彭斯格熱希 薩仁高娃 吉日木巴圖

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)民族醫(yī)藥創(chuàng)新中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110

蒙藥三味阿拉坦其其格散（簡稱三味散），別名三味木鱉子散、日來那木吉樂，由玫瑰花、金色訶子、木鱉子組成，該方劑最早記載于《蒙醫(yī)金匱》[1]中，根據(jù)《蘭塔布》[2]等蒙醫(yī)古文獻(xiàn)和臨床經(jīng)驗(yàn)，三味散是唯一主治綜合性蒙醫(yī)希拉病的方劑。方中玫瑰花能聚攏擴(kuò)散之消化希拉，為主藥；金色訶子清除寒熱二種希拉病，為輔藥；木鱉子清希拉熱，為佐藥，對熱性和寒性希拉病均有療效[3]。從三味散的單味藥功效來看，玫瑰花能行氣解郁、調(diào)和氣血、止痛，用于治療食少嘔惡、肝胃氣痛、月經(jīng)不調(diào)、跌撲傷痛，清希拉、祛赫依功能，治希拉病[4-5]。金色訶子能滋補(bǔ)身體、溫胃消食、調(diào)理體素功能，治赫依、希拉、巴達(dá)干等諸疾[5]。木鱉子能清希拉，清熱解毒，治胃腸希拉、黃疸、消化不良、腹脹、肝膽脾熱[5]?？梢姡N單味藥都對胃腸病有療效。

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是臨床常見的功能性胃腸道疾病，起源于胃十二指腸區(qū)域，反復(fù)發(fā)作，無器質(zhì)性改變，具有上腹脹、食欲不振、餐后飽脹和不適、早飽、上腹部灼燒、惡心和嘔吐等癥狀[6]。調(diào)查顯示，F(xiàn)D的全球發(fā)病率為5.3%～20.4%[7-8]。FD具有反復(fù)發(fā)作、難以緩解的特點(diǎn)，造成患者反復(fù)就醫(yī)，甚至嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，消耗大量的醫(yī)療資源[9]。

1 資料與方法

1.1 三味散有效成分和靶點(diǎn)基因收集

通過BATMAN數(shù)據(jù)庫和TCMSP平臺以木鱉子、玫瑰花、金色訶子為關(guān)鍵詞檢索其有效成分和靶點(diǎn)基因，BATMAN數(shù)據(jù)庫設(shè)定為Score≥20進(jìn)行篩選，TCMSP平臺篩選條件為口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，最后得到三味散有效成分及其靶點(diǎn)基因。

1.2 FD靶點(diǎn)收集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫以“functional dyspepsia”為關(guān)鍵詞檢索關(guān)于FD疾病靶點(diǎn)。

1.3 “活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖繪制

使用DrawVennDiagram網(wǎng)站對三味散靶點(diǎn)基因和FD疾病靶點(diǎn)取交集靶點(diǎn)，并利用交集靶點(diǎn)在Cytoscape軟件繪制三味散“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，隨后使用Cytoscape軟件中Network Analyzer分析功能對其進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值篩選核心活性成分。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING平臺對獲得的交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)繪制，并將PPI網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件中，繪制三味散蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，隨后使用Cytoscape軟件中Network Analyzer分析功能進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值篩選核心蛋白。

1.5 KEGG富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，設(shè)定閾值P≤0.5，通路分析選擇KEGG，并將得到網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)使用Rstudio和Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，繪制其排名前20個(gè)條目的氣泡圖和“通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接

將“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中度值最高的5個(gè)核心活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值最高的5個(gè)核心蛋白用AutoDockTools軟件進(jìn)行分子對接，驗(yàn)證其相互作用強(qiáng)度，通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取核心活性成分結(jié)構(gòu)，通過RCSB PDB數(shù)據(jù)獲取核心蛋白結(jié)構(gòu)，分子對接結(jié)果借助Pymol軟件進(jìn)行優(yōu)化制圖。

2 結(jié)果

2.1 三味散有效成分及其靶點(diǎn)獲取

以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為 篩 選 條 件 在TCMSP平臺進(jìn)行篩選，以Score≥20為篩選條件在BATMAN數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，收集到亞油酸、槲皮素、油酸等有效成分47個(gè)，其中木鱉子9個(gè)、玫瑰花18個(gè)、金色訶子22個(gè)，木鱉子和玫瑰花共有1個(gè)、玫瑰花和金色訶子共有1個(gè)，共得到其相應(yīng)的1001個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.2 FD靶點(diǎn)獲取

檢 索 詞 選 擇“functional dyspepsia”，收 集FD靶點(diǎn)，從GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中共收集到2476個(gè)疾病靶點(diǎn)，取疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)基因的交集，得到兩者297個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.3 三味散“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖分析

使用Cytoscape繪制297個(gè)交集靶點(diǎn)的三味散“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1，網(wǎng)絡(luò)圖通過Cytoscape軟件中Network Analyzer功能計(jì)算分析，得到347個(gè)節(jié)點(diǎn)，1109個(gè)邊條，平均度值為6.4，根據(jù)度值篩選排名前10名的核心活性成分，見表1。

表1 度值前10的核心活性成分

圖1 三味散“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將297個(gè)交集靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，對獲取到的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)使用Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，得到了295個(gè)節(jié)點(diǎn)，5475條邊，平均度值為37.1，根據(jù)度值篩選前10的核心蛋白，見表2。

表2 度值前10的核心蛋白

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 KEGG富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對297個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)校正后P值進(jìn)行排序，共獲得到135條（P≤0.05）信號通路，選擇度值排名前20的核心通路繪制氣泡圖，見圖3；“通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。

圖3 KEGG富集分析氣泡圖

圖4 “通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接

利用AutoDockTools軟件將“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中得到的節(jié)點(diǎn)度值最高的5個(gè)核心活性成分亞油酸、槲皮素、油酸、蕨素A、去甲氧基茵陳色原酮分別與PPI網(wǎng)絡(luò)圖中排名前5位的INS、AKT1、IL6、MAPK3、EGFR核心蛋白進(jìn)行分子對接，分子對接詳細(xì)結(jié)果見圖5，分子對接構(gòu)象見圖6，其中槲皮素與AKT1（-7.9 kCal/mol）結(jié)合性最好，從圖中可看出槲皮素與AKT1相互作用，結(jié)合后呈現(xiàn)較強(qiáng)的親和能力。

圖5 核心活性成分與核心蛋白結(jié)合熱能圖

圖6 槲皮素與AKT1分子對接圖

3 討論

FD病因和發(fā)病機(jī)制可能與胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙、胃酸分泌異常、腦腸軸及胃腸激素、腸道菌群失調(diào)、幽門螺桿菌感染、精神和心理因素、內(nèi)臟高敏感性、遺傳、環(huán)境與飲食習(xí)慣和生活方式等密切相關(guān)[10]。

對三味散有效成分進(jìn)行分析，槲皮素具有調(diào)節(jié)胃腸平滑肌、抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[11]，其可以促進(jìn)功能性便秘大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)[12]，而且實(shí)驗(yàn)證明其對胃腸平滑肌具有雙向調(diào)節(jié)作用[13]，槲皮素可通過拮抗5-HT受體調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)，改善呃逆、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀，通過影響p38絲裂原激活蛋白激酶、Bcl-2和Bax的水平，預(yù)防與幽門螺桿菌感染相關(guān)的細(xì)胞凋亡和胃炎[14]。對三味散蛋白進(jìn)行分析，AKT1是蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，是PI3K-Akt信號通路中的重要調(diào)節(jié)分子，位于AKT1上游的PI3K可在受到體內(nèi)細(xì)胞因子和內(nèi)部環(huán)境中各種物理和化學(xué)因素刺激后被激活，以產(chǎn)生肌醇，肌醇充當(dāng)?shù)诙攀梗{(diào)節(jié)磷酸化的AKT，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游相關(guān)因子，調(diào)節(jié)許多細(xì)胞周期過程，包括新陳代謝、增殖、生存和生長等，下游eNOS是No的調(diào)節(jié)酶，No作為信號通路的末端及其重要信使分子，具有抑制胃腸蠕動(dòng)和胃腸肌肉收縮的功能[15-16]。從三味散信號通路分析，PI3K-Akt信號通路是與胃黏膜修復(fù)相關(guān)的通路，參與修復(fù)受損的胃黏膜和胃上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控，PI3K-Akt信號通路有可能是治療FC小鼠的功能性便秘的重要路徑[17]。分子對接結(jié)果表明槲皮素與AKT1蛋白結(jié)合性最好，也最穩(wěn)定，槲皮素可能通過作用AKT1蛋白調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路在治療FD中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究初步證明了三味阿拉坦其其格散主要通過其中成分槲皮素作用于AKT1蛋白，并通過PI3K-Akt信號通路，進(jìn)而治療功能性消化不良，可為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。