黃雅蘭，張艷玲，吳勇軍，劉 秀，向 琴，喻 嶸＊＊

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 長(zhǎng)沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技處 長(zhǎng)沙 410208）

1 引言

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一組以高血糖為特征，出現(xiàn)多尿、多食、多飲、疲乏無力等癥狀的慢性疾病，其主要分為兩型，尤以2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM），又稱非胰島素依賴型糖尿病最多見，T2DM主要由遺傳因素、不良的生活方式、免疫功能紊亂等致病因子作用于機(jī)體，導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗[1-3]。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF，http://diabetesatlas.org/en/）于2019年發(fā)布數(shù)據(jù)顯示，全球DM患者大約有4.63億，中低等收入國(guó)家占到79%，我國(guó)DM患病人數(shù)在全世界排名第一，高達(dá)1.16億，預(yù)計(jì)到2045年中國(guó)DM人數(shù)將達(dá)到1.47億[4]。血糖長(zhǎng)期處于異常水平可并發(fā)糖尿病腎病、糖尿病心肌病等，其致死致殘率極高，給人類的健康甚至生命造成嚴(yán)重威脅，已經(jīng)成為我國(guó)最為重要和棘手的公共衛(wèi)生問題之一[5]。

目前T2DM的治療以西藥為主，西藥類降糖藥多為促胰島素分泌劑、二肽基肽酶-4抑制劑、雙胍類、胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑、α-糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類藥物、胰島素及其類似物等[6]。雖然西藥類降糖藥在改善血糖相關(guān)指標(biāo)上表現(xiàn)出相對(duì)優(yōu)勢(shì)，但其作用途徑單一，對(duì)并發(fā)癥的作用有限，且不良反應(yīng)明顯，以反應(yīng)性低血糖多見，也容易對(duì)心、肝、胃、腎等造成損傷[7]。因此亟待尋求有效控制T2DM的治療方案。中醫(yī)藥在改善T2DM胰島素抵抗方面，具有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不可替代的優(yōu)勢(shì)。許多中藥及中藥提取物，能保護(hù)β細(xì)胞、促進(jìn)胰島素分泌、提高胰島素的敏感性以及促進(jìn)葡萄糖降解等作用，從而達(dá)到改善胰島素抵抗的效果[8]。此外還能夠通過調(diào)節(jié)腸道微生物群結(jié)構(gòu)和改善免疫系統(tǒng)功能等途徑，糾正糖脂代謝紊亂[9]。中藥復(fù)方注重整體治療，具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，在治療T2DM及其并發(fā)癥具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能夠從多方面改善機(jī)體代謝水平，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，達(dá)到緩解DM及控制并發(fā)癥的最終目的，越來越受到人們關(guān)注，為T2DM的防治提供全新的思路[10]。

T2DM屬傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“消渴”癥范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為五臟虛弱、過食肥甘是消渴的病因，而內(nèi)熱是消渴的主要病機(jī)。《素問·奇病論》說：“此肥美之所發(fā)也，此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也”，食甘則中氣緩而善留，食肥則陽氣滯而不達(dá)，日久脾胃受損致“中滿”“內(nèi)熱”，陽明胃熱上蒸于肺，肺失敷布，故形成消渴肺胃熱盛傷津之候。白虎加人參湯由醫(yī)圣張仲景創(chuàng)立，此方用白虎湯清熱生津，又因熱盛耗氣傷陰，加人參以增強(qiáng)益氣生津之力，此為陽明熱盛、氣陰兩傷證治而設(shè)，在臨床備受推崇。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)的T2DM MKR小鼠存在炎癥通路的激活，白虎加人參湯對(duì)小鼠的血糖及炎癥具有調(diào)節(jié)作用，然而其作用機(jī)理目前尚不明確[11]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是藥物系統(tǒng)性研究的新興學(xué)科，其能夠從成分-靶點(diǎn)-通路-疾病的角度系統(tǒng)闡明藥物發(fā)揮臨床療效的作用機(jī)制，因其具有整體性等特點(diǎn)，與中醫(yī)藥的整體觀等基本理論趨于一致，近年來有關(guān)中藥復(fù)方治療T2DM的有效成分及作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究也常見報(bào)道[12-15]。因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討白虎加人參湯治療T2DM的分子靶點(diǎn)及作用機(jī)制，為深入研究白虎加人參湯治療T2DM奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

2 研究思路與方法

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討白虎加人參湯治療T2DM的分子靶點(diǎn)及作用機(jī)制。首先應(yīng)用TCMSP、TCMID和PubChem數(shù)據(jù)庫獲取白虎加人參湯的化學(xué)活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)信息，在GEO數(shù)據(jù)庫獲得影響T2DM的差異基因，并與白虎人參湯靶點(diǎn)交集獲取共同靶點(diǎn)。運(yùn)用STRING V11.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互作分析并獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)。通過DAVID 6.8分析平臺(tái)，獲得GO功能注釋結(jié)果及KEGG通路富集結(jié)果，分析通路相關(guān)基因及功能，并通過實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證，研究流程圖見圖1。

圖1 研究流程圖

3 研究與分析

3.1 材料與方法

3.1.1 白虎加人參湯各中藥活性成分及作用靶點(diǎn)收集與篩選

通 過TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）和TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）數(shù)據(jù)庫，在線檢索白虎加人參湯中“知母”、“人參”、“粳米”、“炙甘草”、“石膏”的化學(xué)成分。并設(shè)置口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為限定條件，篩選出各中藥的活性成分。在PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中將收集到的活性成分進(jìn)行確證，將其標(biāo)準(zhǔn)化并下載Canonical SMILES序列，前往SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetpredicTion.ch/）進(jìn)行藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，將獲得的靶點(diǎn)在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）校對(duì)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)。

3.1.2 T2DM相關(guān)靶點(diǎn)的獲取與整理

從GEO數(shù)據(jù)庫下載“Type II diabetes mellitus”相關(guān)芯片“GSE29221”信息，借助GEO2R進(jìn)行分析獲得影響T2DM的差異基因，并與白虎加人參湯靶點(diǎn)取交集獲得共同靶點(diǎn)構(gòu)建韋恩圖。

3.1.3 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將“1.2項(xiàng)下”獲取的共同蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入String V11.0數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）進(jìn)行蛋白互作分析，獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.1.4 成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。使用Cytoscape3.8.0中網(wǎng)絡(luò)分析（Network analyzer）功能，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度（Degree）的大小獲取白虎加人參湯治療T2DM的核心成分。

3.1.5 基因本體（gene ontology，GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

將“1.2項(xiàng)下”獲取的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8平臺(tái)（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進(jìn)行GO功能與KEGG通路分析，并利用Reactome數(shù)據(jù)庫（https://reactome.org/）進(jìn)行相關(guān)機(jī)制分析。

3.1.6 成分-共同靶點(diǎn)-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

對(duì)預(yù)測(cè)到共同靶點(diǎn)的成分、共同靶點(diǎn)、KEGG通路分析結(jié)果進(jìn)行梳理，導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，以構(gòu)建成分-共同靶點(diǎn)-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 動(dòng)物

使用8周齡雄性MKR小鼠。MKR小鼠是一種胰島素抵抗動(dòng)物模型，其骨骼肌特異表達(dá)顯性負(fù)性IGF受體，會(huì)引起肌肉胰島素抵抗，在8周齡時(shí)小鼠會(huì)出現(xiàn)胰島β細(xì)胞衰竭與糖尿病，是較好的T2DM轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型[16]。對(duì)照組采用同周齡雄性的FVB小鼠（SCXK（京）2016-0006）。小鼠均在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適宜環(huán)境中飼養(yǎng)。

3.2.2 藥物

白虎加人參湯組方中藥購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，石膏50 g、知母18 g、人參10 g、粳米9g、炙甘草6 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳勇軍副教授鑒定，均符合《中國(guó)藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。將各味中藥放于砂鍋中并用蒸餾水744 mL浸泡30 min，加熱煮沸后，轉(zhuǎn)用文火煎煮20 min，紗布過濾藥液，藥渣再加蒸餾水465 mL煎煮25 min并過濾，將兩次煎煮的濾液濃縮至含生藥量1 g·mL-1的藥液，放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.3 主要儀器與試劑

儀器：RT-6100酶標(biāo)分析儀、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、電泳儀、熒光定量RCP儀。試劑：小鼠白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA檢測(cè)試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）抗 體、磷 脂 酰 肌 醇3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗體、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）抗體（英國(guó)Abcam公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國(guó)北京康為世紀(jì)公司）。

3.2.4 糖尿病小鼠模型的制備及分組

參考本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究[11]，選取MKR小鼠24只，隨機(jī)分為模型組、白虎加人參湯高劑量組、白虎加人參湯低劑量組，各8只。對(duì)照組采用8只同齡同性別FVB小鼠。小鼠灌胃劑量通過體表面積的等效劑量系數(shù)折算法換算，白虎加人參湯低劑量組給予13.5 g/kg/天白藥液灌胃；高劑量組給予56 g/kg/天白虎加人參湯藥液灌胃。模型組、空白組以等體積蒸餾水灌胃。灌胃容量為0.02 mL/g/天，每天1次，連續(xù)4周。

3.2.5 空腹血糖及血清炎癥因子指標(biāo)的測(cè)定

小鼠禁食不禁水8 h后，先用一次性酒精棉片消毒小鼠尾尖部，待干后，用采血針輕刺小鼠尾梢取血樣，測(cè)定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）值；于眼球取血留取血樣，在4℃環(huán)境下，離心10 min得到血清。采用ELISA法測(cè)量MKR小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

3.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰腺組織中PI3K、AKT、NF-κB的表達(dá)

剪取胰腺組織標(biāo)本約25mg，加入RIPA蛋白裂解液將組織研磨勻漿，冰上裂解10 min后，4℃，12000 rpm離心15 min取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入50 μL 5*loading buffer混勻，沸水煮5 min。制備10%分離膠和4.8%濃縮膠。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，第一孔點(diǎn)入marker 2μL，其它每空上樣10μL已變性蛋白。然后開始電泳，電泳恒定電壓為75V，時(shí)間為130 min。待溴酚藍(lán)電泳至膠底部時(shí)終止電泳。隨后以300 mA恒定電流，NF-KB約85 min、PI3K約130 min、AKT約75 min，β-Tubulin約75 min進(jìn)行轉(zhuǎn)模。隨后將膜浸入至采用1×PBST緩沖液配制5%脫脂奶粉而成的封閉緩沖液中，放置60 min，4℃過夜，次日再放在室溫下30 min進(jìn)行封閉。加入一抗稀釋液兔源AKT（1:10000）、PI3K（1:1000）、NF-κB（1:2000）、β-Tubulin（1:5000）室溫孵育90 min。再加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（1:6000），室溫孵育90 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，在成像系統(tǒng)儀里面拍照。采用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參的灰度值的比值作為蛋白的表達(dá)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.2.7 RT-qPCR檢測(cè)胰腺組織中PI3K、AKT、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量

按Trizol試劑盒說明書提取胰腺組織總RNA，在260 nm與280 nm處測(cè)其吸光度值，計(jì)算總RNA濃度跟純度，以組織總RAN為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，由上海生工生物工程有限公司合成引物序列，內(nèi)參基因選β-Tubulin。引物序列如下：PI3K：正向引物5’-GTCCGTCCTGGAGAACTTGG’，反向引物5’-TGAGGCGTTTCTGGATTGC-3’，片段長(zhǎng)度152 bp；AKT：正 向 引 物5’-CGCCTGCCCTTCTACAACCAG-3’，反向引物5’-GCATGATCTCCTTGGCATCCTC-3’，片 段 長(zhǎng) 度175 bp；NF-κB：正 向 引 物5’-TAGCCAGCGAATCCAGACCAACA-3’；反向引物5’-TGGGTCCCGCACTGTCACCT-3’，片段長(zhǎng)度115bp；β -Tubulin： 正 向 引 物 5’-GTGTGGATTCTGTGGAAGGC-3’；反 向 引 物5’-ATGAAAGCACACATTGCCAC-3’，片段長(zhǎng)度155 bp。使用SYBR法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃10 min，95℃15 s，60℃30 s共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組小鼠胰腺PI3K、AKT、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

3.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 結(jié)果

3.3.1 白虎加人參湯活性成分與作用靶點(diǎn)

從TCMSP數(shù)據(jù)庫和TCMID數(shù)據(jù)庫獲得藥物有效成分：知母159個(gè)、甘草245個(gè)、粳米29個(gè)、人參302個(gè)、石膏1個(gè)，匯總剔除重復(fù)后共721個(gè)，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18篩選并剔除重復(fù)后獲得142個(gè)候選成分，其中可預(yù)測(cè)到靶點(diǎn)的101個(gè)，以其預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)匯總并刪除重復(fù)后共獲得880個(gè)。

3.3.2 T2DM相關(guān)靶點(diǎn)

GEO數(shù)據(jù)庫芯片“GSE29221”記載的是亞洲人的II型糖尿病相關(guān)基因表達(dá)譜，芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，分析獲得差異基因1229個(gè)，與白虎人參湯作用靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)獲得共同靶點(diǎn)70個(gè)（圖2）。

圖2 GSE29221芯片信息（a,b,c）和藥物靶點(diǎn)與疾病差異基因的Veen圖（d）

3.3.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

將2.2獲得的上調(diào)基因與下調(diào)基因共導(dǎo)入String V11.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互作分析并獲取可視化圖形與數(shù)據(jù)結(jié)果，可見節(jié)點(diǎn)間不同顏色連線的數(shù)量差異（圖3）。靶點(diǎn)前十位分別為：VEGFA、FYN、AR、ABL1、PDGFRB、ITGAV、JAK1、TGFBR2、PTK2、EZR。

圖3 蛋白互作分析圖

3.3.4 成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心成分的獲取

使用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，分析發(fā)現(xiàn)菜豆異黃烷Phaseolinisoflavan、異甘草黃酮醇Isolicoflavonol、1-甲氧基菜豆啶素1-Methoxyphaseollidin、蘇齊內(nèi)酯suchilactone、異槲皮酚（Isotrifoliol）這5種成分的度值均大于2倍的平均degree值，而度值越大說明這些成分與靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)數(shù)量越多，因此可以推測(cè)這些成分是白虎加人參湯治療T2DM的核心成分。

3.3.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8分析平臺(tái)進(jìn)行富集分析，GO功能分析得到基因生物過程（biological process，BP）101條，其主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化、正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程；細(xì)胞組成（cell composition，CC）27條，主要參與胞質(zhì)、細(xì)胞外來體、粘著斑等細(xì)胞組成；分子功能（molecular function，MF）26條，主要參與受體結(jié)合、ATP結(jié)合、胰島素樣生長(zhǎng)因子I結(jié)合等分子功能；根據(jù)PValue進(jìn)行排序后取前10進(jìn)行可視化（圖4）。通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，其共同靶點(diǎn)主要與癌癥、MAPK、PI3K-AKT等信號(hào)通路相關(guān)（圖5）。Reactome數(shù)據(jù)庫注釋發(fā)現(xiàn)共同靶點(diǎn)主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病、免疫系統(tǒng)等諸多生物機(jī)制（圖6）。由此可見白虎加人參湯可通過多個(gè)生物機(jī)制達(dá)到治療T2DM的效果。

圖4 GO功能分析結(jié)果

圖5 KEGG通路分析結(jié)果

圖6 共同靶點(diǎn)的機(jī)制分析結(jié)果

3.3.6 成分-共同靶點(diǎn)-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

借助Cytoscape 3.8.0軟件將預(yù)測(cè)獲得的共同靶點(diǎn)的成分、共同靶點(diǎn)與共同靶點(diǎn)相關(guān)通路構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖7）。

圖7 白虎人參湯治療II型糖尿病的成分-靶點(diǎn)-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3.3.7 白虎加人參湯對(duì)MKR小鼠空腹血糖的影響

與對(duì)照組比較，模型組MKR小鼠FBG水平顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，白虎加人參湯高劑量組和低劑量組小鼠FBG水平均顯著下降（P＜0.01），且高劑量組小鼠FBG水平顯著低于低劑量組（P＜0.01）（圖8）。

圖8 白虎加人參湯對(duì)糖尿病MKR小鼠FBG的影響（xˉ±s，n=8）

3.3.8 白虎加人參湯對(duì)MKR小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組MKR小鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平均顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，白虎加人參湯高劑量組、低劑量組小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且高劑量組小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著低于低劑量組（P＜0.01）（圖9）。

圖9 白虎加人參湯對(duì)糖尿病MKR小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響（xˉ±s，n=8）

3.3.9 白虎加人參湯對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路中PI3K、AKT和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組MKR小鼠胰腺PI3K、AKT及NF-κB蛋白表達(dá)水平均顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，白虎加人參湯高劑量組和低劑量組小鼠胰腺PI3K、AKT及NF-κB蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.01），其中白虎加人參湯高劑量組的NF-κB水平顯著低于低劑量組（P＜0.01）（圖10-圖11）。

圖10 各組小鼠胰腺組織的PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)電泳分析

圖11 白虎加人參湯對(duì)糖尿病MKR小鼠胰腺組織PI3K、AKT和NF-κB蛋白表達(dá)的影響（xˉ±s，n=8）

3.3.10 白虎加人參湯對(duì)MKR小鼠胰腺組織PI3K、AKT和NF-κB mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組MKR小鼠胰腺PI3K、AKT和NF-κB mRNA表達(dá)水平均顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，白虎加人參湯高劑量組和低劑量組小鼠胰腺PI3K、AKT和NF-κB mRNA表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.01），其中白虎加人參湯高劑量組的NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著低于低劑量組（P＜0.01）（圖12）。

圖12 白虎加人參湯對(duì)糖尿病MKR小鼠胰腺組織中PI3K、AKT和NF-κB mRNA表達(dá)的影響（xˉ±s，n=8）

4 討論

T2DM的發(fā)生發(fā)展與長(zhǎng)期存在的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及糖脂代謝失調(diào)密切相關(guān)[17-18]?！督饏T要略》載：“寸口脈浮而遲，……勞則營(yíng)氣竭?！贝缈诿}即肺脈，主上焦病變，浮主陽虛氣浮，是衛(wèi)氣虧虛之征；遲主營(yíng)血不足，血脈不充，陽虛氣浮不斂，營(yíng)虛燥熱內(nèi)生，氣陰兩虛而形成消渴；又曰：“渴欲飲水，口干舌燥者，白虎加人參湯主之”。消渴發(fā)病可見口干舌燥、煩渴多飲、神疲乏力等癥狀，多因肺胃熱盛、耗氣傷津所致，屬后世所說“上消”之疇。白虎加人參湯中石膏辛寒質(zhì)重，善清透氣熱；知母苦寒滑潤(rùn)，善瀉火滋陰，人參氣陰雙補(bǔ)，粳米護(hù)胃理氣，甘草甘緩生津，調(diào)和諸藥，全方共奏清熱益氣，生津止渴之功，組方配伍契合消渴病機(jī)，廣泛應(yīng)用于T2DM臨床治療。臨床研究表明西醫(yī)常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加服白虎加人參湯可有效改善T2DM患者糖脂代謝指標(biāo)、炎癥因子和氧化應(yīng)激水平[19]，因此，運(yùn)用白虎加人參湯治療T2DM有堅(jiān)實(shí)的理論和臨床實(shí)踐基礎(chǔ)。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵通路的方法，從有效成分、蛋白靶點(diǎn)和通路等方面綜合探索評(píng)價(jià)白虎加人參湯治療T2DM的作用效果。對(duì)白虎加人參湯的活性成分和T2DM相應(yīng)的靶標(biāo)進(jìn)行收集與篩選，得到符合標(biāo)準(zhǔn)的有70個(gè)。進(jìn)一步構(gòu)建成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)異槲皮酚、菜豆異黃烷、異甘草黃酮醇、1-甲氧基菜豆啶素、蘇齊內(nèi)酯這5種活性成分與治療T2DM相關(guān)性較高。從文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，這些有效成分主要與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，改善糖脂代謝、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等機(jī)制密切相關(guān)。如異甘草黃酮醇可以激活HepG2細(xì)胞內(nèi)CYP3A4和A549細(xì)胞內(nèi)Nrf-2的表達(dá)，促進(jìn)有毒物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的排泄，起到減毒從而達(dá)到維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用[20]。有研究證明異槲皮酚可抑制脂多糖誘導(dǎo)的NF-κB的活化從而下調(diào)IL-1β、IL-6等促炎因子及細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平[21]。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析可知，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、非受體酪氨酸激酶（tyrosine kinase Fyn，F(xiàn)YN）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、酪氨酸蛋白激酶（tyrosineprotein kinase ABL1，ABL1）、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFRB）、整合素αv（integrinαv，ITGAV）、酪氨酸激酶1（Janus kinase 1，JAK1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B受體-2（recombinant transforming growth factor beta receptorⅡ，TGFBR2）、蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK2）、細(xì)胞膜骨架連接蛋白埃茲蛋白（ezrin，EZR）這10個(gè)蛋白靶點(diǎn)靠前，這說明白虎加人參湯的活性成分與這些蛋白靶點(diǎn)具有較高的結(jié)合活性。VEGFA是一種促血管生成因子。Agudo J等在成年小鼠的胰島中發(fā)現(xiàn)VEGFA的過度表達(dá)可誘導(dǎo)胰島血管過度增生、形態(tài)改變和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致了胰島素分泌受損、β細(xì)胞減少和高血糖發(fā)生[22]。Fyn是Src激酶家族（Src family kinases，SFK）中的一員，研究表明將糖尿病小鼠的Fyn基因敲除，能改善外周組織胰島素敏感性及糖尿病小鼠的葡萄糖耐量[23-24]。AR是核受體超家族的成員，能介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄，在抵制肥胖、抑制機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗方面發(fā)揮重要作用[25]。C-ABL1具有酪氨酸激酶活性,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和存活、應(yīng)激反應(yīng)和DNA損傷、細(xì)胞遷移、侵襲粘附及凋亡。研究表明，糖尿病小鼠心肌細(xì)胞c-Al表達(dá)上調(diào)，當(dāng)特異性抑制c-Abl表達(dá)可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展并減少心肌損傷[26]。以上也證實(shí)了通過PPI網(wǎng)絡(luò)所篩選的靶點(diǎn)蛋白的確與T2DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，VEGFA、FYN、AR、ABL1、PDGFRB、ITGAV、JAK1、TGFBR2、PTK2、EZR可能為白虎加人參湯治療T2DM的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。

從GO功能富集結(jié)果分析可知，GO生物注釋中細(xì)胞組分有胞質(zhì)、細(xì)胞外來體、粘著斑等，存在受體結(jié)合等分子功能，主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化，蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制。再者是對(duì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行正向調(diào)節(jié)，以及發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)作用，白虎加人參湯可能正是通過此方式發(fā)揮作用。KEGG分析發(fā)現(xiàn)其共同靶點(diǎn)主要與癌癥、PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路之間存在著相關(guān)性。有研究表明，DM與肝癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的高發(fā)病率與高死亡率之間存在著密切的相關(guān)性，高糖狀態(tài)、高胰島素血癥、胰島素生長(zhǎng)因子-1、氧化應(yīng)激、炎癥因子及類固醇激素失調(diào)等共同促進(jìn)了糖尿病患者發(fā)生惡性腫瘤的進(jìn)展[27]。MAPK信號(hào)通路包括p38 MAPK通路、JNK通路及ERK通路，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡等多種過程。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路與DM的糖脂代謝、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)控制之間存在著密切的相關(guān)性[28-29]。

研究表明，PI3K/Akt途徑是胰島素作用的主要信號(hào)通路，PI3K是調(diào)節(jié)糖代謝的關(guān)鍵蛋白，位于其下游的信號(hào)分子Akt是重要的蛋白激酶[30]。PI3K/Akt信號(hào)通路的異常對(duì)DM病情進(jìn)展影響較大，其在介導(dǎo)機(jī)體糖脂代謝、蛋白合成等方面效果顯著[31-33]。研究表明，當(dāng)PI3K/AKT的調(diào)節(jié)功能受影響時(shí)，則會(huì)發(fā)生肥胖等病。此時(shí)有效抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，則是一種抵抗肥胖、逆轉(zhuǎn)疾病負(fù)面影響的安全有效的干預(yù)措施[34]。研究表明糖尿病引起的高糖毒性環(huán)境、氧化應(yīng)激等病理因素能夠過度激活PI3K/Akt信號(hào)通路，此時(shí)要治療T2DM則應(yīng)當(dāng)抑制過度激活的PI3K/AKT信號(hào)通路[35]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等過程。且PI3K在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[36-37]。龔又明等[38]研究小檗堿對(duì)HepG2胰島素抵抗細(xì)胞PI3K/AKT1/GLUT1信號(hào)通路的調(diào)控作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，小檗堿通過使HepG2細(xì)胞中的PI3K p85表達(dá)上調(diào)，Akt1蛋白表達(dá)下調(diào)，能提高細(xì)胞的葡萄糖代謝能力，改善胰島素抵抗。PI3K/Akt信號(hào)通路在T2DM的炎癥反應(yīng)過程中起著關(guān)鍵的作用。PI3K/Akt信號(hào)通路下游的重要效應(yīng)因子是NF-κB，NF-κB是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，也是炎癥啟動(dòng)和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵核因子，NF-κB活化后可誘導(dǎo)眾多炎性因子如TNF-α、IL-6和IL-1β等的表達(dá)，引起炎性反應(yīng)，而產(chǎn)生的IL-1β和TNF-α等又能使得更多NF-κB活化，從而加重T2DM的發(fā)生發(fā)展[39-40]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)白虎加人參湯能夠有效降低T2DM MKR小鼠血糖及炎癥水平，但其降糖和調(diào)節(jié)炎癥機(jī)制尚未完全闡明[11]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路是白虎加人參湯干預(yù)T2DM的重要信號(hào)通路之一，基于此推進(jìn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白虎加人參湯能下調(diào)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的PI3K/AKT通路中過度激活的PI3K、Akt、NF-κB蛋白表達(dá)，降低PI3K、Akt、NF-κB mRNA表達(dá)量，降低MKR小鼠FBG水平及血清中IL-6、IL-1β、TNF-α炎性因子水平，產(chǎn)生降糖及抗炎活性而具有治療T2DM的作用，進(jìn)一步證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。

5 結(jié)論

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)明確了白虎加人參湯有效成分及其干預(yù)T2DM的潛在作用靶點(diǎn)，通過GO富集分析和KEGG通路分析了解了白虎加人參湯治療T2DM的復(fù)雜生物學(xué)過程及其調(diào)控的信號(hào)通路，并對(duì)其關(guān)鍵的作用通路進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示了白虎加人參湯治療T2DM具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了白虎加人參湯能夠下調(diào)PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)及mRNA相對(duì)表達(dá)量，降低MKR小鼠血糖和血清炎癥因子水平，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，為深入研究白虎加人參湯治療T2DM提供了依據(jù)。本研究尚存在以下局限性：首先，本文涉及的靶點(diǎn)、信號(hào)通路較多，需要注意的是，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是依據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫和已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的建模，由于原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、圖譜信息來源于不同的實(shí)驗(yàn)條件，故大多實(shí)驗(yàn)存在一定的假陽性率，已經(jīng)評(píng)價(jià)的小分子化合物及其作用靶點(diǎn)數(shù)量均有限；其次，中藥在煎煮時(shí)會(huì)發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，本研究未將白虎加人參湯煎煮后的化學(xué)成分以及藥物在體內(nèi)的代謝物納入分析。