李 勇，陳海江，許 粟，吳文能

(貴陽(yáng)學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550005)

近年來(lái)，貴州省獼猴桃產(chǎn)業(yè)規(guī)模進(jìn)入全國(guó)前三，隨著種植面積增加，由病原微生物引起的獼猴桃病害日益突出，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。由細(xì)菌引起的獼猴桃病害有細(xì)菌性潰瘍病、花腐病，由真菌引起的有黑斑病、褐斑病、葉斑病、炭疽病、根腐病等。這些致病菌可危害獼猴桃的果實(shí)、葉片、根等部位。目前關(guān)于獼猴桃微生物的病害集中于病原菌的分離純化，輔以侵染試驗(yàn)等，缺乏微生物群落對(duì)比及感染途徑分析。對(duì)致病微生物是何時(shí)，通過(guò)何途徑侵染到植株的研究仍然較為欠缺。目前針對(duì)微生物群落的調(diào)查有多種方法，如傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合微生物形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定，或結(jié)合PCR手段如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)等。以及一些非培養(yǎng)方法，如變性梯度凝膠電泳(DGGE)、實(shí)時(shí)熒光PCR、熒光原位雜交(FISH)等。這些技術(shù)均存在耗時(shí)、費(fèi)力、結(jié)果可靠性差等缺陷。本研究利用的Illumina NovaSeq 測(cè)序平臺(tái)，具有測(cè)序通量高、周期短、準(zhǔn)確率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在微生物多樣性研究中有顯著優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)Illumina NovaSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)獼猴桃花、健康幼果和患病幼果的微生物進(jìn)行測(cè)序，比較樣品中群落結(jié)構(gòu)差異，分析微生物群落結(jié)構(gòu)變化，為揭示患腐爛病獼猴桃的病原菌種類及感染途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和命名

本研究獼猴桃品種為貴長(zhǎng)，屬貴州省自主選育并主要推廣品種。采樣地點(diǎn)為貴州省修文縣，采集獼猴桃健康無(wú)病害的花朵、健康幼果及患病幼果，患病幼果癥狀為在果柄處開(kāi)始出現(xiàn)腐爛跡象，并逐漸蔓延。采集后的樣品裝入樣品袋，低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，并在12 h內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行處理，無(wú)病害的獼猴桃花命名為MHTH，健康幼果命名為MHTG-1，患病幼果命名為MHTG-2。

1.2 基因組 DNA 提取及多樣性分析

分別提取各組樣品的基因組DNA，對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)DNA的純度和濃度。取適量樣本DNA稀釋濃度至1 ng/μL，根據(jù)所選擇的測(cè)序區(qū)域，分別以其為模板，使用帶有Barcode的特異性引物，以及PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs公司)對(duì)細(xì)菌的16S rDNA V3-V4區(qū)及真菌的ITS1區(qū)進(jìn)行PCR。檢測(cè)PCR產(chǎn)物濃度，并根據(jù)濃度進(jìn)行等量混樣，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用膠回收試劑盒(QIAGEN公司)回收產(chǎn)物。最后利用TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，質(zhì)量檢測(cè)合格后使用NovaSeq6000平臺(tái)進(jìn)行樣品的測(cè)序工作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)高通量初始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用FLASH(V1.2.7)對(duì)每個(gè)樣本的reads進(jìn)行拼接，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格過(guò)濾處理得到高質(zhì)量Tags數(shù)據(jù)。然后用Usearch軟件對(duì)所有樣品有效序列以97%一致性將序列聚類成為OTU；用Mothur和SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析，對(duì)獲得分類學(xué)信息分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)樣本群落組成。使用Qiime軟件計(jì)算Shannon、Simpson、Chao1、Goods-coverage指數(shù)，使用R軟件繪制圖像和Alpha和Beta多樣性指數(shù)差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列長(zhǎng)度分布

對(duì)各樣品中細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，共獲得266 533條平均長(zhǎng)度為411 bp的高質(zhì)量序列(圖1)，基本符合16S rRNA基因的V3-V4區(qū)序列長(zhǎng)度(460 bp)。對(duì)樣品中真菌18S rDNA的ITS1區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，共獲得260 919條平均長(zhǎng)度為274 bp的高質(zhì)量序列(圖1)，與ITS1區(qū)域長(zhǎng)度(260 bp)基本一致。

2.2 樣品復(fù)雜度分析

樣品中分別針對(duì)細(xì)菌和真菌測(cè)序結(jié)果的稀釋度曲線如圖2所示，從圖2可以看出，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率均逐漸降低，趨于平坦。根據(jù)曲線最終趨勢(shì)可以看出，對(duì)樣品中真菌測(cè)序深度較高，增加測(cè)序數(shù)量也只會(huì)產(chǎn)生少量新OTU。而對(duì)細(xì)菌繼續(xù)增加測(cè)序數(shù)量，可能還會(huì)產(chǎn)生新OTU。由表1也可得出同樣結(jié)論，測(cè)序深度指數(shù)中Good′s coverage代表了各樣品文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高，樣品中未被測(cè)出序列概率越低，真菌測(cè)序的Good′s coverage均為1，3個(gè)樣品中細(xì)菌此數(shù)值分別為0.996、0.996、0.995。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)(本文分析使用Simpson′s Index of Diversity，即1-D)均是用來(lái)估算樣品中微生物多樣性的指數(shù)，此二者數(shù)值越高，說(shuō)明樣品中微生物群落的多樣性越高，樣品MHTG-2的細(xì)菌和真菌多樣性均高于其他兩個(gè)樣品，在真菌中更加明顯。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均是用來(lái)估算樣品中含有的OTU數(shù)目，表示群落豐富度，二者算法不同，Chao1和ACE指數(shù)越大，說(shuō)明群落中含有的OTU數(shù)目越多，樣品中物種豐富度越大，對(duì)比發(fā)現(xiàn)MHTG-2的細(xì)菌和真菌多樣性均高于其他兩個(gè)樣品。

注：a為細(xì)菌；b為真菌。圖1 序列長(zhǎng)度分布Fig.1 Distribution of sequence length

注：a為細(xì)菌；b為真菌。圖2 稀釋度曲線Fig.2 Rarefaction curve

表1 樣品中微生物多樣性指數(shù)Tab.1 Microbial diversity index

2.3 OTU聚類分析及維恩圖分析

對(duì)宏基因組測(cè)序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有樣品共獲得細(xì)菌Tags(過(guò)濾后得到的拼接序列數(shù))173 338條，包括164 970條可獲得分類信息的Tags，7882條低頻Tags。共獲得真菌Tags 191 499條，包括187 177條可獲得分類信息的Tags，3354條低頻Tags。對(duì)拼接的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，在97%相似度下將其進(jìn)行聚類為用于物種分析的OTU，MHTH、MHTG-1、MHTG-2樣品獲得的細(xì)菌OTU個(gè)數(shù)為805、746和895(圖3)，獲得的真菌樣本分別是99、43和168(圖4)。比較3個(gè)樣品中檢測(cè)到的Tags數(shù)目以及OTU數(shù)目，健康的獼猴桃幼果MHTG-1稍低，但無(wú)顯著性差異。

圖3 樣品中的細(xì)菌Tags和OTUs數(shù)目統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistics of the bacterial numbers of tags and OTUs in samples

圖4 樣品中的真菌Tags和OTUs數(shù)目統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistics of the fungal numbers of tags and OTUs in samples

3組樣品的細(xì)菌、真菌韋恩圖如圖5所示，MHTF、MHTG-1、MHTG-2分別獨(dú)有212、140、238個(gè)細(xì)菌OTU，以及40、7、83個(gè)真菌OTU。3組樣品分別共有374和26個(gè)細(xì)菌和真菌OTU，樣品MHTG-2中無(wú)論是細(xì)菌還是真菌類群獨(dú)有OTU都是最多的。

樣品中的測(cè)序數(shù)據(jù)可以注釋到細(xì)菌門(mén)平均28個(gè)，細(xì)菌屬平均212個(gè)，以及真菌門(mén)平均3個(gè)，真菌屬平均53個(gè)(表2)。3個(gè)樣品中細(xì)菌類群較為接近，樣品MHTG-2中真菌在綱、目、科、屬水平上均為最高。

表2 細(xì)菌、真菌分類數(shù)目Tab.2 Number of bacteria and fungi classification level

2.4 細(xì)菌物種多樣性分析

圖6列出了細(xì)菌門(mén)和屬分類水平上物種豐度排名前十的分布狀況，結(jié)果表明，3個(gè)樣品中細(xì)菌的主要門(mén)類為變形菌門(mén)Proteobacteria、擬桿菌門(mén)Bacteroidota、放線菌門(mén)Actinobacteria、unidentified Bacteria和厚壁菌門(mén)Firmicutes，其余門(mén)類的相對(duì)豐度均小于1%，優(yōu)勢(shì)菌均為變形菌門(mén)Proteobacteria(74.98%以上)。在屬分類水平上，各組的優(yōu)勢(shì)屬類為寡養(yǎng)單胞菌屬(8.14%～44.48%)、假單胞菌屬(12.86%～16.85%)、---屬(3.96%～12.79%)、泛菌屬(3.55%～9.06%)，此四者均為變形菌門(mén)Proteobacteria。

圖6 細(xì)菌門(mén)和屬分類水平相對(duì)豐度排名前十的物種分布Fig.6 Abundance (top 10) of bacteria in samples at phylum and genera level

根據(jù)獼猴桃生長(zhǎng)階段和患病狀況不同進(jìn)行對(duì)比分析，在門(mén)分類水平上MHTH及MHTG-1群落結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門(mén)Proteobacteria，相對(duì)豐度分別為88.43%和94.79%，患病獼猴桃MHTG-2除變形菌門(mén)Proteobacteria外，擬桿菌門(mén)Bacteroidota、放線菌門(mén)Actinobacteria相對(duì)豐度也較高，均為10%左右。在屬分類水平上，除假單胞菌屬相對(duì)豐度均較高外，其他屬微生物相對(duì)豐度變化較大。樣品MHTH中占比最高的為，相對(duì)豐度為22.33%，樣品MHTG-1和MHTG-2中占比最高的均為寡養(yǎng)單胞菌屬，相對(duì)豐度分別為44.48%和19.34%。

注：a為細(xì)菌;b為真菌。圖5 細(xì)菌和真菌韋恩圖Fig.5 Venn graphs of bacteria and fungi

2.5 真菌物種多樣性分析

圖7列出了真菌門(mén)和屬分類水平上物種豐度排名前十的分布情況，由圖可知，3個(gè)樣品中真菌的主要門(mén)類為子囊菌門(mén)Ascomycota(95.90%～99.20%)，相對(duì)豐度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在MHTG-2中擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota含量也較高，相對(duì)豐度為3.22%。其余門(mén)類的相對(duì)豐度均小于1%。

圖7 真菌門(mén)和屬分類水平相對(duì)豐度排名前十的物種分布Fig.7 Abundance (top 10) of fungi in samples at phylum and genera level

在屬分類水平上，樣品MHTH和MHTG-1中微孢子屬為優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度分別為98.24%和96.37%，其余屬相對(duì)豐度均小于1%。樣品MHTG-2中相對(duì)豐度較高的有微孢子屬、枝孢菌屬、小雙腔菌屬、不整小球囊菌屬、鐮孢菌屬、格孢菌屬、附球菌屬、unidentified、維希尼克氏屬、，相對(duì)豐度分別為39.28%、18.47%、15.06%、8.68%、3.22%、3.18%、1.67%、1.65%、1.39%、1.11%。

3 結(jié)論與討論

本研究利用高通量測(cè)序的方法對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同健康狀況樣品中微生物群落進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)3個(gè)樣品中細(xì)菌類群微生物群落結(jié)構(gòu)相差較小，豐度較高的屬均為寡養(yǎng)單胞菌屬和假單胞菌屬。寡養(yǎng)單胞菌屬是一類革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界，該屬未發(fā)現(xiàn)有植物致病菌存在。假單胞菌屬已知有191個(gè)種，多為植物致病菌，如淺綠黃假單胞菌、沙氏極毛桿菌、螢光假單胞菌、丁香假單胞菌的致病變株丁香致病變種pv.及丁香假單胞菌獼猴桃致病變種pv.均為獼猴桃致病菌，但這幾種微生物均未在本次測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)。

真菌群落的研究中，樣品MHTH和MHTG-1在屬分類水平上群落結(jié)構(gòu)相似，與患病樣品MHTG-2群落結(jié)構(gòu)相差較大。前二者微孢子屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，該屬研究較少，有些種可引起植物干粉病，但未見(jiàn)到有關(guān)獼猴桃致病菌的報(bào)道。MHTG-2除微孢子屬外，枝孢菌屬、小雙腔菌屬、不整小球囊菌屬、鐮孢菌屬、格孢菌屬、附球菌屬、unidentified、維希尼克氏屬、相對(duì)豐度也較高，可見(jiàn)患病獼猴桃中真菌群落結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，并可初步得出，患病獼猴桃屬于真菌性致病菌感染。

可導(dǎo)致獼猴桃患病的真菌性致病菌種類較多，如屬就有尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌和三線鐮刀菌，三者均可導(dǎo)致獼猴桃軟腐病；亞隔孢殼屬屬可導(dǎo)致獼猴桃患黑斑病。本研究發(fā)現(xiàn)，在樣品MHTG-2中發(fā)現(xiàn)互隔鏈格孢菌和莖點(diǎn)霉菌sp.相對(duì)豐度較高，分別為3.18%和1.03%，這兩種微生物并未在樣品MHTH和MHTG-1中發(fā)現(xiàn)?；ジ翩湼矜呔且环N常見(jiàn)的獼猴桃致病菌，可導(dǎo)致獼猴桃患黑斑病和貯藏期軟腐病，莖點(diǎn)霉菌sp.同樣可導(dǎo)致獼猴桃軟腐病。

獼猴桃軟腐病常見(jiàn)于貯藏期，通常果實(shí)外表無(wú)明顯癥狀，但隨著儲(chǔ)存時(shí)間增長(zhǎng)，獼猴桃內(nèi)部開(kāi)始腐爛。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，雖然獼猴桃花和健康的幼果中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)致病菌，但幼果可被感染并且發(fā)病，推斷果園環(huán)境中存在相關(guān)致病微生物，可感染幼果或成熟果，待條件合適時(shí)大肆繁殖，導(dǎo)致發(fā)病，發(fā)病時(shí)期可在生長(zhǎng)期，或在貯藏期。下一步可對(duì)獼猴桃環(huán)境中的樣品采樣并進(jìn)行高通量分析，以對(duì)本研究推測(cè)進(jìn)行確認(rèn)。同時(shí)指導(dǎo)種植戶在獼猴桃種植園區(qū)噴施真菌殺菌劑，防范獼猴桃在生長(zhǎng)、采摘、運(yùn)輸過(guò)程中的感染。

病原菌的入侵使微生物的多樣性和豐富度均增加，在真菌群落結(jié)構(gòu)中尤其明顯。樣品中未發(fā)現(xiàn)致病細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)多種致病真菌，推斷由果園環(huán)境感染。高通量測(cè)序獲得大量微生物群落結(jié)構(gòu)信息，為系統(tǒng)分析病原菌的入侵和潛在病害研究提供可靠依據(jù)。