趙春曉， 李漢偉， 蘇秀紅,2*， 蘭金旭,2， 晁利芹

( 1. 河南中醫(yī)藥大學 藥學院， 鄭州 450046； 2. 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 河南中醫(yī)藥大學， 鄭州 450046； 3. 河南中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥科學院， 鄭州 450046 )

鞘柄菝葜()為百合科菝葜屬植物，其根及根莖在我國北方常作為“鐵絲威靈仙”或“鐵絲靈仙”入藥，具有祛風除濕、活血通絡、解毒散結的功效(中藥大辭典，2006)。據(jù)《河南植物志》中記載，河南省菝葜屬植物有14種及2變種(丁寶章，1997)，植物資源豐富，具有較大開發(fā)前景及研究價值。但該屬植物形態(tài)特征和根莖性狀十分相似，特別是鞘柄菝葜與同屬植物糙柄菝葜()極為相似，非專業(yè)人員很難將其正確區(qū)分，同時在第四次全國中藥資源普查中發(fā)現(xiàn)，當?shù)厝罕姵⑵渑c“土茯苓”()或“威靈仙”()等錯采而誤用，據(jù)前人本草考證結果表明，菝葜屬類同品、地區(qū)習用品及偽品諸多(李官政等，2017)，因此亟須開展相應的質量標準研究，建立質量控制體系。

鞘柄菝葜藥材主要含有薯蕷皂苷元、白藜蘆醇、胡蘿卜苷、木栓酮等化學成分(孫學軍等，1995)，其中薯蕷皂苷元具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理作用(何焱等，2013；王平等，2020)，白藜蘆醇具有抗癌、抗病毒和抗衰老等藥理作用(李雨婷等，2020)。前人多將這兩種成分作為菝葜屬植物含量測定指標性成分(杜素蘭等，2007；陳藝粼等，2018；楊宇慧等，2020)，此外，楊宇慧等(2020)在研究同屬植物短梗菝葜()和華東菝葜()時發(fā)現(xiàn)不同批次藥材中活性成分白藜蘆醇含量差異較大，故以其作為控制指標，而在鞘柄菝葜的相關研究較少。綜上所述，本研究選擇薯蕷皂苷元和白藜蘆醇作為鞘柄菝葜指標性成分。

鞘柄菝葜藥材作為地區(qū)習用品使用歷史悠久、臨床療效顯著，雖收載于1991年版《河南省中藥材標準》、1998年版《北京市中藥材標準》、2009年版《甘肅省中藥材標準》、2015年版《陜西省藥材標準》等地方標準，但現(xiàn)行標準中僅對藥材性狀、顯微鑒別、總灰分、酸不溶性灰分進行了限制，有關粉末鑒別特征、指標性成分的鑒別等方面則未作出明確規(guī)定，而且2020年版《中國藥典》仍未收錄該種藥材。至今，其相關質量標準研究仍舊十分單一，本課題在鞘柄菝葜現(xiàn)有研究基礎之上，對其入藥部位根及根莖的性狀、顯微、薄層色譜鑒別、水分、灰分、含量測定等項目進行了系統(tǒng)的研究，以便從源頭上控制其藥材質量，為建立鞘柄菝葜藥材的質量標準提供理論依據(jù)，同時為同屬中藥材的質量標準研究提供思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

實驗樣品采自河南省洛陽市、新鄉(xiāng)市、安陽市、濟源市等地，由河南中醫(yī)藥大學蘇秀紅教授鑒定為鞘柄菝葜()的根及根莖(表1)。

Waterse 2695-2489型高效液相(Waters科技有限公司)；薯蕷皂苷元對照品(批號：140820，質量分數(shù)≥98%)，白藜蘆醇對照品(批號：140327，質量分數(shù)≥98%)均購自四川省維克奇生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 性狀鑒別 對不同產地樣品根及根莖的大小、性狀、色澤、表面、質地、斷面等特征進行觀察與描述。

1.2.2 顯微鑒別 采用徒手切片法觀察不同產地樣品根及根莖橫切面的顯微特征，制作水合氯醛透化片和水裝片觀察粉末的顯微特征。

1.2.3 薄層鑒別 取樣品粉末5 g，加無水乙醇50 mL，超聲(500 W，40 kHz)處理30 min，濾過，濾液加36% HCl 5 mL，加熱回流2 h，放冷，用40% NaOH溶液調至中性，揮至無醇味，殘渣加熱水40 mL溶解，用二氯甲烷振搖提取兩次(40 mL，30 mL)，合并提取液，揮干，加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取薯蕷皂苷元對照品，加甲醇制成0.5 mg·mL的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法(2015年版《中國藥典》通則0502)試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，在烘箱中加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈(365 nm)下檢視。

表 1 鞘柄菝葜樣品的采集信息Table 1 Sample collection informations of Smilax stans

取樣品粉末1 g，加10 mL甲醇，稱重，超聲(500 W，40 kHz)提取20 min，冷卻，稱重，補足重量，濾過，揮干，加甲醇定容至1 mL，作為供試品溶液。另取白藜蘆醇對照品，加甲醇制成0.5 mg·mL的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，用丙酮-氯仿-水-冰醋酸(4∶4∶0.2∶0.5)為展開劑，展開，晾干，置于紫外燈(300 nm)下檢視。

1.2.4 檢查 參照2015年版《中國藥典(四部)》通則0832的烘干法、通則2302的總灰分測定法、通則2201的醇溶性(60%乙醇)浸出物測定法對不同產地樣品進行水分、總灰分、浸出物的測定。

1.2.5 含量測定

1.2.5.1 薯蕷皂苷元含量測定(錢芳芳和張長林，2014；Yi et al.，2014；徐淑珍等，2015)

色譜條件 ZORBAX SB-C色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(80∶20)為流動相，流速為1 mL·min，柱溫為35 ℃，檢測波長為210 nm。

對照品溶液的制備 取薯蕷皂苷元對照品適量，精密稱定，加乙腈制成0.560 mg·mL薯蕷皂苷元對照品溶液。

供試品溶液的制備 取不同產地藥材粉末5 g，精密稱定，置于索氏提取器中，加95%乙醇適量，浸漬過夜，加熱回流至提取液近無色，加36%HCl 5 mL，沸水浴2 h，冷卻，石油醚萃取3次(沸程60～90 ℃)，每次40、30、30 mL，合并萃取液，回收石油醚，加甲醇定容至2 mL，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

線性關系考察 取薯蕷皂苷元對照品適量，精密稱定，配制濃度為0.1、0.2、0.3、0.5、0.7 mg·mL溶液，按照上述色譜條件進行測定，以濃度為橫坐標()，峰面積值為縱坐標()，繪制標準曲線。

精密度試驗 取薯蕷皂苷元對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積并計算相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)值。

穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(Q4)，分別在溶液制備后的0、2、4、6、8、10、12 h測定，記錄峰面積并計算RSD值。

重復性試驗 精密稱定同一份樣品(Q4)6份，制成供試品溶液，記錄峰面積并計算RSD值。

加樣回收率試驗 取已知含量的樣品(Q4)6份2.5 g，精密稱定，按待測成分在原藥材中的含有量，加入等量的對照品溶液，制成供試品溶液進行測定，計算加樣回收率和RSD值。

含量測定 精密吸取各產地供試品和對照品溶液10 μL，按照上述色譜條件進行測定。

1.2.5.2 白藜蘆醇含量測定(王光忠等，2006；孫兢喆，2015)

色譜條件 ZORBAX SB-C色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-水(40∶60)為流動相，流速為0.8 mL·min，柱溫為30 ℃，檢測波長為303 nm。

對照品溶液的制備 取白藜蘆醇對照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.260 mg·mL白藜蘆醇對照品溶液。

供試品溶液的制備 取不同產地藥材粉末1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱重，超聲(100 W，40 kHz)40 min后，冷卻至室溫，補足重量，濾過，揮干，加甲醇定容至5 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

線性關系考察 取白藜蘆醇對照品適量，精密稱定，配制濃度為6.375、12.75、25.5、51、102、255 μg·mL溶液，按照上述色譜條件進行測定，以濃度為橫坐標()，峰面積值為縱坐標()，繪制標準曲線。

精密度試驗 取白藜蘆醇對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積并計算RSD值。

穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(Q4)，分別在溶液制備后的0、2、4、6、8、10、12 h進行測定，記錄峰面積并計算RSD值。

重復性試驗 精密稱定同一樣品(Q4)6份，制成供試品溶液，記錄峰面積并計算RSD值。

加樣回收率試驗 取已知含量的樣品(Q4)6份0.5 g，精密稱定，按待測成分在原藥材中的含有量，加入等量的對照品溶液，制成供試品溶液進行測定，計算加樣回收率和RSD值。

含量測定 精密吸取各產地供試品溶液和對照品溶液10 μL，按照上述色譜條件進行測定。

2 結果與分析

2.1 性狀鑒別

鞘柄菝葜根莖呈“短結節(jié)狀”、深褐色、斷面呈黃白色，在日光下可見小亮點；不定根較多，著生處隆起，基部膨大呈圓錐狀，表面灰褐色，外皮常脫落，脫落處為深褐色，直徑1～2 mm。質堅硬，難折斷(圖1)。

圖 1 鞘柄菝葜根莖及橫斷面圖Fig. 1 Rhizome and cross section of Smilax stans

2.2 顯微鑒別

2.2.1 粉末特征 光學顯微鏡下，淀粉粒眾多，多為單粒，類球形或橢圓形，臍點多呈飛鳥狀、裂縫狀、人字狀、三叉狀、星狀或點狀，復粒多由2～4分粒組成，層紋不明顯，直徑7～55 μm(圖：2 a)；石細胞紅棕色，呈不規(guī)則形，多單個散在，壁厚，孔溝和胞腔明顯，直徑32～106 μm(圖：2 b)。纖維有兩種類型：(1)短梭形纖維，淡黃色，壁厚，孔溝明顯，胞腔較大(圖：2 c)；(2)長柱形纖維，淡黃色或紅褐色，其中淡黃色纖維，壁增厚，孔溝和胞腔明顯，紅褐色纖維，次生壁極度增厚，胞腔不明顯，直徑20～80 μm(圖2：d，e)。導管多為梯紋，偶見網紋，直徑13～39 μm(圖2：f，g)。木化薄壁細胞偶見，不規(guī)則形，其內含有較多的淀粉粒(圖2：h)。木纖維偶見(圖2：i)。草酸鈣針晶成束，偶見嵌入粘液細胞中(圖2：j)。偏光顯微鏡下淀粉粒、石細胞、纖維、導管、木化薄壁細胞、木纖維和草酸鈣針晶等具有偏光現(xiàn)象。淀粉粒呈黑“十”字狀，臍點多偏向一側，少數(shù)位于中央，邊緣白色圓環(huán)明顯；石細胞壁呈亮黃色；淡黃色短梭形纖維，其壁呈亮藍白色；淡黃色長柱形纖維，其壁呈藍白色；紅褐色長柱形纖維，其壁呈亮紅棕色； 網紋導管的管腔呈藍白色、梯紋導管的管腔呈亮藍白色；木化薄壁細胞壁及其內含的淀粉粒呈亮藍白色；木纖維壁呈藍白色；草酸鈣針晶呈多彩色。

a. 淀粉粒; b. 石細胞; c,d,e. 纖維; f. 網紋導管; g. 梯紋導管; h. 木化薄壁細胞; i. 木纖維; j. 草酸鈣針晶(1, 3列: 光學顯微鏡; 2, 4列: 偏光顯微鏡)a. Starch granules; b. Sclerotic cell; c, d, e. Fiber; f. Reticulate vessel; g. Idder vessel; h. Lignified parenchyma cells; i. Wood fiber; j. Needle-like calcium oxalate crystals(1, 3 row: Optical microscope; 2, 4 row: Polarizing microscope).圖 2 鞘柄菝葜粉末特征圖(×400)Fig. 2 Powder microphotoes of Smilax stans(×400)

2.2.2 根莖及不定根橫切面特征 根莖橫切面特征：光學顯微鏡下可見最外層木栓組織由2～3層紅褐色木質化細胞組成，易脫落(圖3：1)；下皮層為1層紅棕色的厚壁細胞；皮層較廣，由7～8層薄壁細胞構成，內皮層由1層黃色的厚壁細胞組成(圖3：2，3，4)，內皮層以內有約十層徑向排列的薄壁細胞；維管束為有限外韌型(圖3：5)；紅棕色的分泌細胞分布于整個根莖橫切面(圖3：8)。偏光顯微鏡下，下皮層厚壁細胞呈亮紅棕色，皮層呈藍白色，內皮層呈亮黃色；內皮層以內的薄壁細胞壁呈藍白色；維管束鞘呈亮藍白色。

A. 光學顯微鏡; B. 偏光顯微鏡; a. ×50; b. ×100; c. ×200; 1. 木栓組織; 2. 下皮層; 3. 皮層; 4. 內皮層; 5. 維管束; 6. 維管束鞘; 7. 木質部; 8. 韌皮部; 9. 分泌細胞。A. Optical microscope; B. Polarizing microscope; a. ×50; b. ×100; c. ×200; 1. Cork tissue; 2. Hypodermis; 3. Cortex; 4. Endodermis; 5. Vascular bundles; 6. Vascular bundle sheath; 7. Xylem; 8. Phloem; 9. Secretory cells.圖 3 鞘柄菝葜根莖橫切面特征圖Fig. 3 Transection microphotoes of rhizome cross section of Smilax stans

不定根橫切面特征：皮層較廣，約占整個橫切面的1/2(圖4：1)；內皮層由1列馬蹄形增厚的石細胞組成且排列成環(huán)(圖4：2)；中柱鞘由5～7層厚壁細胞組成(圖4：3)；輻射型維管束，木質部導管由1個大導管和8～9個小導管徑向排列成環(huán)狀(圖4：5)；髓部約占橫切面的1/5，且含有少數(shù)分泌細胞(圖4：4)。偏光鏡下內皮層呈亮黃色；中柱鞘細胞壁呈亮藍白色；髓部的薄壁細胞壁呈藍白色，其余組織無偏光現(xiàn)象。

A. 光學顯微鏡; B. 偏光顯微鏡; a. ×100; b. ×200; 1. 內皮層; 2. 中柱鞘; 3. 髓; 4. 分泌細胞; 5. 木質部; 6. 韌皮部。A. Optical microscope; B. Polarizing microscope; a. ×100; b. ×200; 1. Endodermis; 2. Pericycle; 3. Pith; 4. Secretory cells; 5. Xylem; 6. Phloem.圖 4 鞘柄菝葜不定根橫切面特征圖Fig. 4 Transection microphotoes of adventitious roots of Smilax stans

2.3 薄層鑒別

供試品色譜中，在與薯蕷皂苷元色譜相應位置上，顯相同藍色熒光斑點，在與白藜蘆醇色譜相應位置上，顯相同亮藍色熒光斑點見圖5。

2.4 檢查

不同產地鞘柄菝葜樣品水分含量為3.72%～7.91%，總灰分含量為1.54%～4.74%，醇溶性浸出物含量為5.08%～7.31%，結果見表2。

表 2 不同產地鞘柄菝葜水分、總灰分、醇浸出物含量Table 2 Water, total ash and alcohol soluble extract contents of Smilax stans from different habitats

2.5 方法學考察及樣品含量測定結果

2.5.1 薯蕷皂苷元

線性關系考察 薯蕷皂苷元對照品在0.10～0.70 mg·mL濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為=2 3843-27795，=0.999 7。

精密度試驗 測得6次對照品溶液的RSD值為1.350%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗 12 h內同一供試品溶液(Q4)的RSD值為1.67%，說明該供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗 6份供試品溶液中薯蕷皂苷元RSD值為0.44%，說明該方法具有良好的重復性。

加樣回收率試驗 6份樣品的平均加樣回收率為93.32%， RSD值為2.69%，表明該方法的準確度良好，具體結果見表3。

表 3 薯蕷皂苷元加樣回收率試驗結果Table 3 Results of added samples recovery test of diosgenin

薯蕷皂苷元含量測定 各產地供試品溶液和薯蕷皂苷元對照品HPLC色譜圖見圖6，含量測定結果見表5。

2.5.2 白藜蘆醇

線性關系考察 白藜蘆醇對照品在6.375～255 μg·mL濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為=100 264-157 654，相關系數(shù)=0999。

精密度試驗 測得6次對照品溶液的RSD值為1.02%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗 12 h內同一供試品溶液(Q4)的RSD值為1.42%，說明該供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗 6份供試品溶液中白藜蘆醇RSD值為1.97%，說明該方法具有良好的重復性。

加樣回收率試驗 6份樣品的平均加樣回收率為96.45%，RSD為2.94%，表明該方法的準確度良好，具體結果見表4。

表 4 白藜蘆醇加樣回收率試驗結果Table 4 Results of added samples recovery test of resveratrol

白藜蘆醇含量測定 各產地供試品溶液和白藜蘆醇對照品的HPLC色譜圖見圖7，含量測定結果見表5。

表 5 不同產地鞘柄菝葜薯蕷皂苷元和白藜蘆醇含量Table 5 Contents of diosgenin and resveratrol in Smilax stans from different habitats

3 討論與結論

本研究利用性狀鑒別、顯微鑒別對不同產地的鞘柄菝葜的入藥部位“根及根莖”進行了系統(tǒng)的生藥學研究，發(fā)現(xiàn)鞘柄菝葜根及根莖橫切面顯微特性突出：內皮層為1層黃色的厚壁細胞，紅棕色的分泌細胞分布于整個橫切面；不定根內皮層由1列馬蹄形增厚的亮黃色石細胞組成且排列成環(huán)。粉末特征明顯：石細胞紅褐色、纖維為淡黃色短梭形纖維，淡黃色或紅褐色長柱形纖維、導管為梯紋導管和網紋導管。以上特征可作為鞘柄菝葜藥材及其同屬混淆品區(qū)分的主要依據(jù)。同時，初步起草了鞘柄菝葜藥材的質量標準，規(guī)定其性狀與顯微特征相符，薄層色譜鑒別斑點清晰，建議鞘柄菝葜藥材水分不得超過9.0%，總灰分不得超過7.0%，醇溶性浸出物不得少于3.0%。本品按干燥品計算，含薯蕷皂苷元(CHO)含量不得少于0.015%，白藜蘆醇(CHO)含量不得少于0.012%。

鞘柄菝葜為菝葜屬“土茯苓”組植物，李官政等(2017)指出“中柱鞘狹窄”為該組植物不定根顯微結構的共性，但是其對于“狹窄”的界定范圍不明確，本研究發(fā)現(xiàn)鞘柄菝葜的中柱鞘為5～7層，但杜素蘭等(2007)發(fā)現(xiàn)為7～9層。此外，前人報道同組植物“土茯苓”、小葉菝葜()、無刺菝葜()與西南菝葜()中柱鞘分別為4～8層、 3～5層、 5～12層、1～6層(陳代賢等，2003)，故筆者認為有關“中柱鞘狹窄”的這一觀點有待探討。同時，本研究發(fā)現(xiàn)鞘柄菝葜不定根中的“中柱鞘細胞”由木化的厚壁細胞組成，在偏振光下更為明顯， 該特征與李官政等(2017)結論相悖，他認為鞘柄菝葜的中柱鞘由薄壁細胞組成，但本研究與杜素蘭等(2007)報道一致，故認為木化的“厚壁細胞”是鞘柄菝葜不定根顯微結構的一個主要特征。

A. 對照品溶液； B. 供試品溶液； 1. 薯蕷皂苷元。A. Reference substance solution; B. Smilax stans substance solution; 1. Diosgenin.圖 6 薯蕷皂苷元對照品溶液與樣品HPLC色譜圖Fig. 6 HPLC chromatograms of diosgenin reference substance solution and sample

A. 對照品溶液； B. 供試品溶液； 1. 白藜蘆醇。A. Reference substance solution; B. Smilax stans substance solution; 1. Resveratrol.圖 7 白藜蘆醇對照品溶液與樣品HPLC色譜圖Fig. 7 HPLC chromatograms of resveratrol reference substance solution and sample

本次研究所采集的樣品具有較好的代表性，結果可全面有效地控制鞘柄菝葜藥材質量，為其資源開發(fā)利用及臨床正確用藥奠定了基礎，同時為菝葜同屬中藥材的質量標準研究提供思路與方法。