化合物白色針晶，分子式為CHO。ESI-MS：465 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.82 (1H, d,=2.6 Hz, H-7), 3.96 (1H, d,=3.0 Hz, H-3), 3.92～3.80 (1H, m, H-2), 3.60 (1H, ddd,=10.2, 3.2, 1.7 Hz, H-22), 3.16 (1H, ddd,=10.2, 7.0, 2.6 Hz, H-9), 2.39 (1H, dd,=12.9, 4.5 Hz, H-5), 1.21 (3H, s, 27-CH), 1.20 (3H, s, 26-CH), 0.98 (3H, s, 19-CH), 0.96 (3H, d,=6.8 Hz, 21-CH), 0.74 (3H, s, 18-CH)。C NMR (125 MHz, CDOD): 206.53 (C-6), 167.62 (C-8), 122.01 (C-7), 85.08 (C-14), 75.25 (C-22), 71.41 (C-25), 68.70 (C-2), 68.51 (C-3), 51.78 (C-5), 48.80 (C-17), 48.13 (C-13), 43.45 (C-20), 42.25 (C-24), 39.24 (C-10), 37.36 (C-1), 35.25 (C-9), 32.88 (C-4), 32.08 (C-12), 32.04 (C-15), 29.61 (C-27), 29.10 (C-26), 27.01 (C-16), 25.33 (C-23), 24.48 (C-19), 21.58 (C-11), 16.20 (C-18), 13.34 (C-21)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Budesinsky et al., 2008)基本一致，故鑒定為-ecdysone。

化合物白色針晶，分子式CHO。ESI-MS：465 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.82 (1H, d,=2.6 Hz, H-7), 3.96 (1H, d,=3.0 Hz, H-3), 3.84 (1H, ddd,=12.2, 4.5, 3.1 Hz, H-2), 3.16 (1H, ddd,=11.3, 7.1, 2.3 Hz, H-9), 1.28 (3H, s, 21-CH), 1.20 (6H, s, 26, 27-CH), 0.97 (3H, s, 19-CH), 0.86 (3H, s, 18-CH)。C NMR (125 MHz, CDOD): 206.46 (C-6), 168.10 (C-8), 122.08 (C-7), 85.52 (C-14), 75.98 (C-20), 71.47 (C-25), 68.70 (C-2), 68.51 (C-3), 53.34 (C-5), 51.80 (C-17),48.06 (C-13), 45.89 (C-24), 45.49 (C-22), 39.26 (C-10), 37.36 (C-1), 35.05 (C-9), 32.87 (C-4), 32.38 (C-15), 31.58 (C-12), 29.34 (C-27), 29.10 (C-26), 26.47 (C-19), 24.40 (C-21), 21.97 (C-11), 21.51 (C-16), 20.11 (C-23), 18.13 (C-18)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(程永現(xiàn)等，2001)基本一致，故鑒定為22-deoxyecdysterone。

化合物白色針晶，分子式CHO。ESI-MS：497 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.82 (1H, d,=2.6 Hz, H-7), 3.95 (1H, d,=2.9 Hz, H-22), 3.84 (1H, ddd,=12.1, 4.4, 3.0 Hz, H-3), 3.66 (1H, dd,=10.4, 2.0 Hz, H-2), 3.53 (1H, dd,=9.6, 2.1 Hz, H-24), 3.16 (1H, ddd,=10.7, 5.2, 2.0 Hz, H-9), 1.23 (3H, s, H-21), 1.20 (3H, s, H-27), 1.16 (3H, s, H-26), 0.97 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, s, H-19)。C NMR (125 MHz, CDOD): 206.44 (C-6), 167.92 (C-8), 122.17 (C-7), 85.22 (C-14), 80.37 (C-24), 78.48 (C-22), 77.82 (C-20), 73.40 (C-25), 68.71 (C-2), 68.52 (C-3), 51.80 (C-5), 50.49 (C-17), 48.61 (C-13), 39.27 (C-10), 37.36 (C-1), 35.10 (C-9), 32.98 (C-23), 32.87 (C-4), 32.48 (C-15), 31.79 (C-12), 26.26 (C-26), 24.50 (C-27), 24.41 (C-19), 21.57 (C-16), 21.52 (C-21), 21.00 (C-11), 18.08 (C-18)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(程春梅等，2010)基本一致，故鑒定為abutasterone。

化合物無色針狀結(jié)晶，CHO。ESI-MS：481 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.82 (1H, d,=2.5 Hz, H-7), 3.96 (1H, br s, H-3), 3.85 (1H, dt,=11.5, 3.5 Hz, H-2), 3.64～3.60 (1H, m, H-24), 3.60～3.57 (1H, m, H-22), 3.16 (1H, m, H-9), 1.22 (3H, s, H-21), 0.98 (3H, s, H-19), 0.96 (3H, d,=6.9 Hz, H-27), 0.92 (3H, d,=6.9 Hz, H-26), 0.90 (3H, s, H-18)。C NMR (125 MHz, CDOD): 206.43 (C-6), 167.90 (C-8), 122.16 (C-7), 85.19 (C-14), 77.74 (C-20), 77.55 (C-22), 77.45 (C-24), 68.70 (C-2), 68.51 (C-3), 51.79 (C-5), 50.44 (C-17), 48.58 (C-13), 39.26 (C-10), 37.36 (C-1), 35.74 (C-23), 35.09 (C-9), 34.10 (C-25), 32.87 (C-4), 32.49 (C-12), 31.77 (C-15), 24.41 (C-19), 21.54 (C-16), 21.54 (C-11), 20.95 (C-21), 19.36 (C-27), 18.05 (C-18), 16.97 (C-26)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(梅文莉等，2006)基本一致，故鑒定為pterosterone。

化合物白色無定型粉末，分子式為CHO。ESI-MS：523 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 6.94 (1H, s, H-2′), 6.92 (1H, s, H-6′), 6.61～6.55 (3H, overlap, H-2, 7′, 5), 6.49 (1H, dd,=8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.31 (1H, dt,=15.8, 5.7 Hz, H-8′), 4.69 (1H, d,=7.5 Hz, H-1″), 4.23 (2H, d,=5.7, H-9′a, 9′b), 4.02～3.93 (1H, m, H-8), 3.84 (3H, s, OCH-3′), 3.78 (2H, overlap, H-9a, 6″a), 3.70 (3H, s, OCH-3), 3.68 (2H, overlap, H-9b, 6″b), 3.49～3.39 (3H, overlap, H-2″, 3″, 4″), 3.16～3.11 (1H, m, H-5″), 2.98 (1H, dd,=13.8, 5.6 Hz, H-7a), 2.73 (1H, dd,=13.8, 9.3 Hz, H-7b)。C NMR (125 MHz, CDOD): 153.46 (C-3′), 148.41 (C-3), 145.36 (C-4), 144.99 (C-4′), 138.96 (C-5′), 135.38 (C-1′), 133.19 (C-1), 131.50 (C-7′), 129.64 (C-8′), 122.58 (C-6), 119.13 (C-6′), 115.64 (C-2), 113.71 (C-5), 109.06 (C-2′), 105.35 (C-1″), 78.09 (C-3″), 77.87 (C-5″), 75.95 (C-2″), 71.24 (C-4″), 66.82 (C-9), 63.68 (C-9′), 62.44 (C-6″), 56.35 (C-10), 56.22 (C-10′), 42.81 (C-8), 39.17 (C-7)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Van et al., 2008)基本一致，故鑒定為icariside E。

化合物白色無定型粉末，分子式為CHO。ESI-MS：525 [ M+H ]，H NMR (600 MHz, CDOD): 6.71 (2H, br s, H-2′, 6′), 6.56～6.52 (2H, m, H-2, 5), 6.46 (1H, dd,=8.1, 2.0 Hz, H-6), 4. 60 (1H, d,= 7.2 Hz, H-1″), 3.95 (1H, m, H-8), 3. 82(1H, m, H-6″a), 3.79 (3H, s, 3′- OCH), 3.76(1H, m, H-9a), 3.74 (1H, m, H-6″b), 3.68 (3H, s, 3-OCH), 3. 65(1H, m, H-9b), 3.56 (2H, t,=6.4 Hz, H-9′a, H-9′b), 3. 44(1H, m, H-3″), 3. 40 (1H, m, H-2″), 3. 32 (1H, m, H-4″), 3.11 (1H, ddd,=8.6, 5.3, 2.4 Hz, H-5″), 2.97 (1H, dd,=13.8, 5.5 Hz, H-7a), 2.70 (1H, dd,=13.8, 5.5 Hz, H-7b), 2.63(2H, t,=7.8 Hz, H-7′a, H-7′b), 1.85～1.76 (2H, m, H-8′a, H-8′b)。C NMR (150 MHz, CDOD): 153.10 (C-3′), 148.38 (C-3), 145.29 (C-4), 143.57 (C-4′), 140.33 (C-1′), 138.54 (C-5′), 133.34 (C-1), 122.58 (C-6), 120.33 (C-6′), 115.61 (C-2), 113.63 (C-5), 111.70 (C-2′), 105.58 (C-1″), 78.06 (C-3″), 77.87 (C-5″), 75.95 (C-2″), 71.23 (C-4″), 67.08 (C-9), 62.46 (C-6″), 62.20 (C-9′), 56.31 (C-10), 56.22 (C-10′), 42.79 (C-8), 39.21 (C-7), 35.59 (C-8′), 33.14 (C-7′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(李慧娟等，2014)基本一致，故鑒定為icariside E。

化合物黃色固體，分子式為CHO。ESI-MS：419 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 6.67 (4H, s, H-2, 6, 2′, 6′), 4.73 (2H, d,=4.1 Hz, H-7, 7′), 4.36～4.20 (2H, m, H-9), 3.89 (2H, dd,=9.1, 3.5 Hz, H-9′), 3.86 (12H, s, -OCH×4), 3.18～3.12 (2H, m, H-8, 8′)。C NMR (125 MHz, CDOD): 149.35 (C-3′, 5′, 3″, 5″), 136.19 (C-4′, 4″), 133.13 (C-1′, 1″), 104.49 (C-2′, 6′, 2″, 6″), 87.63 (C-2, 6), 72.76 (C-4, 8), 56.79 (C-3′, 5′, 3″, 5″-OCH), 55.52 (C-1, 5)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Wang et al., 2009)一致，故鑒定為(+)-syringaresinol。

化合物黃色固體，分子式CHO。ESI-MS：359 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 6.96 (2H, d,=2.0 Hz, H-2, 2′), 6.82 (2H, dd,=8.2, 2.0 Hz, H-6, 6′), 6.78 (2H, d,=8.1 Hz, H-5, 5′), 4.72 (2H, d,=4.3 Hz, H-7, 7′), 4.24 (2H, dd,=9.0, 6.8 Hz, H-9, 9′), 3.87 (6H, s, -OCH×2), 3.85 (2H, dd,=9.0, 3.6 Hz, H-9, 9′), 3.15 (2H, m, H-8,8′)。C NMR (125 MHz, CDOD): 149.13 (C-3, 3′), 147.33 (C-4, 4′), 133.80 (C-1, 1′), 120.06 (C-6, 6′), 116.07 (C-5, 5′), 110.97 (C-2, 2′), 87.53 (C-7, 7′), 72.61 (C-9, 9′), 56.40 (C-OCH×2), 55.38 (C-8, 8′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(In et al., 2015)基本一致，故鑒定為pinoresinol。

化合物無定型粉末，分子式為CHO。ESI-MS：371 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 6.98 (1H, d,=2.0 Hz, H-3′), 6.95 (1H, d,=1.9 Hz, H-3), 6.85 (1H, dd,=7.8, 1.8 Hz, H-5′), 6.84 (1H, dd,=7.8, 1.8 Hz, H-5), 6.83 (1H, d,=7.8, H-6′), 6.80 (1H, d,=7.8, H-6), 5.40 (1H, d,=3.9 Hz, H-7′), 5.24 (1H, d,=3.9 Hz, H-7), 4.30 (1H, dd,=9.4, 6.9 Hz, H-9′), 4.04 (1H dd,=9.5, 6.9 Hz, H-9′), 3.88 (3H, s, 2′-OCH), 3.87 (3H, s, 2-OCH), 3.67 (1H, m, H-8′), 3.40～3.34 (1H, m, H-8)。C NMR (125 MHz, CDOD): 179.69 (C-9), 149.39 (C-2′), 149.18 (C-2), 148.27 (C-1′), 147.49 (C-1), 133.19 (C-4′), 132.39 (C-4), 119.79 (C-5′), 119.50 (C-5), 116.43 (C-6′), 116.16 (C-6), 110.59 (C-3′), 109.69 (C-3), 87.18 (C-7′), 85.09 (C-7), 73.80 (C-9′), 56.48 (C-2′), 56.33 (C-2), 54.45 (C-8′), 51.02 (C-8)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Ma et al., 2013)基本一致，故鑒定為balanophonin B。

化合物白色固體，分子式為CHON。ESI-MS：336 [ M+Na]，H NMR (500 MHz, CDOD): 7.43 (1H, d,=15.7 Hz, H-8′), 7.11 (1H, d,=2.0 Hz, H-2′), 7.05 (2H, d,=8.4 Hz, H-2, 6), 7.02 (1H, dd,=8.2, 2.0 Hz, H-6′), 6.79 (1H, d,=8.2 Hz, H-5′), 6.71 (2H, d,=8.4 Hz, H-3, 5), 6.40 (1H, d,=15.7 Hz, H-7′), 3.88 (3H, s, -OCH), 3.46 (2H, dd,=8.0, 6.8 Hz, H-8), 2.75 (2H, t,=7.4 Hz, H-7)。C NMR (125 MHz, CDOD): 169.19 (C-9′), 156.95 (C-4), 149.98 (C-4′), 149.32 (C-3′), 142.05 (C-7′), 131.29 (C-1), 130.73 (C-2, 6), 128.19 (C-1′), 123.24 (C-6′), 118.66 (C-8′), 116.49 (C-5′), 116.26 (C-3, 5), 111.50 (C-2′), 56.36 (C-OCH), 42.55 (C-8), 35.81 (C-7)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Kan et al., 2011)基本一致，故鑒定為--feruloyl tyramine。

化合物無色針晶，分子式CHO。ESI-MS：197 [ M+H ]，H NMR (500 MHz, CDOD): 5.76 (1H, s, H-7), 4.31～4.13 (1H, m, H-3), 2.43 (1H, dt,=14.0, 2.5 Hz, H-4), 2.00 (1H, dd,=14.3, 2.3 Hz, H-2), 1.77 (3H, s, CH-9), 1. 74( 1H, dd,=14.0, 4.0, H-4), 1.54 (1H, dd,=14.4, 3.7 Hz, H-2), 1.48 (3H, s, CH-10 ), 1.28 (3H, s, CH-11)。C NMR (125 MHz, CDOD): 185.69 (C-8), 174.44 (C-6), 113.34 (C-7), 88.96 (C-5), 67.25 (C-3), 47.98 (C-4), 46.44 (C-2), 37.19 (C-1), 31.02 (C-9), 27.43 (C-11), 26.96 (C-10)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(李燕等，2010)基本一致，故鑒定為(-)-loliolide。

化合物白色片晶，CHO。ESI-MS：255 [M-H]，H NMR (500 MHz, CDCl): 2.32 (2H, t,=7.5 Hz, -CH-COOH), 1.62 (2H, m,=7.5 Hz, -CH-CH-CH), 0.87 (3H, t,=6.9 Hz, -CH-CH)。C NMR (125 MHz, CDCl): 177.68 (s), 33.97 (t), 32.06 (t),29.82 (t), 29.8 (t)1, 29.79 (t), 29.73 (t), 29.59 (t), 29.50 (t), 29.40 (t), 29.24 (t), 24.92 (t), 22.83 (t), 14.25 (q)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(高幼衡等，2002)基本一致，故鑒定為棕櫚酸(palmitic acid)。

2.2 抗炎活性測試結(jié)果

利用MTS法檢測細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，濃度為50 μmol·L時，所測化合物的細(xì)胞活力均大于100%，表明所測化合物對RAW 264.7細(xì)胞均無細(xì)胞毒性(圖2：A)。

圖 1 化合物1-16的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formulas of compounds 1-16

LPS、Dex、化合物測試濃度分別為1 μg·mL-1、10 μmol·L-1和50 μmol·L-1。與LPS組相比，** P< 0.01。LPS, Dex, compounds were tested at a concentration of 1 μg·mL-1, 10 μmol·L-1 and 50 μmol·L-1 respectively. Compared with LPS group, ** P< 0.01.圖 2 化合物1-16對RAW 267.1細(xì)胞活力(A)及對LPS刺激細(xì)胞產(chǎn)生NO(B)的影響Fig. 2 Effects of compounds 1-16 on cell viability (A) and NO production stimulated by LPS in RAW 264.7 cells (B)

利用炎癥模型評價發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，LPS組的NO釋放量顯著增高，表明造模成功。與 LPS 組相比，在50 μmol·L的濃度下，化合物、、無明顯抑制NO生成作用；化合物、、均能在一定程度上抑制NO生成；其中，化合物、、-抑制NO產(chǎn)生的能力與濃度為10 μmol·L的地塞米松相當(dāng)(圖2：B)；進(jìn)一步對其進(jìn)行濃度梯度篩選，結(jié)果表明，化合物、、-對NO產(chǎn)生的抑制率均呈濃度依賴，IC值分別為18.63、40.76、21.46、14.32、16.82、42.31 μmol·L。

3 討論與結(jié)論

本研究通過對拔毒散樣品分離純化，共鑒定16個化合物，涵蓋了較多種類的化合物類型，包括黃酮類3個(化合物-)、甾體類蛻皮激素5個(化合物-)、苯丙素類2個(化合物、)、木脂素類3個(化合物)、酰胺類1個(化合物)、單萜類1個(化合物)以及脂肪酸類1個(化合物)。其中，化合、、均為在該植物中首次分離得到。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體受到體內(nèi)或體外因素的刺激而引發(fā)的應(yīng)激防御性反應(yīng)，與臨床中其他病理過程的發(fā)生關(guān)系密切(于玲玲等，2021)。本研究利用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO為評價模型，綜合化合物結(jié)構(gòu)類型，發(fā)現(xiàn)拔毒散中主要抗炎活性成分為木脂素類化合物，且屬于雙四氫呋喃型木脂素。已有研究表明，雙四氫呋喃型木脂素在抗炎、抗腫瘤、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)以及抗病毒等方面具有較好的活性(于淼等，2013)，其中的抗炎活性在本實驗中得到驗證，但該類成分抗炎活性的構(gòu)效關(guān)系尚不明確。此外，在本研究中，拔毒散中含量較高的蛻皮激素類化合物抗炎效果并不理想。其他研究表明，該類化合物在抗氧化、防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及促進(jìn)表皮細(xì)胞分化等方面具有一定作用(趙一璐等，2010)。綜上，通過抗炎和組織細(xì)胞修復(fù)等方式，拔毒散在傣族民間治療諸瘡腫毒、皮膚瘙癢、跌打損傷、刀槍傷等癥狀的用法有一定的科學(xué)依據(jù)。

本研究豐富了拔毒散的化學(xué)成分，明確了其具有抗炎效果的物質(zhì)基礎(chǔ)，驗證了其在民間用法的科學(xué)性，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供了思路及科學(xué)依據(jù)。