李東昇，程 楠，董健健，徐陳陳，耿 昊，高曼莉

(1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學神經(jīng)病學研究所附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061)

Wilson病(Wilson’s disease, WD)是一種由ATP7B基因突變導致的常染色體隱性遺傳銅代謝障礙性疾病，是神經(jīng)遺傳病領域重點防治的疾病[1]。前期臨床研究[2]發(fā)現(xiàn)，腦型WD患者(尤其是出現(xiàn)嚴重運動障礙和病程較長的難治性腦型WD患者)常規(guī)驅銅治療的療效差，病情康復緩慢，生活質量和學習、工作能力明顯下降，嚴重者甚至危及生命。因此，研究WD神經(jīng)細胞的損傷機制及治療策略對改善腦型WD患者的病情和預后有重要意義。

基于WD診療的臨床需求，安徽中醫(yī)藥大學神經(jīng)病學研究所根據(jù)腦型WD患者的中醫(yī)辨證研究結果，創(chuàng)用通腑養(yǎng)髓方治療腦型WD患者獲得顯著療效[3]。實驗研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，通腑養(yǎng)髓方可調控凋亡、自噬相關信號通路，起到改善突觸功能障礙，減輕神經(jīng)細胞損傷的治療效果。此外，已有研究資料證實，除了銅蓄積直接導致神經(jīng)細胞損傷外，ATP7B基因突變引起銅藍蛋白(ceruloplasmin, CP)合成障礙和亞鐵氧化酶活性減低致細胞內鐵穩(wěn)態(tài)失衡是難治性腦型WD神經(jīng)細胞損傷的重要機制，也是這些患者常規(guī)驅銅療效不佳的主要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一種鐵依賴性非程序性細胞死亡方式(鐵死亡)與多種神經(jīng)遺傳變性病的發(fā)病關系密切，且與腦型WD的神經(jīng)細胞損傷機制相契合[7]。近期研究[8]發(fā)現(xiàn)，抗核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2- related factor,Nrf2)信號通路是鐵死亡的一個重要調控通路，激活該通路能阻斷ferrostatin-1等鐵死亡誘導劑誘導的鐵死亡而具有細胞保護作用，是難治性腦型WD神經(jīng)細胞損傷的潛在治療靶點。基于此，本研究基于Nrf2信號通路觀察通腑養(yǎng)髓方對WD模型TX小鼠神經(jīng)細胞鐵死亡的干預效應，并探討通腑養(yǎng)髓方對WD神經(jīng)細胞損傷的保護機制。

1 材料

1.1 實驗動物 WD模型TX小鼠種鼠及其正常對照組DL小鼠，均從美國Jackson實驗室中心引進，于中國科學院合肥物質研究院SPF級實驗動物中心繁殖培育。對每只DL小鼠及TX小鼠均進行基因檢測，對DL純合及TX純合小鼠分別進行合籠繁殖處理。實驗動物使用許可證號：SYXK(皖)2018-005，實驗動物合格證號：3198342；本研究經(jīng)中國科學院合肥物質科學研究院動物倫理委員會批準(編號 IACUC19001)。

1.2 主要試劑和藥品 參照安徽中醫(yī)藥大學神經(jīng)病學研究所研制的通腑養(yǎng)髓方組方[9]，藥物組成及劑量：大黃、黃連、莪術、姜黃、芍藥各30 g，魚腥草45 g，澤瀉36 g，三七4.5 g，山茱萸40 g。加入蒸餾水 2 000 mL，浸泡 30 min，大火煮沸后加入大黃，再以文火煎30 min，過濾至燒杯中，藥渣再加入蒸餾水2 000 mL，重復煎煮過濾。將2次藥液合并，文火濃縮至1 500 mL(含生藥0.184 g/mL)，冷卻后倒入棕色瓶內，并于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆??？筎fR抗體(ab185550)、抗谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)抗體(ab125066)、Nrf2抗體(ab62352)、抗鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain,FTH1)抗體(ab183781)、抗血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO1)抗體(ab52947)、抗醌氧化還原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)抗體(ab80588)：英國Abcam公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器與設備 CK2型熒光倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司；XTZ-D型解剖顯微鏡：上海光學儀器一廠；BioTek Epoch2型全波長酶標儀：美國Biotek公司；NexION 350D型電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)儀：美國PerkinElmer公司；Fine DO X6 型全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；TGL-16型臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司。

2 方法

2.1 實驗分組 按照文獻[9]方法復制動物模型和給藥。以DL小鼠為正常對照組(n=30，9.0 g/L氯化鈉注射液)；將TX小鼠(n=60)隨機分為2組：模型組(n=30，9.0 g/L氯化鈉注射液)、通腑養(yǎng)髓方組(n=30，20 g/kg通腑養(yǎng)髓方溶液)。將各組小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，每日同一時間段給予藥物或9.0 g/L氯化鈉注射液灌胃，連續(xù)30 d，給藥結束后，使用1%戊巴比妥鈉麻醉后處死各組小鼠，完整分離小鼠腦組織。

2.2 ICP-MS法檢測各組小鼠腦內銅、鐵微量元素含量 樣品消化分解：根據(jù)實驗分組收集各組腦組織(n=6)，每管加入1 mL含95%的濃硝酸，100 ℃金屬浴60 min，直至管內組織完全消化分解，管內液體呈澄清透明即可，4 ℃放置待測。建立標準曲線：使用調諧液調整射頻功率、氣體流量、標準度、掃描時間和次數(shù)等儀器參數(shù)。稀釋標準曲線溶液，濃度由低到高，空白管為雙蒸水，每管復測3次，根據(jù)空白管和對照管數(shù)值，建立標準曲線。上機檢測：稀釋各組樣品，依次上機檢測(復測3次)，并做好分組標記，將所得數(shù)值代入建好的標準曲線，根據(jù)公式、樣品質量和樣品稀釋倍數(shù)計算出樣品中銅、鐵微量元素的含量。

2.3 免疫熒光技術檢測TX小鼠腦內TfR表達水平 使用冰凍切片機對小鼠腦組織進行切片，選擇最大橫截面，厚度為35 mm，然后將腦片放置于盛有PBS的24孔板中，4 ℃保存。取腦片放置于反應皿中，0.3% Triton X-100室溫反應15 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌，山羊血清原液37 ℃反應30 min，加入抗TfR抗體，4 ℃過夜，PBS洗滌，加入二抗反應30 min，PBS洗滌，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色細胞核，貼片，晾干，封片，曝光。熒光顯微鏡下TfR陽性呈現(xiàn)為紅色，采集圖像后經(jīng)Image J軟件進行定量分析。

2.4 TX小鼠腦組織中SOD活性、MDA含量測定 用硫代巴比妥酸法測定腦組織勻漿中MDA水平，可溶性噻唑鹽(WST-8)法測定腦組織勻漿中SOD活力。

2.5 透射電子顯微鏡下觀察線粒體結構 使用冰凍切片機對小鼠腦組織進行切片，加入1 mL電子顯微鏡固定液，室溫固定2 h，再轉移至4 ℃冰箱過夜。經(jīng)脫水、干燥、粘樣后通過透射電子顯微鏡觀察細胞內線粒體結構。

2.6 Fluoro-Jade B(FJB)染色觀察小鼠神經(jīng)細胞損傷程度 使用冰凍切片機對小鼠腦組織進行切片，經(jīng)過浸泡、反應、漂洗后均勻滴加0.000 4% FJB染液，處理后浸泡在熒光顯微鏡下。變性神經(jīng)細胞在鏡下會呈現(xiàn)綠色熒光，采集圖像后經(jīng)Image J軟件進行定量分析。

2.7 Western blot法檢測TX小鼠腦鐵死亡及Nrf2通路相關蛋白(GPX4、Nrf2、FTH1、HO-1、NQO1 )表達水平 各組取腦組織100 mg切碎，加入裂解液和蛋白酶抑制劑混合，用研磨機研磨至無絮狀沉淀，靜置30 min后離心，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度，加適量的蛋白上樣緩沖液，再通過電泳、轉膜、封閉、一抗過夜，二抗孵育2 h，顯影劑中浸泡，顯影后用Image J軟件采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值。

3 結果

3.1 通腑養(yǎng)髓方對TX小鼠腦內銅、鐵微量元素含量的影響 與正常對照組比較，模型組TX小鼠腦內銅、鐵含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，通腑養(yǎng)髓方組TX小鼠腦內鐵含量顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養(yǎng)髓方組；

3.2 3組小鼠TfR表達水平比較 與正常對照組比較，模型組小鼠TfR表達水平顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，通腑養(yǎng)髓方組TfR表達水平顯著減少(P<0.05)。見圖2。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養(yǎng)髓方組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 3組小鼠腦內SOD活性、MDA含量比較 與正常對照組比較，模型組小鼠腦內SOD活性顯著下降(P<0.05)，MDA含量顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，通腑養(yǎng)髓方組小鼠腦內SOD活性顯著上升(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。見圖3。

3.4 透射電子顯微鏡觀察各組小鼠腦組織細胞線粒體形態(tài) 正常對照組小鼠腦組織細胞線粒體結構正常；模型組小鼠腦組織細胞線粒體膜皺縮，嵴數(shù)量減少或消失，出現(xiàn)空泡；通腑養(yǎng)髓方組與模型組比較，線粒體膜平滑，嵴數(shù)量增加，損傷程度減輕。見圖4。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養(yǎng)髓方組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.5 3組小鼠腦皮質神經(jīng)細胞損傷程度比較 模型組小鼠腦皮質神經(jīng)細胞損傷程度較正常對照組顯著增加(P<0.05)；通腑養(yǎng)髓方組腦皮質神經(jīng)細胞損傷程度較模型組顯著減少(P<0.05)。見圖5。

3.6 3組小鼠腦內GPX4表達水平比較 與正常對照組比較，模型組GPX4蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，通腑養(yǎng)髓方組GPX4蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖6。

3.7 3組小鼠腦內Nrf2通路相關蛋白表達水平比較 與正常對照組比較，模型組Nrf2、FTH1、HO1、NQO1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，通腑養(yǎng)髓方組Nrf2、FTH1、HO1、NQO1蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。見圖7。

圖4 透射電子顯微鏡觀察各組小鼠腦組織細胞線粒體形態(tài)(3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，1×4 000倍，1×8 000倍)

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養(yǎng)髓方組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養(yǎng)髓方組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養(yǎng)髓方組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

鐵死亡是Dixon[7]在2012年發(fā)現(xiàn)的一種程序性細胞死亡方式，不依賴于經(jīng)典細胞凋亡通路的調控，不受凋亡、壞死和自噬的影響，其本質是鐵離子依賴的脂質過氧化產(chǎn)物超量蓄積引起氧化損傷，最終導致細胞死亡[10]。近期一項應用免疫熒光染色檢測神經(jīng)細胞鐵死亡的研究[11]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生鐵死亡的神經(jīng)細胞TfR表達水平增加、MDA水平升高，提示這兩個指標是反映神經(jīng)細胞鐵死亡的特異性指標。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)，GPX4失活可誘導細胞發(fā)生鐵死亡,是反映鐵死亡的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)，WD模型TX小鼠體內銅、鐵等微量元素高于正常對照組，證明其腦組織內不但存在銅的蓄積，還存在鐵的異常沉積。免疫熒光檢測結果顯示，TX小鼠腦組織的TfR含量明顯高于正常對照組，且TX小鼠腦組織的SOD活性顯著下降，MDA水平顯著升高，GPX4蛋白表達水平顯著降低。透射電子顯微鏡觀察結果顯示，TX小鼠腦組織線粒體出現(xiàn)線粒體膜皺縮、嵴數(shù)量減少或消失、空泡產(chǎn)生等典型的鐵死亡形態(tài)。因此，本研究首次發(fā)現(xiàn)WD模型TX小鼠腦內存在鐵死亡效應。

本課題組前期根據(jù)中醫(yī)“毒損絡脈”理論，將WD分為毒伏肝絡期、毒損肝絡期、肝絡瘀阻期、毒邪逆?zhèn)髌?個中醫(yī)病機分期，以及痰濕阻絡、肝膽濕熱、痰瘀互結、痰火擾心等12個證型[13]。針對四肢震顫、筋脈拘急、五心煩熱盜汗、腰膝酸軟、精神異常的部分腦型WD患者，本課題組從中醫(yī)經(jīng)典理論“久病致瘀”以及WD患者本身先天稟賦不足的證候特點出發(fā)，在肝豆湯的基礎上加用三七、山茱萸等活血養(yǎng)髓中藥組成“通腑養(yǎng)髓方”，以達到通腑養(yǎng)髓的目的。研究發(fā)現(xiàn)，以“通腑養(yǎng)髓”為治療目的的肝豆湯改良方可通過促進過量銅排出而抑制神經(jīng)細胞內CytC、Caspase-3和Caspase-9的表達，從而減輕銅過量對神經(jīng)細胞的損傷作用[14]。肝豆湯改良方通過上調XIAP蛋白及其mRNA的表達水平，下調Caspase-9、Caspase-3蛋白及其mRNA在腦組織中表達水平，減輕銅沉積對神經(jīng)細胞的氧化應激損傷，從而抑制神經(jīng)細胞的凋亡[4]。而通腑養(yǎng)髓方可通過調節(jié)自噬相關蛋白表達水平，調控LKB1-AMPK信號通路，抑制自噬的發(fā)生，從而阻斷高銅誘導的神經(jīng)細胞損傷，并有效發(fā)揮神經(jīng)保護作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，通腑養(yǎng)髓方可降低WD模型TX小鼠腦內鐵含量，提高SOD活性，降低MDA水平，減輕神經(jīng)細胞損傷，上調GPX4蛋白表達水平。結果表明，通腑養(yǎng)髓方可有效減輕體內銅、鐵沉積造成的神經(jīng)細胞損傷，降低體內氧化應激水平，具有保護作用。

Nrf2是抗氧化防御系統(tǒng)的重要轉錄因子，可以抵抗內部和外部的氧化以及化學刺激[16]。Shind等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2通路能改善氧化應激，在抑制鐵死亡過程中發(fā)揮重要作用，當受到ROS或親電試劑的刺激時，Nrf2會轉移入細胞核內，與靶基因促進區(qū)域的抗氧化反應元件(ARE)相互作用，啟動下游抗氧化蛋白基因FTH1、HO-1、NQO1等的轉錄，提高細胞抗氧化能力，維持細胞氧化平衡，從而影響鐵死亡[18-19]。本實驗結果表明，模型組TX小鼠腦內Nrf2通路相關蛋白Nrf2、FTH1、HO-1及NQO1蛋白表達水平較正常對照組顯著降低。通腑養(yǎng)髓方組Nrf2、FTH1、HO-1及NQO1蛋白表達水平較模型組顯著升高。結果提示通腑養(yǎng)髓方通過上調Nrf2信號通路相關蛋白表達水平，進一步抑制鐵死亡。

綜上所述，鐵死亡是WD模型TX小鼠神經(jīng)細胞損傷的重要機制，通腑養(yǎng)髓方可調控Nrf2信號通路，抑制WD模型TX小鼠神經(jīng)細胞鐵死亡，是難治性腦型WD神經(jīng)細胞損傷的潛在治療靶點。本研究對Nrf2信號通路相關因子表達水平的變化情況進行了初步探索，為通腑養(yǎng)髓方對Nrf2信號通路的具體調控機制和作用靶點等后續(xù)研究提供了理論基礎。