湯春花，梁鳳友，林碧珊，高永堅(jiān)，曾杉

（國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305）

經(jīng)典名方芍藥甘草湯出自東漢張仲景的《傷寒論·辨太陽(yáng)病脈證并治》第29條：“傷寒脈浮，自出汗，小便數(shù)，心煩，微惡寒，腳攣急……若厥愈足溫者，更作芍藥甘草湯與之，其腳即伸”。原處方為：白芍藥、甘草（炙，各四兩），上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服[1]。張仲景的芍藥甘草湯被歷代醫(yī)家推崇，其加減組方一直沿用至今[2]，是國(guó)家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中的經(jīng)典名方之一。主治津液受損、陰血不足、筋脈失濡所致諸證。方中芍藥酸寒，養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛；甘草甘溫，健脾益氣，緩急止痛。二藥相伍，酸甘化陰，調(diào)和肝脾，有柔筋止痛之效。根據(jù)文獻(xiàn)論著可知[3-8]，芍藥甘草湯基準(zhǔn)樣品的現(xiàn)代制備工藝為：取白芍、炒甘草飲片各12 g，加水600 mL，武火煮沸轉(zhuǎn)文火煎煮至煎液約300 mL，過(guò)濾，即得。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9]，芍藥甘草湯含量測(cè)定指標(biāo)主要是芍藥苷、甘草苷、甘草酸等成分，且均已被證實(shí)為該方的藥效成分。本研究在前人考證的基礎(chǔ)上，通過(guò)試驗(yàn)考察確定浸泡時(shí)間、煎煮容器材質(zhì)、煎煮時(shí)間、過(guò)濾方式對(duì)芍藥甘草湯基準(zhǔn)樣品制備工藝的影響，以出膏率、浸出物和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳制備工藝并進(jìn)行了工藝驗(yàn)證，為芍藥甘草湯進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為復(fù)方顆粒提供依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

H-class UPLC色譜儀（PDA二極管陣列檢測(cè)器，Waters公司）；500瓦陶瓷鍋（深圳市一枚王電子商務(wù)有限公司）；不銹鋼鍋；SY-901多功能電磁爐（中山市南菱電子科技有限公司）；HH-4型水浴鍋（常州奧華儀器有限公司）；HN101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠）；AL104型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KQ5200DA型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ST 16型高速離心機(jī)（Thermo）。

1.2 試藥

芍藥苷（批號(hào)：110736-201741）、甘草苷（批號(hào)：111610-201607）、甘草酸銨（110731-201720）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙腈為HPLC級(jí)，實(shí)驗(yàn)用其他試劑均為AR級(jí)。

1.3 藥材

生白芍（安徽亳州，批號(hào)：H-BS01Y）、甘草（甘肅酒泉，批號(hào)：H-ZGC01Y），由廣東一方制藥有限公司鑒定分別為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖，按2020年版《中國(guó)藥典》[10]檢驗(yàn)均合格。白芍飲片、炒甘草飲片分別按2020年版《中國(guó)藥典》[10]和2008年版《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》[11]炮制而得。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品的制備方法

取白芍、炒甘草飲片各12 g，加水600 mL，武火煮沸轉(zhuǎn)文火煎煮至煎液約300 mL，過(guò)濾，即得。

2.2 出膏率測(cè)定

取芍藥甘草湯煎液10 g，精密稱(chēng)定，水浴蒸干后，105℃烘箱干燥3 h，置干燥器中放冷，精密稱(chēng)重，測(cè)得干固物質(zhì)量，計(jì)算固含率（%）和出膏率（%），公式如下：

2.3 浸出物含量測(cè)定

取芍藥甘草湯煎液50 g，精密稱(chēng)定，置分液漏斗中，加水飽和正丁醇萃取3次，每次50 mL，合并正丁醇層，置已稱(chēng)重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干溶劑，并在105℃烘箱中烘干3 h，取出放置于干燥器中放冷，精密稱(chēng)定，計(jì)算浸出物含量，公式如下：

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18柱（1.7 μm，2.1×100 mm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～7 min，5%→15%A；7～15 min，15%→50%A；15～18 min，50%→100%A）；流速為0.25 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備

取芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL各含芍藥苷80 μg、甘草苷20 μg、甘草酸銨200 μg的混合溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液制備

取相當(dāng)于0.12 g干固物的芍藥甘草湯煎液，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.4.4.1 專(zhuān)屬性考察精密吸取供試品溶液（批號(hào)：SG200531）、混合對(duì)照品溶液與白芍、甘草陰性樣品溶液各1 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，陰性樣品溶液在供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上無(wú)對(duì)應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明該方法專(zhuān)屬性較好。

圖1 專(zhuān)屬性考察Figure 1 Exclusivity investigation

2.4.4.2 線性考察分別精密稱(chēng)定芍藥苷對(duì)照品21.08 mg（純度96.8%）、甘草苷對(duì)照品10.19 mg（純度95.0%）、甘草酸銨對(duì)照品20.87 mg（純度96.2%），置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1 mL含芍藥苷408.11 μg、甘草苷193.61 μg、甘草酸銨401.54 μg的對(duì)照品溶液。

分別精密量取芍藥苷、甘草苷和甘草酸銨對(duì)照溶液適量，逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為50%、25%、12.5.%、6.25%、3.125%的溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)中色譜條件測(cè)定，記錄不同質(zhì)量濃度（x）對(duì)照品的色譜峰面積（y），擬合得到線性回歸方程為：芍藥苷y=2 731.5x-5 538.7（r=0.999 6）、甘草苷y=4 777x-1 205.5（r=0.999 9）、甘草酸銨y=787x-487.3（r=0.999 9），結(jié)果表明芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨分別在12.75～408.11、6.05～193.61、12.55～401.54 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4.3 精密度試驗(yàn)精密吸取供試品溶液（批號(hào)：SG200531），按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定芍藥苷、甘草苷、甘草酸的峰面積和含量，計(jì)算芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍分別是4.81%～4.85%、1.39%～1.41%、1.75%～1.78%，RSD分別為0.46%、0.54%和0.77%，表明精密度良好。

2.4.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液（批號(hào)：SG200531），按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，測(cè)定芍藥苷、甘草苷、甘草酸的峰面積和含量，計(jì)算芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍分別為4.82%～4.84%、1.39%～1.42%、1.72%～1.76%，RSD分別為0.27%、0.78%和0.85%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)分別取相當(dāng)于0.06、0.12、0.18 g干固物的芍藥甘草湯煎液（批號(hào)：SG200531），精密稱(chēng)定，制備3種不同濃度的供試品溶液，每種濃度平行3份。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，計(jì)算芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍分別是4.78%～4.91%、1.38%～1.43%、1.72%～1.78%，RSD分別為0.76%、1.01%和1.03%，表明該分析方法的重復(fù)性良好。

2.4.4.6 中間精密度考察由本項(xiàng)目組其他分析人員在不同日期和不同色譜儀下操作。分別取相當(dāng)于0.06、0.12、0.18 g干固物的芍藥甘草湯煎液（批號(hào)：SG200531），精密稱(chēng)定，制備3種不同濃度水平的供試品溶液，每種濃度平行3份。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，計(jì)算芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍RSD分別為0.76%、0.66%、0.90%，表明中間精密度良好。

2.4.4.7 加樣回收試驗(yàn)分別取相當(dāng)于0.03、0.06、0.09 g干固物的芍藥甘草湯煎液（批號(hào)：SG200531），精密稱(chēng)定，分別加入50%、100%和150%濃度的芍藥苷、甘草苷、甘草酸對(duì)照溶液，制備成供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算芍藥苷、甘草苷、甘草酸回收率（n=9）分別為97.76%、98.57%、98.63%，RSD分別為1.22%、0.86%、2.23%，均滿足2020年版《中國(guó)藥典》[10]要求。

2.4.4.8 耐用性考察

①不同色譜柱考察

精密吸取供試品溶液（批號(hào)：SG200531），按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別考察了5種不同類(lèi)型的色譜柱Agilent SB C18柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）、Waters BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent Bonus RP C18柱（1.7μm，2.1 mm×100 mm）、Waters CSH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、YMC Triart C18柱（1.9 μm，2.1 mm×100 mm）對(duì)芍藥苷、甘草苷、甘草酸色譜峰的分離情況，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，Waters BEH C18色譜柱分離效果最佳，故選擇Waters BEH C18色譜柱進(jìn)行研究。

圖2 不同色譜柱的考察Figure 2 Investigation of different chromatographic columns

②不同柱溫考察

精密吸取供試品溶液（批號(hào)：SG200531），按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在不同柱溫（25、30、35℃）平行進(jìn)樣2次，考察對(duì)芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量測(cè)定的影響。實(shí)驗(yàn)顯示，25、30、35℃柱溫下，芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍分別是4.82%～4.85%、1.39%～1.42%、1.71%～1.75%，RSD值分別為0.31%、0.86%、0.94%，表明不同柱溫對(duì)指標(biāo)含量的影響較小，本實(shí)驗(yàn)選擇柱溫30℃。

③不同流速考察

精密吸取供試品溶液（批號(hào)：SG200531），按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在不同流速（0.20、0.25、0.30 mL/min）平行進(jìn)樣2次，考察對(duì)芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量測(cè)定的影響。結(jié)果顯示三種流速下芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍分別是4.84%～4.85%、1.37%～1.40%、1.72%～1.76%，RSD分別為0.17%、0.76%、0.81%，表明流速對(duì)含量測(cè)定影響較小，本實(shí)驗(yàn)選擇流速0.25 mL/min。

3 基準(zhǔn)樣品制備工藝研究

3.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)（得液量的考察）

取同一批白芍、炒甘草飲片各12 g，分成兩組，每組平行6份，置陶瓷鍋中，加水600 mL，浸泡30 min，武火煮沸后，第一組選用功率200 W分別煎煮20、40、60 min，第二組選用功率300 W分別煎煮20、40和60 min，趁熱過(guò)濾考察得液量，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明功率200 W煎煮60 min和300 W煎煮40 min，得液量在300 mL±10%之間，符合試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。

表1 得液量考察Table 1 Investigation of decoction volume

3.2 浸泡時(shí)間的考察

取同一批白芍、炒甘草飲片各12 g，平行6份，分別浸泡30 min和60 min，同法煎煮、過(guò)濾。按照“2.2”“2.3”“2.4”項(xiàng)下的方法測(cè)定出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明不同浸泡時(shí)間對(duì)出膏率、浸出物和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量均無(wú)明顯影響。為提高效率，選擇浸泡30 min。

表2 浸泡時(shí)間考察Table 2 Investigation of soaking time w/%

3.3 煎煮器具的考察

取同一批白芍、炒甘草飲片各12 g，平行6份，分別置陶瓷鍋和不銹鋼鍋，同法煎煮，所得煎液約300 mL，趁熱過(guò)濾。按照“2.2”“2.3”“2.4”項(xiàng)下的方法測(cè)定出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示陶瓷鍋基準(zhǔn)樣品出膏率和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量?jī)?yōu)于不銹鋼鍋，故采用陶瓷鍋?zhàn)鳛榧逯笕萜鳌?/p>

表3 煎煮器具的考察Table 3 Investigation of decoction utensils w/%

3.4 煎煮時(shí)間的考察

取同一批白芍、炒甘草各12 g，平行6份，置陶瓷鍋中，加水600 mL，浸泡30 min，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮，其中三份功率300 W煎煮40 min，另三份功率200 W煎煮60 min，趁熱過(guò)濾。按照“2.2”“2.3”“2.4”項(xiàng)下的方法測(cè)定出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示不同煎煮時(shí)間的出膏率、浸出物和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量均無(wú)明顯差異。為提高煎煮效率，選擇煎煮時(shí)間40 min。

表4 煎煮時(shí)間的考察Table 4 Investigation of decoction time w/%

3.5 過(guò)濾方式的考察

取同一批白芍、炒甘草飲片各24 g，置陶瓷鍋中，加水1 200 mL，浸泡30 min，武火煮沸轉(zhuǎn)文火煎煮40 min，所得煎液約600 mL，分成平行5份，分別采用不同的過(guò)濾方式：①趁熱用紗布過(guò)濾；②趁熱過(guò)200目篩網(wǎng)；③趁熱過(guò)350目篩網(wǎng)；④趁熱過(guò)680目篩網(wǎng)；⑤離心，取上清液。分別按照“2.2”“2.3”“2.4”項(xiàng)下的方法測(cè)定出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明五種過(guò)濾方式的出膏率、浸出物和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量均無(wú)顯著差異，而紗布和200目網(wǎng)篩過(guò)濾濾液渾濁，350目篩網(wǎng)易過(guò)濾且濾液澄清，故采用350目網(wǎng)篩。

表5 過(guò)濾方式的考察Table 5 Investigation of filter method w/%

4 工藝驗(yàn)證

綜上所述，芍藥甘草湯基準(zhǔn)樣品的制備工藝為：取白芍、炒甘草飲片各12 g，置陶瓷鍋中，加水600 mL，浸泡30 min，武火煮沸轉(zhuǎn)文火煎煮40 min，所得煎液約300 mL，趁熱過(guò)350目篩網(wǎng)，即得。

按上述方法，平行制備6批標(biāo)準(zhǔn)煎液，按照“2.2”“2.3”“2.4”項(xiàng)下的方法測(cè)定其出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，結(jié)果如表6所示，說(shuō)明所建立的芍藥甘草湯基準(zhǔn)樣品制備工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性好。

表6 工藝驗(yàn)證結(jié)果Table 6 Results of process validation w/%

5 討論

經(jīng)典名方是至今仍廣泛應(yīng)用、療效確切、具有明顯特色與優(yōu)勢(shì)的古代中醫(yī)典籍所記載的方劑。2018年5月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡(jiǎn)化注冊(cè)審批管理規(guī)定》明確指出經(jīng)典名方復(fù)方制劑開(kāi)發(fā)必須首先進(jìn)行物質(zhì)基準(zhǔn)（基準(zhǔn)樣品）研究，為其后的制劑開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。在兩千多年的歷史發(fā)展過(guò)程中，經(jīng)典名方的藥物基原、炮制、劑量、煎煮法、功能主治等歷經(jīng)變化，莫衷一是，因此關(guān)鍵信息考證是經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)利用的關(guān)鍵性、源頭性問(wèn)題?！秱摗穂1]記載的芍藥甘草湯“白芍藥甘草（炙，各四兩），上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服”，據(jù)文獻(xiàn)考證[8]，原方芍藥基原為芍藥科多年生草本植物芍藥Peaonia lactifloraPall.的根；甘草基原為烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.。而對(duì)于原文所述“炙甘草”經(jīng)過(guò)考證應(yīng)該是炒甘草，同時(shí)原文所述“白芍藥”即生用白芍藥。計(jì)量方面，原方的一兩合今3 g、一升合今200 mL[3-4]。

在“遵古”的基礎(chǔ)上充分考慮當(dāng)前臨床和生產(chǎn)實(shí)際是經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)的主要原則[8]，本文在前人考證的基礎(chǔ)之上，通過(guò)試驗(yàn)考察浸泡時(shí)間、煎煮容器材質(zhì)、煎煮時(shí)間、過(guò)濾方式對(duì)出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量的影響，從而確定基準(zhǔn)樣品最佳現(xiàn)代制備工藝。

根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[12]要求，煎煮前飲片的浸泡時(shí)間應(yīng)不少于30 min。本文考察了浸泡30 min和浸泡60 min對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示兩者差異不大，為提高效率選擇浸泡30 min。傳統(tǒng)的煎藥器皿主要以砂鍋、陶瓷鍋為主，現(xiàn)代煎藥多采用金屬不銹鋼容器進(jìn)行煎煮，研究顯示陶瓷鍋煎煮在指標(biāo)性成分濃度及出膏率上優(yōu)于砂鍋[13]，因此本文考察了陶瓷鍋和不銹鋼鍋對(duì)芍藥甘草湯煎煮的影響，結(jié)果顯示陶瓷鍋制得的基準(zhǔn)樣品出膏率和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量均高于不銹鋼鍋，故采用陶瓷鍋?zhàn)鳛榧逯笕萜鳌Ｓ捎诠偶涊d古代煎藥多“常令文火小沸”[14]，故考察了文火煎煮40 min和煎煮60 min對(duì)煎液的影響，結(jié)果無(wú)明顯差異，為提高效率選擇煎煮時(shí)間40 min。文中還考察了5種不同過(guò)濾方式對(duì)煎液的影響，結(jié)果提示彼此無(wú)明顯差異，最終采用趁熱過(guò)350目篩網(wǎng)。還通過(guò)工藝驗(yàn)證證明了制備工藝的穩(wěn)定可行，為芍藥甘草湯進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為復(fù)方顆粒提供了科學(xué)依據(jù)。