廖路敏，王嬌嬌，儲(chǔ)浩然，李奎武, 鄒 玲，阮靜茹，祝姍姍，陳進(jìn)雨，丁義俠，王婧吉，何雨霞

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061)

腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)是一種常見的功能性腸病，30%～50%的功能性胃腸病患者存在內(nèi)臟敏感性增高，主要表現(xiàn)為腹痛或腹部不適，且伴有稀便、水樣便或排便次數(shù)增多等癥狀。西醫(yī)治療多采用腸蠕動(dòng)抑制劑、微生物調(diào)節(jié)劑等藥物對(duì)癥處理，雖可緩解患者臨床癥狀，但長期使用會(huì)產(chǎn)生便秘、頭痛、惡心等不良反應(yīng)[1]。

艾灸療法可以改善IBS-D患者的內(nèi)臟高敏感狀態(tài)，緩解患者腹瀉、腹痛等癥狀，臨床療效良好[2-4]，具有臨床操作簡單、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)，但其作用機(jī)制尚未明確。眾所周知，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)信號(hào)傳遞系統(tǒng)與腸道感覺密切相關(guān)，雖有研究[5]報(bào)道了艾灸治療IBS的作用機(jī)制與調(diào)節(jié)5-HT有關(guān)，但對(duì)影響5-HT合成、釋放的上游調(diào)節(jié)物質(zhì)，以及對(duì)內(nèi)臟高敏感狀態(tài)導(dǎo)致腹瀉、腹痛癥狀的相關(guān)性，尚缺乏相關(guān)研究。

近年來有研究[6-7]報(bào)道，微小RNA(micro RNAs,miRNAs)參與IBS內(nèi)臟高敏感狀態(tài)的形成，miRNAs的調(diào)控在IBS內(nèi)臟高敏感狀態(tài)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。還有多個(gè)研究[9]表明，miRNAs對(duì)5-HT信號(hào)系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，其中5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter，SERT)是微小RNA-24(micro RNA-24，miR-24)的潛在靶基因[9-10]。另有研究[11]表明，miR-24等參與了對(duì)5-HT的調(diào)節(jié)。艾灸治療IBS-D的作用機(jī)制是否與調(diào)節(jié)miR-24表達(dá)，影響SERT對(duì)5-HT的調(diào)節(jié)，進(jìn)而抑制內(nèi)臟高敏感，改善腹瀉、腹痛癥狀有關(guān)，目前尚未見有關(guān)研究報(bào)道。因此，艾灸療法緩解內(nèi)臟高敏感狀態(tài)的作用機(jī)制，有待進(jìn)一步探究。

本研究采用母子分離+醋酸刺激+慢性束縛的方法建立IBS-D大鼠模型，運(yùn)用病理及分子生物學(xué)等方法，觀察艾灸對(duì)miR-24/SERT/5-HT通路的影響，并對(duì)IBS-D大鼠稀便率及引起疼痛有關(guān)的物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在為艾灸改善IBS-D內(nèi)臟高敏感狀態(tài)的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 4只清潔級(jí)SD孕鼠(購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量為(350±20)g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2017-001。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房，室溫基本恒定在(22±2)℃，普通飼料飼養(yǎng)，產(chǎn)下幼鼠39只。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合國家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)已獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：AHUCM-rats-2020011)。

1.2 主要試劑 5-HT、SERT、5-羥色胺受體4(serotonin receptor 4，5-HT4R)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)、P物質(zhì)(substance P，SP)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒：武漢基因美生物科技有限公司；SERT、5-HT4R的PCR引物(批號(hào) 20200522)：上海生工生物工程股份有限公司；兔抗SERT、5-HT4抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；七氟烷(批號(hào) 65190506)：魯南貝特制藥有限公司；細(xì)艾條(規(guī)格 0.7 cm×12 cm)：岳陽市艾建堂生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(RT-6000)：雷杜生命科學(xué)股份有限公司；熒光顯微鏡(BX51)：日本Olympus公司；熒光定量PCR儀(PIKOREAL 96)：美國Thermo scientific；圖像分析軟件Image J：美國National Institute of Health；超微量分光光度計(jì)(OD1000+)：南京五義科技有限公司；全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(Pannoramic MIDI)：匈牙利3DHISTECH公司。

2 方法

2.1 IBS-D大鼠模型的制備和分組 隨機(jī)選擇12只幼年大鼠作為正常組，其余幼年大鼠參考有關(guān)報(bào)道，采用母子分離+醋酸刺激+慢性束縛法制作IBS-D大鼠模型[12]。母子分離[13]：幼年大鼠自出生第2天起，每日上午9時(shí)取出，與母鼠分開飼養(yǎng)3 h，隨后放回，連續(xù)14 d。出生第15天不再進(jìn)行母子分離，所有幼年大鼠全部正常飼養(yǎng)至第24天，對(duì)其進(jìn)行斷奶，取出母鼠。第30天將全部幼年大鼠雌雄分籠飼養(yǎng)。醋酸直腸刺激[14]：在幼鼠35 d齡予結(jié)直腸內(nèi)醋酸灌腸刺激。幼年大鼠禁食不禁水12 h后，將石蠟油潤滑的直徑1 mm單腔中心靜脈導(dǎo)管經(jīng)肛門插入結(jié)直腸內(nèi)4 cm，緩慢注入1 mL 4%醋酸溶液，隨后將尾部抬高60 s，然后注入1 mL的PBS緩沖液沖洗結(jié)腸。慢性束縛法[15]：醋酸刺激后第3天用紙膠帶束縛幼年大鼠前肢及上半身(包括前肩、前上肢、胸部)，限制幼年大鼠前上肢抓撓頭面部，但不限制其活動(dòng)，每天2 h，連續(xù)束縛7 d。正常組不作任何處理。模型復(fù)制成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠稀便率達(dá)到60%，腹部回撤反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)的最小容量閾值降低至少0.20 mL。模型復(fù)制過程中死亡3只大鼠，將模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、艾灸組，每組12只。

2.2 干預(yù)措施 正常組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，不予其他干預(yù)；模型組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，不予其他干預(yù)；艾灸組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，予以艾灸干預(yù)。將大鼠俯臥于特制大鼠艾灸架上，在平靜狀態(tài)下將直徑0.7 cm×12 cm細(xì)艾條固定于艾灸支架下。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[16]大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位?！疤鞓小?ST 25)位于平臍水平線，前正中線旁開5 mm?！吧暇尢摗?ST 37)位于下肢外側(cè)，腓骨小頭下10 mm。距穴位約2 cm處，每日1次，每穴每次灸15 min，連續(xù)7 d。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 稀便率 將各組大鼠分別放進(jìn)不同鐵籠，籠底為稀疏的網(wǎng)格，鐵籠下方放置托盤并放置一張與托盤同樣大小的普通定性濾紙。6 h后，將所有大鼠放回飼養(yǎng)籠中。記錄大鼠糞便總粒數(shù)、稀便粒數(shù)，以濾紙上有無污跡為判斷稀便的標(biāo)準(zhǔn)，共觀察 6 h。稀便率=稀便數(shù)/總排便粒數(shù)×100%。

2.3.2 內(nèi)臟敏感性評(píng)估 采用結(jié)腸擴(kuò)張法對(duì)大鼠進(jìn)行AWR評(píng)分，以評(píng)估大鼠內(nèi)臟敏感性。固定由兩名不知曉分組情況的成員負(fù)責(zé)操作，測(cè)定前12 h大鼠禁食不禁水。大鼠吸入七氟烷輕度麻醉后，將甘油潤滑的6F導(dǎo)尿管緩慢插入肛門7 cm后用膠帶將導(dǎo)尿管固定于大鼠尾根部，置大鼠于透明玻璃盒中，待大鼠蘇醒且狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)經(jīng)球囊注入(27±1)℃的生理鹽水，記錄引起大鼠AWR達(dá)3分時(shí)的注水量，重復(fù)檢測(cè)3次，取3次注水量的均值作為該大鼠AWR的最小容量閾值[17-18]。AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，大鼠無行為反應(yīng)；1分，輕微頭部運(yùn)動(dòng)，無身體運(yùn)動(dòng)；2分，腹肌收縮，但腹部不離平臺(tái)表面；3分，腹肌收縮，腹部離開平臺(tái)表面；4分，身體拱起，骨盆抬起，會(huì)陰抬離平臺(tái)表面[19]。

2.3.3 結(jié)腸病理學(xué)觀察 取甲醛固定的結(jié)腸組織，PBS溶液沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5 μm；采用蘇木精-伊紅染色，梯度乙醇(100%→95%→80%)脫蠟，流水沖洗，以蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下放大400倍觀察每張切片的結(jié)腸組織形態(tài)，拍照并保存圖像。

2.3.4 ELISA法檢測(cè)血清、中腦和結(jié)腸組織中5-HT、SERT、5-HT4R、CGRP、SP的水平 取血清標(biāo)本、凍存中腦組織和凍存結(jié)腸組織，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀依序測(cè)定450 nm波長處各孔的吸光度值，并計(jì)算相應(yīng)濃度。

2.3.5 RT-PCR 檢測(cè)中腦和結(jié)腸組織中miR-24、SERT、5-HT4R、CGRP、SP mRNA表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒說明書，用Trizol試劑提取中腦及結(jié)腸組織總RNA，在EP管中進(jìn)行RT反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取出cDNA作為熒光定量的模板，完成熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后得到CT值，根據(jù)2-ΔΔCT計(jì)算樣本mRNA表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)中腦及結(jié)腸組織中SERT、5-HT4R、CGRP、SP蛋白表達(dá)水平 提取中腦及結(jié)腸組織蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白含量，具體步驟根據(jù)BCA試劑盒的說明書進(jìn)行，后進(jìn)行蛋白變性，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，滴加一抗(SERT抗體、5-HT4R抗體、SP抗體均按1∶1 000稀釋，CGRP抗體按1∶5 000稀釋)，再滴加二抗(1∶20 000稀釋)。用ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴在PVDF膜上，最后用化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，用自動(dòng)曝光機(jī)曝光顯影，用Image J軟件進(jìn)行膠片條帶的分析，以β-actin為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白與β-actin吸光度的比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 正常組大鼠毛發(fā)有光澤，飲食正常，活動(dòng)如常，反應(yīng)靈敏；模型組大鼠精神較萎靡，毛發(fā)無光澤，飲食減少，活動(dòng)量減弱，大便不成形，有不同程度的腹瀉。模型復(fù)制前(34 d)，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型復(fù)制后(45 d)，與正常組比較，模型組、艾灸組大鼠體質(zhì)量均明顯減少(P<0.05)；干預(yù)后(53 d)，與模型組比較，艾灸組大鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.05)。見圖1。

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組大鼠稀便率和AWR最小容量閾值比較 模型復(fù)制后(45 d)，與正常組比較，模型組、艾灸組大鼠稀便率明顯升高(P<0.05)，AWR最小容量閾值明顯下降(P<0.05)；干預(yù)后(53 d)，與模型組比較，艾灸組大鼠稀便率明顯下降(P<0.05)，AWR最小容量閾值明顯升高(P<0.05)。見圖2。

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化 正常組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，結(jié)腸黏膜上皮呈單層柱狀，黏膜上皮完整，無炎癥細(xì)胞浸潤等病理組織學(xué)改變，未見糜爛、水腫。模型組大鼠結(jié)腸組織偶見上皮細(xì)胞排列不整齊，局部少量炎癥細(xì)胞浸潤，可見黏膜下輕度糜爛、水腫。艾灸組大鼠結(jié)腸組織黏膜下炎癥細(xì)胞減少，未見糜爛、水腫。見圖3。

注：箭頭所示為炎癥細(xì)胞浸潤

3.4 各組大鼠血清、中腦、結(jié)腸組織中SERT、5-HT、5-HT4R、CGRP、SP水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清、中腦和結(jié)腸組織中5-HT、5-HT4R、CGRP、SP水平均顯著升高(P<0.05)，SERT水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，艾灸組大鼠血清、中腦和結(jié)腸組織中5-HT、5-HT4R、CGRP、SP水平均顯著降低(P<0.05)，SERT水平顯著升高(P<0.05)。見圖4。

3.5 各組大鼠中腦、結(jié)腸組織中miR-24、SERT、5-HT4R、CGRP、SP mRNA表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠中腦、結(jié)腸組織中miR-24、5-HT4R、CGRP、SP mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，SERT mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，艾灸組大鼠中腦、結(jié)腸組織中miR-24、5-HT4R、CGRP、SP mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，SERT mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。見圖5。

3.6 各組大鼠中腦、結(jié)腸組織中SERT、5-HT4R、CGRP、SP蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠中腦、結(jié)腸組織中SERT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，5-HT4R、CGRP、SP蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，艾灸組大鼠中腦、結(jié)腸組織中SERT蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，5-HT4R、CGRP、SP蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖6。

4 討論

中醫(yī)典籍中并無IBS-D的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)?？蓺w屬為“腹痛”“泄瀉”和“郁證”等病證范疇。《景岳全書》云：“泄瀉之本，無不由脾胃?！币罁?jù)“中焦如衡，非平不安”的中醫(yī)理論思想，臨床多采用“調(diào)和脾胃”之法來權(quán)衡樞紐[20-21]，穴位選取天樞和上巨虛。天樞穴為手陽明大腸經(jīng)募穴，可調(diào)理中焦、調(diào)暢氣機(jī)。上巨虛為大腸經(jīng)下合穴，《靈樞·邪氣臟腑病形》記載：“合治內(nèi)腑”，故本穴尤善調(diào)腸和胃。合募配穴治療腑病，意在升清降濁、補(bǔ)中益氣、止瀉止痛。本研究發(fā)現(xiàn)，IBS-D大鼠稀便率升高，AWR最小容量閾值下降，內(nèi)臟敏感性增強(qiáng)。艾灸天樞、上巨虛干預(yù)后，IBS-D大鼠稀便率降低，AWR最小容量閾值上升，內(nèi)臟敏感性減弱。結(jié)果提示艾灸可以有效改善IBS-D大鼠稀便率，緩解腹瀉等內(nèi)臟高敏感狀態(tài)。

5-HT是腦-腸互動(dòng)中具有外周致痛作用的重要單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[22]，當(dāng)中樞系統(tǒng)及胃腸道5-HT水平異常升高，堆積后可觸發(fā)興奮性毒性，使迷走神經(jīng)調(diào)控功能受損，出現(xiàn)內(nèi)臟高敏感狀態(tài)[23-24]。SERT是5-HT失活的重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體，因而SERT的表達(dá)活性可能通過影響5-HT系統(tǒng)的活性而影響內(nèi)臟高敏感狀態(tài)的產(chǎn)生[25]。本研究結(jié)果表明，IBS-D大鼠腦、腸、血清中5-HT水平均顯著上升，SERT水平下降，SERT蛋白及基因表達(dá)水平降低，內(nèi)臟敏感性升高。艾灸后，5-HT水平均顯著下降，SERT水平上升，SERT蛋白及基因表達(dá)水平升高，內(nèi)臟敏感性降低。這提示艾灸干預(yù)可提高SERT蛋白及基因表達(dá)水平，抑制5-HT活性，進(jìn)而降低IBS-D大鼠內(nèi)臟敏感性。

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

在5-HT眾多受體中，5-HT4R與IBS的內(nèi)臟高敏感狀態(tài)較為密切，5-HT與5-HT4R結(jié)合后，開放電壓敏感性鈣通道，促使CCRP、SP等傷害性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放增加，影響胃腸道的運(yùn)動(dòng)與分泌，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)反射及內(nèi)臟感覺[26]。此外，腸道中5-HT4R也可直接參與內(nèi)臟感覺信息的傳遞[27]。有報(bào)道證實(shí)，5-HT4R激動(dòng)劑可減少正常大鼠對(duì)直結(jié)腸機(jī)械刺激的內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反應(yīng)，使5-HT4R激動(dòng)劑預(yù)處理后的內(nèi)臟高敏感模型大鼠的腸道神經(jīng)痛覺敏感性減弱或正常化[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，IBS-D大鼠腦、腸、血清中5-HT4R水平上升，5-HT4R蛋白及基因表達(dá)水平升高，可引起IBS-D大鼠腸道運(yùn)動(dòng)反應(yīng)增強(qiáng)。艾灸后，5-HT4R水平、蛋白及基因表達(dá)水平均降低。結(jié)果提示艾灸可能通過下調(diào)5-HT4R表達(dá)水平，使IBS-D大鼠腸道運(yùn)動(dòng)反應(yīng)減弱，從而降低內(nèi)臟敏感性。

SP在痛覺傳遞中的鎮(zhèn)痛作用是通過促進(jìn)腦啡肽的釋放實(shí)現(xiàn)的[29]。CGRP是在外周感覺傳入神經(jīng)中與SP共存的一種神經(jīng)肽，除了可以直接產(chǎn)生傷害性作用外，還可以通過促進(jìn)SP釋放、抑制SP分解、延長SP作用時(shí)間等機(jī)制參與內(nèi)臟傷害性信息的傳入，導(dǎo)致內(nèi)臟敏感性增高[30-31]。本研究結(jié)果顯示，IBS-D大鼠腦、腸、血清中CGRP、SP蛋白及基因表達(dá)水平均明顯升高，表明IBS-D大鼠引發(fā)致痛物質(zhì)增加。艾灸干預(yù)后，腦、腸、血清中CGRP、SP水平、蛋白及基因表達(dá)水平均明顯降低。這提示艾灸可能通過抑制CGRP、SP疼痛物質(zhì)對(duì)胃腸道的傷害性刺激，抑制疼痛信號(hào)傳遞，緩解內(nèi)臟敏化狀態(tài)。

有研究[9，32]表明，SERT mRNA是miR-24的靶基因，且miR-24與SERT的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，miR-24抑制劑可以增加IBS小鼠近端結(jié)腸的疼痛閾值和傷害性閾值水平，降低過氧化物酶活性，并上調(diào)腸黏膜上皮細(xì)胞SERT的mRNA和蛋白表達(dá)水平。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。IBS-D大鼠miR-24表達(dá)水平升高，SERT mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。艾灸干預(yù)后，miR-24表達(dá)水平降低，SERT mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，表明艾灸通過調(diào)節(jié)miR-24表達(dá)水平，從而提高SERT mRNA和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而減低5-HT對(duì)腸道的影響，改善內(nèi)臟高敏感狀態(tài)。

綜上，艾灸天樞、上巨虛穴可調(diào)控IBS-D大鼠miR-24/SERT/5-HT通路，緩解腹痛、腹瀉等不適癥狀，其機(jī)制可能是通過下調(diào)miR-24表達(dá)水平，增強(qiáng)SERT的表達(dá)，減少異常升高的5-HT與5-HT4R結(jié)合，抑制CGRP、SP的產(chǎn)生，降低腸道痛覺傳入神經(jīng)的興奮性，進(jìn)而緩解內(nèi)臟高敏感狀態(tài)。本研究對(duì)促進(jìn)艾灸療法治療IBS-D的臨床應(yīng)用提供了新的科學(xué)依據(jù)。然而，艾灸治療IBS-D的作用機(jī)制復(fù)雜，產(chǎn)生改善內(nèi)臟高敏感狀態(tài)的因素較多，本研究僅僅圍繞miR-24/SERT/5-HT通路進(jìn)行了初步探討分析，而要闡明艾灸治療IBS-D的作用機(jī)制，仍有待于今后繼續(xù)深入觀察研究。