伍耀宏，陳榮春

（江西省贛州市人民醫(yī)院，贛州 341000）

椎間盤(pán)退變是引起腰腿痛的主要原因，可引起椎間盤(pán)細(xì)胞數(shù)量減少和功能異常[1]。表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)成分（蛋白聚糖（Aggrecan,Agg）、Ⅱ型膠原蛋白（Collagen Ⅱ,Col Ⅱ））合成與降解失衡,進(jìn)而導(dǎo)致髓核水分丟失，椎間盤(pán)高度下降、椎間盤(pán)應(yīng)力重新分布[2-3]。最終引起纖維環(huán)的破裂，退變髓核因壓力沿纖維環(huán)破口疝出壓迫神經(jīng)并引發(fā)相應(yīng)神經(jīng)癥狀[4-5]。此前對(duì)于椎間盤(pán)突出引起的腰腿痛治療方法主要包括保守治療和手術(shù)治療，但會(huì)伴隨相鄰椎間盤(pán)退變等并發(fā)癥，目前尚無(wú)十分理想的治療方法。故實(shí)驗(yàn)對(duì)椎間盤(pán)退變及其加重機(jī)制進(jìn)行研究，有望提高椎間盤(pán)退突出的手術(shù)療效。

1 研究對(duì)象及方法

1.1 主要試劑和儀器 TNF-α 干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液、LG-DMEM 培養(yǎng)基（Solarbio,美國(guó)）；胎牛血清（FBS）、I 型膠原酶、胰蛋白酶（Biosharp,美國(guó)）；細(xì)胞增殖試劑盒，NF-κB、Agg、Col II、Sox-9 抗體（ebioscience，美國(guó)）；FC500 流式細(xì)胞儀、倒置相差顯微鏡、EXL-800 酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只BALB/c 小鼠，4～6 周齡，18～20 g，購(gòu)自菲諾克生物科技（上海）有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0005。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 椎間盤(pán)退變?cè)炷＜癗PSCs 分離培養(yǎng) 采用X 線片定位尾椎椎間隙并標(biāo)記。小鼠稱重，腹腔注射麻醉（1%戊巴比妥鈉，35 mg/kg）。麻醉成功后固定小鼠呈俯臥位，碘伏消毒鼠尾，使用21G 定制造模穿刺器械對(duì)小鼠尾椎Co6/7、Co8/9 的椎間盤(pán)行橫貫和半橫貫穿刺，穿刺針平行于椎體垂直皮膚進(jìn)針，從皮膚開(kāi)始向椎間盤(pán)方向半橫貫穿刺深度為5 mm，橫貫穿刺為10 mm 剛好穿透對(duì)側(cè)皮膚，停留30 s 后拔出。在術(shù)后4 周腹腔注射戊巴比妥鈉處死小鼠，分離鼠尾髓核組織剪碎至六孔板內(nèi)，0.2%二型膠原酶消化、離心漂洗，以10% FBS 重懸混勻并接種于培養(yǎng)瓶，分別加入100 μL 不同濃度TNF-α（0,0.1、1、5、10 ng/mL）培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 h，3 d換液1 次。光鏡觀察細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行傳代，每2 d 更換一次培養(yǎng)液，傳代后取P3 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用含不同濃度梯度TNF-α（0、0.1、1、5、10 ng/mL）的培養(yǎng)液培養(yǎng)NPSCs，分別列為0 ng/mL TNF-α 組、0.1 ng/mL TNF-α 組、1 ng/mL TNFα 組、5 ng/mL TNF-α 組、10ng/mL TNF-α 組。對(duì)NPSCs 三系誘導(dǎo)分化,成脂分化：細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)（2×104），待融合至100%進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，3 d 換液1 次，21 d 后油紅O 染色觀察誘導(dǎo)情況。成骨分化：細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)（2×104），待融合80%左右進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，3 d 換液1 次，21 d 后茜素紅染色觀察誘導(dǎo)情況。成軟骨誘導(dǎo)分化：細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)（6×105），3 d 換液1 次，21 d 后甲苯胺藍(lán)染色觀察誘導(dǎo)情況。

1.3.2 MTT 檢測(cè)NPSCs 增殖情況 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，各組每孔加MTT 溶液20 μL，培養(yǎng)4 h 吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO 孵育10～20 min，于0、3、5 d 檢測(cè)各孔吸光值，繪制曲線。

1.3.3 Western-blot 檢測(cè)NF-κB 蛋白 提取總蛋白，測(cè)定濃度，電泳、轉(zhuǎn)模、封閉1 h，加入（1∶1000）一抗（NF-κB，GAPDH），孵育12 h，加入HRP 標(biāo)記（1∶5000）二抗，孵育2 h，顯影，檢測(cè)NF-κB 蛋白表達(dá)水平。

1.3.4 β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老 棄孔板中培養(yǎng)液，PBS 沖洗，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，固定0.5 h。棄固定液，PBS 洗滌3 次加染色液。孵育12 h。去工作液，封片保存。光鏡觀察衰老細(xì)胞數(shù)目。

1.3.5 成軟骨分化能力檢測(cè) 利用0，1，10 ng/mL濃度的TNF-α 干預(yù)NPSCs，檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平。提取總蛋白測(cè)定濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h，加入（1:1000）一抗（Agg、Col II、Sox -9、GAPDH），孵育12 h。加入HRP 標(biāo)記（1∶5000）二抗，孵育2 h，顯影。檢測(cè)Agg、Col II、Sox-9 蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 NPSCs 三系分化鑒定 成脂誘導(dǎo)：油紅O 染色見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)形成脂滴團(tuán)，有鮮紅色脂滴泡；成骨誘導(dǎo)：茜素紅染色顯示細(xì)胞內(nèi)紅染礦化鈣鹽結(jié)節(jié)沉積；成軟骨誘導(dǎo)：甲苯胺藍(lán)染色觀察提示細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)多角形軟骨細(xì)胞，陰性對(duì)照：未見(jiàn)陽(yáng)性結(jié)果，見(jiàn)圖1。

2.2 NPSCs 增殖情況 隨TNF-α 濃度升高，NPSCs的增殖能力逐漸減弱，與0 ng/mL TNF-α 組比較，其他濃度TNF-α 培養(yǎng)下NPSCs 增殖能力均下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 NF-κB 蛋白表達(dá)水平 隨TNF-α 濃度升高，NF-κB 蛋白表達(dá)水平逐漸增高，與0 ng/mL TNFα 組比較，其他濃度TNF-α 培養(yǎng)下NF-κB 蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 NPSCs 衰老染色情況 隨TNF-α 濃度升高，衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，與0 ng/mL TNF-α組比較，其他濃度TNF-α 培養(yǎng)下衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5 成軟骨分化能力 三種不同濃度TNF-α 濃度下成軟骨分化后Agg、Col II、Sox-9 蛋白表達(dá)水平比較無(wú)差異（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨TNF-α 濃度升高，NPSCs的增殖能力降低，NF-κB 蛋白表達(dá)水平增高，細(xì)胞衰老程度增高。在進(jìn)行NPSCs 誘導(dǎo)分化后，成脂分化后細(xì)胞內(nèi)形成脂滴團(tuán)及鮮紅色脂滴泡，成骨分化出現(xiàn)大量礦化鈣鹽結(jié)節(jié)沉積，成軟骨分化細(xì)胞呈不規(guī)則多角形軟骨細(xì)胞樣，不同濃度TNF-α 成軟骨分化后Agg、Col II、Sox-9 水平無(wú)差異。

椎間盤(pán)退變首先發(fā)生于髓核組織，表現(xiàn)為髓核組織脫水，蛋白多糖及ColII 含量減少[6-7]。這一過(guò)程伴隨炎癥反應(yīng)，TNF-α 在炎癥反應(yīng)中快速合成分泌，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平[8]。NF-κB 作為T(mén)NF-α的下游信號(hào)通路，它能夠調(diào)控DNA 轉(zhuǎn)錄過(guò)程，參與應(yīng)激反應(yīng)[9]。韓亞新[10]研究指出，TNF-α 參與椎間盤(pán)退變的發(fā)生心及良過(guò)程，但與椎間盤(pán)退變程度并無(wú)聯(lián)系。而在韓建軍[11]的近一步研究中明確了椎間盤(pán)退變程度與TNF-α 水平存在相關(guān)性，TNFα 越高，椎間盤(pán)退變程度越嚴(yán)重。桂輝瓊[12]則是通過(guò)TNF-α 抑制劑進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)抑制TNF-α 可有效延緩椎間盤(pán)退變，TNF-α 抑制藥劑有望成為延緩椎間盤(pán)退變的治療方法，應(yīng)用前景廣闊。而椎間盤(pán)退變與NPSCs 密切相關(guān)，NPSCs 增殖及分化能力降低，使髓核細(xì)胞數(shù)量減少，蛋白多糖及Col II分泌減少，導(dǎo)致椎間盤(pán)脫水，高度降低，最終引起椎間盤(pán)退變。此次實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNF-α 對(duì)NPSCs 增殖、分化及衰老均存在影響，從細(xì)胞水平說(shuō)明TNF-α 與椎間盤(pán)退變的聯(lián)系，并通過(guò)NF-κB 通路發(fā)現(xiàn)TNF-α 引起NPSCs 增殖及分化受阻可能是下調(diào)NF-κB 表達(dá)有關(guān)。Liu[13]及Zhu[14]的研究表明，下調(diào)NF-κB 可改善椎間盤(pán)退變程度，降低疼痛感，靶向NF-κB 治療將可作為潛在方法用于椎間盤(pán)退變的生物治療。Agg、Col II、Sox-9 在NPSCs 成軟骨分化中逐漸合成，能夠作為標(biāo)志物檢測(cè)。Agg 是一種復(fù)合糖，是結(jié)締組織的纖維成分，可以起到潤(rùn)滑關(guān)節(jié)的作用[15]。Col II 是由軟骨細(xì)胞分泌的一種膠原蛋白，保護(hù)并聯(lián)結(jié)各組織[16]。Sox-9 是在軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中Sox-9 通過(guò)翻譯后修飾，調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子水平，影響軟骨形成[17]。在此次研究中，通過(guò)誘導(dǎo)成軟骨分化，在檢測(cè)Agg、Col II、Sox-9 水平后，發(fā)現(xiàn)三種不同濃度TNF-α 培養(yǎng)下NPSCs 的Agg、Col II、Sox-9 蛋白表達(dá)水平無(wú)差別，說(shuō)明Agg、Col II、Sox-9 可作為NPSCs 分化的檢測(cè)標(biāo)志物。陳臻浩[18]在研究中指出，SOX-9 調(diào)節(jié)組蛋白修飾微小RNA 調(diào)控軟骨細(xì)胞分化，是軟骨細(xì)胞分化機(jī)制之一。結(jié)合此次研究，不同濃度TNF-a 作用下NPSCs 成軟骨分化后均能夠檢測(cè)出Agg、Col II、Sox-9 且水平無(wú)異，可同時(shí)作為NPSCs 城軟骨分化鑒定的檢測(cè)標(biāo)志物。

綜上，TNF-α 可進(jìn)一步降低退變椎間盤(pán)來(lái)源小鼠NPSCs 的增殖，加快NPSCs 衰老，進(jìn)一步加速椎間盤(pán)的退變進(jìn)程。NF-κB 通路抑制藥劑延緩髓核干細(xì)胞衰老有望為椎間盤(pán)退變生物 治療提供新的治療方法及希望，具有較大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。