劉 穎，詹凌波，王蕾，王新有，范文霞，孫明玲，趙冠云，郭新紅

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心，新疆維吾爾自治區(qū)血液病研究所， 烏魯木齊 830054；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310012)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常見的一種類型，具有高度侵襲性及異質(zhì)性。一線方案化療后，仍有30%～40%的患者演變?yōu)閺?fù)發(fā)難治性DLBCL[1-4]。有無B組癥狀、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評分和β2-微球蛋白(β2-MG)水平是與DLBCL預(yù)后密切相關(guān)的重要標(biāo)志物[1,5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫功能失調(diào)是DLBCL疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，免疫檢查點可通過免疫抑制性受體與配體的相互作用，激活一系列信號通路，下調(diào)T淋巴細(xì)胞的活性。程序性死亡受體-1(PD-1)和淋巴細(xì)胞活化基因-3(LAG-3)是兩種常見的免疫抑制受體，可以通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。在多種實體腫瘤的微環(huán)境中，檢測到CD8+T淋巴細(xì)胞上PD-1、LAG-3的高表達(dá)[7-9]，Yang等[10]在濾泡性淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境(TME)中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)上高表達(dá)PD-1、LAG-3，且LAG-3與PD-1有協(xié)同作用，共同影響CD8+T淋巴細(xì)胞的功能。這預(yù)示著PD-1、LAG-3高表達(dá)可能與腫瘤進(jìn)展及患者不良預(yù)后相關(guān)。

本研究通過檢測DLBCL患者外周血CD8+T細(xì)胞上PD-1、LAG-3的表達(dá)水平，分析其與患者B癥狀、IPI評分及β2-MG水平的關(guān)系，并探討PD-1、LAG-3的表達(dá)對DLBCL患者外周血CD8+T細(xì)胞功能的影響及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1研究對象本研究共選取2019年8月至2020年12月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心住院的17例初治DLBCL患者為病例組，選取同時期10例年齡、性別相匹配的健康體檢者為對照組。病例組中男性11例(64.7%)，女性6例(35.3%)，患者中位年齡64歲(38～83歲)。所有患者均診斷為DLBCL，起病時IPI(<3分)為低危/低中危組6例，IPI(≥3分)為中危組/高危組11例。11例使用R-CHOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、表阿霉素、長春新堿、強的松)方案化療，6例使用R-CDOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、脂質(zhì)體阿霉素、長春新堿、強的松)方案化療。六療程治療后的DLBCL患者采用2014年版的Lugano標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行臨床療效評估，其中7例DLBCL患者完成評估，11例患者失訪，7例完成評估的患者中，5例(71.4%)患者完全緩解(CR)，1例(14.3%)患者為部分緩解(PR)，1例(14.3%)患者為疾病穩(wěn)定(SD)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理診斷符合2016年WHO造血和淋巴組織腫瘤分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，且均經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科通過形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)方法確診為DLBCL；(2)具有較完整的臨床資料及完整的治療情況記錄與隨訪結(jié)果；(3)初次發(fā)病，既往未接受過任何放化療等治療。健康對照組10例，均為本地區(qū)健康體檢者，并通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，告知本試驗的目的和意義，所有患者與健康對照均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)資料不全及失訪者；(2)有其他腫瘤、免疫缺陷性疾病、感染性疾病等伴發(fā)疾病者。

1.3方法

1.3.1 標(biāo)本采集 無菌采集DLBCL患者治療前后及正常對照組清晨空腹外周血5 mL，使用肝素鈉抗凝，以上標(biāo)本均經(jīng)2 000 r/min離心10 min，吸取上清液于EP管中，將剩下的全血加入等量PBS吹打混勻，再輕輕注入淋巴細(xì)胞分離液(購自BD Biosciences公司)中，2 000 r/min離心20 min，此時離心管中由上至下分為4層，分別為血漿層、乳白色淋巴細(xì)胞層、透明分離液層、紅細(xì)胞層，用巴氏管輕輕收集淋巴細(xì)胞層，加入4 mL PBS與其充分混勻，1 000 r/min離心5 min，洗滌2次即得所需淋巴細(xì)胞。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD8+T細(xì)胞表面LAG-3、PD-1表達(dá)水平 將分離好的DLBCL患者及正常對照組淋巴細(xì)胞分別置入兩支流式管中，再向流式管中分別加入CD3-PerCP、CD8-FITC、LAG-3-APC、PD-1-PE各10 μL，混勻后室溫避光15 min，用PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分析PD-1+LAG-3-CD8+T細(xì)胞、PD-1-LAG-3+CD8+T細(xì)胞、PD-1+LAG-3+CD8+T細(xì)胞、PD-1-LAG-3-CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1病例組與對照組CD8+T細(xì)胞PD-1、LAG-3所占比例比較與對照組相比，病例組PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+及PD-1+LAG-3+CD8+T細(xì)胞比例較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；與正常對照組相比，DLBCL患者組PD-1-LAG-3-CD8+T細(xì)胞比例較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 病例組與對照組CD8+T細(xì)胞PD-1、LAG-3所占比例比較

2.2病例組治療前后CD8+T細(xì)胞PD-1、LAG-3所占比例比較病例組經(jīng)治療后PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+及PD-1+LAG-3+CD8+T細(xì)胞比例均較治療前明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。病例組治療前后PD-1-LAG-3-CD8+T細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。病例組治療前后及對照組CD8+T細(xì)胞上PD-1、LAG-3的表達(dá)趨勢如圖1。

表2 病例組治療前后CD8+T細(xì)胞PD-1、LAG-3所占比例比較

進(jìn)一步選取病例組中7例未失訪的病例，將其治療前后PD-1、LAG-3的表達(dá)水平行配對t檢驗。經(jīng)治療后病例組PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+及PD-1+LAG-3+CD8+T細(xì)胞比例均較治療前明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，治療前后PD-1-LAG-3-CD8+T細(xì)胞的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 7例未失訪病例組患者治療前后CD8+T細(xì)胞PD-1、LAG-3所占比例比較

2.3病例組CD8+T細(xì)胞PD-1、LAG-3的所占比例與各臨床指標(biāo)之間的關(guān)系病例組中，起病時伴有B組癥狀的患者PD-1+LAG-3-CD8+T細(xì)胞比例較無B組癥狀的患者高，進(jìn)一步行Point-biserial檢驗，PD-1+LAG-3-CD8+T細(xì)胞比例與DLBCL患者B癥狀具有顯著相關(guān)性(r=0.598，P<0.05)，PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細(xì)胞比例與B癥狀無顯著相關(guān)性(P>0.05)；IPI≥3分患者與IPI<3分患者比較，PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細(xì)胞比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；β2-MG≥ 2.2 mg/L的患者與β2-MG<2.2 mg/L的患者比較，PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細(xì)胞比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細(xì)胞比例與患者的IPI評分、β2-MG水平均無顯著相關(guān)性(r=0.598，P>0.05)，見表4。

表4 病例組CD8+T細(xì)胞PD-1、LAG-3所占比例與各臨床指標(biāo)之間的關(guān)系

3 討論

DLBCL作為一種高度異質(zhì)性的侵襲性淋巴瘤，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，且治療反應(yīng)及預(yù)后差異性較大，目前隨著對DLBCL研究的逐漸深入，腫瘤免疫治療逐漸成為DLBCL治療的新手段。CD8+T淋巴細(xì)胞是TME中最重要的一類免疫細(xì)胞，是抑制或清除腫瘤細(xì)胞的主要力量。然而，由于T細(xì)胞負(fù)性共刺激分子的過表達(dá)，使得其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力被不同程度削弱或耗盡，近年來，隨著對腫瘤免疫治療研究的逐漸深入，針對免疫抑制分子PD-1/PD-L1在惡性腫瘤治療中的研究已經(jīng)取得顯著進(jìn)展，然而，Ansell等[17]在研究納武利尤單抗(Nivolumab)對復(fù)發(fā)性/難治性DLBCL患者的研究中發(fā)現(xiàn)，使用Nivolumab單藥治療的有效率僅為10%左右；另一項對接受PD-1/PD-L1抑制劑治療晚期非小細(xì)胞肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，納入的93例患者中，36例患者(38.7%)發(fā)生了原發(fā)性耐藥[18]。以上研究說明，使用免疫檢查點抑制劑單藥治療，由于存在耐藥現(xiàn)象、應(yīng)答率低等缺點，仍使得一部分患者治療效果不理想。研究發(fā)現(xiàn)，另一些免疫檢查點如LAG-3與 PD-1/PD-L1通路阻斷的抵抗有關(guān)。在多種實體腫瘤(如卵巢癌、乳腺癌、肺癌等)的微環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞上LAG-3的高表達(dá)，并且其表達(dá)與PD-1+T細(xì)胞增加有關(guān)[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在初治DLBCL患者體內(nèi)，PD-1+LAG-3-CD8+T、PD-1-LAG-3+CD8+T及PD-1+LAG-3+CD8+T細(xì)胞的比例均較對照組升高，治療后明顯下降。提示PD-1、LAG-3在DLBCL的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，可能是部分DLBCL患者的潛在生物標(biāo)志物或治療靶點。Chen等[22]研究也發(fā)現(xiàn)DLBCL的腫瘤侵潤淋巴細(xì)胞(TIL)上存在PD-1、LAG-3高表達(dá)，并且PD-1+的TIL計數(shù)與LAG-3+TIL計數(shù)之間呈正相關(guān)。張小可等[23]在研究R-CHOP方案對DLBCL患者PD-1的影響時也發(fā)現(xiàn)，使用R-CHOP方案治療六療程后，DLBCL患者PD-1表達(dá)水平較治療前明顯降低。

DLBCL是成人發(fā)病率最高的淋巴瘤類型，臨床上伴有B組癥狀、血清β2-MG水平升高及IPI評分≥3分均被認(rèn)為是DLBCL預(yù)后不良的重要因素。本研究進(jìn)一步分析病例組CD8+T細(xì)胞PD-1、LAG-3的表達(dá)水平與各臨床指標(biāo)之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，伴有B癥狀的DLBCL患者組較無B癥狀患者組相比，PD-1+LAG-3-CD8+T細(xì)胞比例較高，PD-1+LAG-3-CD8+T細(xì)胞比例與DLBCL患者B癥狀具有顯著相關(guān)性，PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細(xì)胞的比例，與DLBCL患者B癥狀無顯著相關(guān)性。

PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細(xì)胞的比例與患者的IPI評分、β2-MG水平均無顯著相關(guān)性。錢素英等[15]的研究顯示，與正常淋巴組織相比，DLBCL患者CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)較高，且與IPI評分呈正相關(guān)；劉笑吟等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1、LAG-3、TIM-3共表達(dá)與較高的IPI評分相關(guān)，而PD-1、LAG-3單獨陽性表達(dá)與多種臨床指標(biāo)之間的比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。另一項關(guān)于外周T細(xì)胞淋巴瘤的研究顯示，PD-1的陽性表達(dá)率在不同IPI評分、有無B癥狀之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義[25]。Fang等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在IPI評分<3分、無B癥狀的DLBCL患者TIL上表達(dá)較高。Kiyasu等[27]的研究也發(fā)現(xiàn)，在DLBCL患者TIL上PD-1的表達(dá)在無B癥狀患者體內(nèi)更高，以上研究結(jié)果與本試驗結(jié)果所得結(jié)論存在差異，原因可能是本實驗所檢測的是DLBCL患者外周血CD8+T細(xì)胞上PD-1、LAG-3的水平，而PD-1、LAG-3存在于腫瘤微環(huán)境的多種免疫細(xì)胞上，不同細(xì)胞亞群上上述免疫抑制分子的表達(dá)水平及臨床意義可能不盡相同，且本試驗為單中心研究，樣本量較少，治療后部分患者療效未達(dá)到CR，今后可擴大樣本量以減少其他因素對結(jié)果的影響。

綜上所述，本研究探討了DLBCL患者CD8+T細(xì)胞上PD-1、LAG-3的表達(dá)水平與健康人之間的差異，以及治療前后表達(dá)水平的變化，并進(jìn)一步分析了免疫抑制分子PD-1的表達(dá)水平與DLBCL患者B癥狀之間的相關(guān)性，提示其可能與DLBCL患者的腫瘤負(fù)荷及預(yù)后存在一定關(guān)系。目前對于DLBCL患者免疫檢查點PD-1、LAG-3通路及臨床意義方面的研究相對較少，PD-1、LAG-3是否能夠作為DLBCL患者的潛在治療靶點尚需進(jìn)一步研究。