胡亞紅 劉丹丹 高薇 孟慶紅 姚開虎

百日咳是疫苗可預(yù)防疾病，確診依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷[1]。有免疫接種史的青少年和成人罹患百日咳時(shí)，多因初期病情較輕而易被忽視，致就診時(shí)間較晚而失去細(xì)菌學(xué)或核酸檢測(cè)時(shí)機(jī)[2]。此時(shí)，應(yīng)該考慮血清學(xué)診斷方法。百日咳毒素(pertussis，PT)為百日咳鮑特菌所特有，并且免疫原性強(qiáng)，故PT-IgG抗體檢測(cè)易于標(biāo)準(zhǔn)化[3]。PT也是百日咳疫苗主要抗原成分之一，PT-IgG抗體水平也可反映疫苗或自然感染后機(jī)體獲得的特異免疫水平。目前，臨床上檢測(cè)PT-IgG 抗體常用的方法為酶聯(lián)免疫法(ELISA)[1]。膠體金試紙條是以膠體金為標(biāo)志物，依據(jù)層析作用檢測(cè)抗原、抗體反應(yīng)，操作便捷、經(jīng)濟(jì)且檢測(cè)時(shí)間短，易于推廣使用，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域[4]。本研究采用診斷性試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)膠體金法評(píng)估PT-IgG水平的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床選擇血清學(xué)檢測(cè)方法評(píng)估百日咳免疫水平和診斷百日咳提供參考依據(jù)。

材料和方法

一、研究對(duì)象

根據(jù)臨床送檢要求，按送檢倒序時(shí)間從首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室凍存于零下30 ℃的血清樣本中連續(xù)選取6個(gè)月內(nèi)的PT-IgG檢測(cè)結(jié)果<20 IU/ml和≥20 IU/ml的標(biāo)本各100份(ELISA檢測(cè)，試劑盒由德國(guó)歐蒙有限公司生產(chǎn))，因1份標(biāo)本量不足以完成3項(xiàng)檢測(cè)予以排除，最終納入199份樣本作為研究對(duì)象。其中，濃度分布在<5、5～<20、20～<80、≥80 IU/ml者分別為50、50、76、23份。

二、檢測(cè)方法

1.ELISA法檢測(cè)：為保證血清樣本在同一時(shí)間檢測(cè)狀況的一致性，研究再次使用ELISA法檢驗(yàn)血清PT-IgG抗體水平。采用試劑盒為德國(guó)賽潤(rùn)有限公司生產(chǎn)，按照說(shuō)明書步驟操作。在已包被有PT抗原標(biāo)板中，分別加入待檢測(cè)血清和參考品，依次加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體和底物，于37 ℃孵育，顯色后加入終止液。酶標(biāo)儀讀取樣本吸光度值并計(jì)算樣品抗體濃度(IU/ml)。

2.膠體金法：由編盲員對(duì)入選標(biāo)本進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，再分別交給兩組人員進(jìn)行不同界值的膠體金法檢測(cè)。最后揭盲并整合分析結(jié)果。采用武漢生命科技股份有限公司生產(chǎn)的百日咳PT-IgG膠體金試紙條(圖1)進(jìn)行檢測(cè)。方法如下：于加樣孔依次加入10 μl血清、樣本稀釋液50 μl，加樣后20 min讀取結(jié)果。判讀方法：將同時(shí)出現(xiàn)紅色檢測(cè)線和質(zhì)控線判斷為陽(yáng)性，將僅出現(xiàn)質(zhì)控線且未出現(xiàn)檢測(cè)線判斷為陰性，將僅出現(xiàn)檢測(cè)線或無(wú)檢測(cè)線和質(zhì)控線出現(xiàn)判斷為無(wú)效(圖2)。本研究中的膠體金試紙條采用20 IU/ml 作為百日咳免疫保護(hù)界值，80 IU/ml作為百日咳感染的診斷界值(疫苗接種超過(guò)1年)。

圖1 百日咳PT-IgG膠體金試紙條

圖2 百日咳PT-IgG膠體金法檢測(cè)結(jié)果判讀

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以ELISA法檢測(cè)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，使用敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和約登指數(shù)等指標(biāo)評(píng)估膠體金法的檢測(cè)效能，其中約登指數(shù)值范圍為0～1，指數(shù)越大其真實(shí)性越好。計(jì)數(shù)資料以“標(biāo)本份數(shù)/百分率(%)”描述。

結(jié) 果

一、檢測(cè)界值為20 IU/ml的膠體金檢測(cè)結(jié)果

199份標(biāo)本中，ELISA檢測(cè)血清PT-IgG濃度≥20 IU/ml的標(biāo)本有105份(52.8%)，而膠體金法檢測(cè)陽(yáng)性為84份(42.2%)。以ELISA檢測(cè)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，膠體金法檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性漏檢率、誤檢率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比、陰性似然比和約登指數(shù)分別為76.2%(80/105)、 95.7%(90/94)、23.8%(25/105)、4.3%(4/94)、95.2%(80/84)、78.3%(90/115)、17.7、4.0和0.7。具體見表1。

表1 膠體金法以ELISA檢測(cè)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估PT-IgG抗體水平的檢測(cè)效能

二、檢測(cè)界值為80 IU/ml的膠體金檢測(cè)結(jié)果

199份標(biāo)本中，ELISA法檢測(cè)有23份(11.6%)血清PT-IgG濃度≥80 IU/ml，以80 IU/ml為檢測(cè)界值的膠體金法有76份(38.2%)陽(yáng)性。以ELISA檢測(cè)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，膠體金法檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性漏檢率、誤檢率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比、陰性似然比和約登指數(shù)分別為100.0%(23/23)、 69.9%(123/176)、0.0%(0/0)、30.1%(53/176)、30.3%(23/76)、100.0%(123/123)、0.3、0.0和0.7。具體見表1。

討 論

百日咳是一種由百日咳鮑特菌引起的傳染性極強(qiáng)的呼吸道疾病，嬰兒罹患百日咳時(shí)病情可迅速進(jìn)展，易出現(xiàn)并發(fā)癥，病死率高[5]。接種百日咳疫苗后，近期的保護(hù)效力相對(duì)較高，但4～5年后的保護(hù)效力下降至50%左右，且隨著時(shí)間的推移，下降幅度更大[6]。感染百日咳鮑特菌后可發(fā)生百日咳，但有典型表現(xiàn)的患者較少見，不典型的輕癥患者更為多見。由于缺少實(shí)驗(yàn)室診斷條件等原因，這些不典型患者很難獲得及時(shí)診斷，常被誤診或漏診[2]。國(guó)內(nèi)多地血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也提示百日咳發(fā)病在我國(guó)并不少見，年均報(bào)告發(fā)病率已由2009年的0.12/10萬(wàn)上升至2019年的2.15/10萬(wàn)[7]，且存在嚴(yán)重的誤診和漏診現(xiàn)象[8-11]，尤其在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)條件有限的基層單位更是如此。

沒(méi)有獲得及時(shí)診斷和治療的百日咳感染者是重要的傳染源，也是百日咳難于有效防控的根源。尤其是在基層醫(yī)院建立快速準(zhǔn)確的診斷方法，對(duì)于提高百日咳的診斷率、及時(shí)防控和治療尤為重要。百日咳感染后可出現(xiàn)血清PT-IgG升高，一般取疑似患者急性期與恢復(fù)期兩份血清標(biāo)本，當(dāng)后者抗體滴度比前者升高≥4倍時(shí)具有診斷意義[1]。但臨床上往往不能獲得雙份血清，因此目前多數(shù)國(guó)家采用特定的PT-IgG界值進(jìn)行單份血清檢測(cè)。但對(duì)于單次血清學(xué)診斷百日咳的檢測(cè)方法和閾值等問(wèn)題，國(guó)際上并沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同國(guó)家和地區(qū)采用的界值有所不同，如30、50、100和125 IU/ml[12-17]。根據(jù)本課題組前期國(guó)內(nèi)人群百日咳免疫水平的評(píng)估結(jié)果[18-19]和檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明，本研究中的膠體金試紙條，采用20 IU/ml作為百日咳免疫保護(hù)界值，80 IU/ml作為百日咳感染的診斷界值(疫苗接種超過(guò)1年)。

ELISA法是檢驗(yàn)血清PT-IgG抗體水平的確診依據(jù)。本研究以ELISA法為參照標(biāo)準(zhǔn)，界值為20 IU/ml的膠體金檢測(cè)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(95.2%)和特異度(95.7%)較高，有助于明確PT-IgG抗體水平>20 IU/ml的群體；不足的是，對(duì)>20 IU/ml的標(biāo)本存在一定的漏檢，敏感度僅有76.2%。因此，對(duì)于檢測(cè)陰性的對(duì)象，需進(jìn)一步采用ELISA方法確認(rèn)其水平。而界值為80 IU/ml的膠體金檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值和敏感度高(均為100.0%)，特異度(69.9%)和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(30.3%)低，有助于判斷無(wú)百日咳感染，可用于排除百日咳感染；不足的是誤診率高，故對(duì)于檢測(cè)陽(yáng)性的患者，需進(jìn)一步檢測(cè)其抗體濃度水平或聯(lián)合其他檢測(cè)方法以降低誤診率。以ELISA檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，兩種界值膠體金檢測(cè)方案的約登指數(shù)均為0.7，達(dá)到中等水平，如果能進(jìn)一步完善其技術(shù)和產(chǎn)品，提高約登指數(shù)，將更有利于臨床應(yīng)用和推廣。同時(shí)，可考慮開發(fā)并評(píng)估其他檢測(cè)界值的膠體金試紙條，從而將檢測(cè)結(jié)果定位到更為具體的數(shù)值范圍，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。臨床應(yīng)用過(guò)程也可以考慮評(píng)估動(dòng)態(tài)變化，以輔助臨床診斷的價(jià)值。

綜上所述，以ELISA法為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)膠體金法檢測(cè)PT-IgG水平，檢測(cè)界值為20 IU/ml的膠體金法檢測(cè)的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較高，陽(yáng)性結(jié)果較為可靠，表明機(jī)體有一定水平的百日咳免疫；檢測(cè)界值為80 IU/ml的膠體金檢測(cè)的敏感度和陰性預(yù)測(cè)值較高，結(jié)合臨床可用于排除百日咳急性或近期感染。另外，膠體金試紙條檢測(cè)操作簡(jiǎn)便快捷，更適合在一些條件相對(duì)較差的基層醫(yī)院推廣使用。但目前膠體金法檢測(cè)的準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步提高，有些結(jié)果需要一步檢測(cè)濃度水平，但這并不影響其作為國(guó)內(nèi)臨床評(píng)估百日咳免疫水平和診斷百日咳的重要替代方法。

志謝本研究中使用的膠體金試紙條由武漢生命科技股份有限公司制備，并無(wú)償提供，在此表示感謝！

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)胡亞紅和劉丹丹：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫和修改；高薇：統(tǒng)計(jì)分析；孟慶紅：解釋數(shù)據(jù)；姚開虎：指導(dǎo)論文修改