張 強(qiáng)，張 敏，黃志榮，王 高，胡中立，章智華

（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬洪都中醫(yī)院 南昌 330006）

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨質(zhì)流失、骨纖維變性，骨脆性增加為特征的老年常見疾病。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率較高，常見于絕經(jīng)后婦女和老年男性。目前，全球范圍內(nèi)約有四成的絕經(jīng)后婦女正在忍受骨質(zhì)疏松癥帶來的病痛，隨著世界人口老齡化的增加，該數(shù)字可能在不久的將來逐年增長[1-2]。骨質(zhì)疏松會導(dǎo)致骨痛、骨質(zhì)疏松性骨折等并發(fā)癥，其中骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折的危害巨大，是老年患者致殘和致死的主要原因之一，這嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全，給患者的經(jīng)濟(jì)也帶來沉重的負(fù)擔(dān)[3]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，且與生活方式、服用藥物等多種因素相關(guān)。研究表明[4-6]，Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)與骨質(zhì)疏松的發(fā)生及緩解密切相關(guān)，其異常表達(dá)會造成骨形成障礙，進(jìn)而誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。

續(xù)斷皂苷VI（Asperosaponin VI）又名木通皂苷D，提取自續(xù)斷，為川續(xù)斷科多年生草本植物川續(xù)斷Dipsacus asperWall.ex Henry的干燥根，因能“續(xù)折接骨”而得名。續(xù)斷皂苷VI是一種用于止血、促進(jìn)骨損傷愈合、降低子宮收縮、補(bǔ)肝腎的白色結(jié)晶藥物。中醫(yī)醫(yī)生利用續(xù)斷皂苷VI，根據(jù)經(jīng)典著作《本經(jīng)》并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)研制出溫腎強(qiáng)骨丸，其具有強(qiáng)筋壯骨、活血通絡(luò)的功能。經(jīng)長期臨床應(yīng)用證實(shí)，其對骨質(zhì)疏松癥有很好的臨床療效[7-9]，但其作用機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)[10]續(xù)斷皂苷VI治療處理后相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，并證實(shí)續(xù)斷皂苷VI治療可以調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝，物質(zhì)運(yùn)輸和卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松癥。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷皂苷VI治療可以改變Wnt/β-catenin信號通路表達(dá)強(qiáng)度，調(diào)高應(yīng)激因子的表達(dá)，從而起到治療骨質(zhì)疏松的作用[11]，其主要組成成分-木通皂苷D可將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，這也與Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)[12-13]。因此，在前人研究的基礎(chǔ)上，我們通過檢測SOST等指標(biāo)來研究續(xù)斷皂苷VI治療對骨質(zhì)疏松的影響及作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)觀察續(xù)斷皂苷VI對骨質(zhì)疏松大鼠的作用，并探索其可能的作用機(jī)制是否是與Wnt/β-Catenin信號通路的激活相關(guān)，為骨質(zhì)疏松的防治提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)，另外，通過動物實(shí)驗(yàn)研究續(xù)斷皂苷VI在治療骨質(zhì)疏松癥中的潛在應(yīng)用價(jià)值，以及驅(qū)動這種效應(yīng)產(chǎn)生可能的機(jī)制，為防治骨質(zhì)疏松癥提供重要參考和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級的雌性成年Wistar大鼠50只，體質(zhì)量200±10 g。年齡8周齡。購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司。大鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境下，定時(shí)輻照滅菌，實(shí)驗(yàn)全程給予所有大鼠便捷自由的飲水和采食設(shè)備，隨時(shí)觀察大鼠狀態(tài)，排除飼養(yǎng)過程中產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開始實(shí)驗(yàn)建模。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥及引物來源

續(xù)斷皂苷VI，藥片制，每片10 mg總?cè)萘浚褂脮r(shí)研磨成細(xì)粉，每1 g溶解于87 mL水。貨號：PU0602-0025，購自美國PhytoUnico公司。Wnt3a、β-catenin、LRP5、Runx2、SOST、Osx引物由Bomedical Engineering公司合成。使用針對β-actin的抗體：Wnt3a、βcatenin、LRP5、Runx2、SOST、Osx作為對照，抗體購自武漢博斯特生物有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和藥物處理

購置50只SPF級雌性大鼠，先適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，后隨機(jī)分為4組：續(xù)斷皂苷VI組，模型組，假手術(shù)組和對照組。模型組和續(xù)斷皂苷VI組大鼠通過切除卵巢以誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥，建立大鼠骨質(zhì)疏松模型[14]。假手術(shù)組大鼠切除卵巢周圍的少量脂肪組織。對照組未接受任何處理。術(shù)后續(xù)斷皂苷VI組的大鼠連續(xù)給藥12周。根據(jù)人類使用續(xù)斷皂苷VI的日劑量調(diào)整大鼠的給藥量，不同患者在治療時(shí)使用的臨床劑量可通過給藥量與體表之比確定，使用相同的方法，測量每只大鼠的體表面積，計(jì)算臨床給藥量。其他組給予等劑量的0.9%生理鹽水。

2.2 取樣方法

給藥84天后，將大鼠禁食1天。經(jīng)腹主動脈取血，將血清進(jìn)行分離后，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取大鼠右后肢股骨，將其與肌肉等其他組織剝?nèi)ゲ⑺榛?，放入事先?zhǔn)備好的無菌EP管中，于-80℃冰箱中保存，備用。

2.3 檢測方法

2.3.1 骨密度（BMD）測定

應(yīng)用X線骨密度儀，先在給藥前進(jìn)行檢測，測定各組大鼠股骨的BMD，停止給藥后，再次繼續(xù)檢測，測定各組大鼠BMD，并根據(jù)給藥前后時(shí)間節(jié)點(diǎn)，對大鼠BMD變化情況進(jìn)行觀察[13]。

2.3.2 最大載荷測定

取各組大鼠左后肢股骨，首先剔除股骨上的肌肉，再剔除股骨上的其他組織，最后進(jìn)行稱重。將取好的各組大鼠去除組織的股骨置于生物力學(xué)測定儀基座上并固定。當(dāng)測定儀前端自動擠壓股骨斷裂時(shí)，記錄數(shù)值。

2.3.3 免疫組織化學(xué)法

使用蛋白免疫組織化學(xué)染色法觀察成骨細(xì)胞的形態(tài)，檢測Wnt3a、β-catenin、LRP5、Runx2、SOST和Osx蛋白的表達(dá)。通過DAB顯色反應(yīng)，進(jìn)行所要檢測蛋白抗原的半定量。并且拍照成骨細(xì)胞的形態(tài)。

2.3.4 RT-PCR

將保存的各組大鼠股骨立即浸入液氮中，在液氮保護(hù)下，迅速研磨至細(xì)粉。應(yīng)用Trizol法提取各組大鼠骨組織中的總RNA。取適量RNA按照試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。以β-actin作為內(nèi)參基因，分析各組樣品mRNA的相對表達(dá)量，進(jìn)行差異比較。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物堿基序列

2.3.5 Western blot分析

檢測Wnt3a、β-catenin、LRP5、Runx2、SOST和Osx蛋白的表達(dá)。本研究中使用的抗體是：Wnt3a、βcatenin、LRP5、Runx2、SOST、Osx。使用針對β-肌動蛋白的抗體作為對照（Bomedical Engineering公司）。

2.4 統(tǒng)計(jì)結(jié)果策略

統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并將每個(gè)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s）統(tǒng)計(jì)差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義的差異的判定為P＜0.05。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件22.0版本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的組間比較使用t檢驗(yàn)進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 骨質(zhì)疏松組織形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，續(xù)斷皂苷VI治療組的骨小梁結(jié)構(gòu)比模型組更完整，排列更整齊，稍薄一些，只有少量的空骨缺損，沒有明顯的骨折和吸收。模型組小梁結(jié)構(gòu)缺損排列不規(guī)則，變薄，復(fù)位，骨孔大量，輕度骨折。假手術(shù)組與對照組相似。骨小梁結(jié)構(gòu)完美，骨小梁沒有被吸收，穿孔和折斷。對照組的股骨HE染色顯示小梁的結(jié)構(gòu)排列良好，直徑小，間隔小。

圖1 HE染色組織學(xué)觀察

組織形態(tài)學(xué)變量包括小梁分離度（TbSp,Trabecular separation），小 梁 數(shù) 鉬（TbN,Trabecular number），小梁厚度（TbTh,Trabecular thickness）和小梁面積百分比（TbAr,Trabecular Area）。模型組與假手術(shù)組，對照組相比有顯著差異（P＜0.05）。續(xù)斷皂苷VI治療治療12周后，續(xù)斷皂苷VI治療組的四項(xiàng)指標(biāo)與模型組相比有差異（*P＜0.05）。續(xù)斷皂苷VI治療組的骨小梁數(shù)目及厚度與假手術(shù)組和對照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著差異（＃P＜0.05，&P＜0.05）（表2、圖2）。

圖2 病理評分比較

表2 病理評分比較

3.2 檢測股骨生物學(xué)的抗彎曲力和抗擠壓力

續(xù)斷皂苷VI組進(jìn)行藥物處理12周后，模型組與假手術(shù)組，對照組相比有顯著差異（P＜0.05），續(xù)斷皂苷VI組與模型組的最大負(fù)荷（ML,maximum load）和彈性模量（EM,elasticity modulus）顯著不同（*P＜0.05），與空白對照組與假手術(shù)組之間無明顯差異（表3、圖3）。

表3 L2椎體的最大負(fù)荷和彈性模量

圖3 L2椎體的最大負(fù)荷和彈性模量

如圖4所示，使用蛋白免疫組織化學(xué)染色觀察成骨細(xì)胞的形態(tài)。除SOST外，續(xù)斷皂苷VI治療組，對照組和假手術(shù)組的Wnt3a、β-catenin、LRP5、Runx2和Osx蛋白的表達(dá)比模型組低，其他組比模型組高（表4）。其中，假手術(shù)組中LRP5和Osx蛋白染色最深，對照組中Wnt3a、β-catenin和Runx2染色最深，模型組SOST蛋白表達(dá)水平高于其他組。續(xù)斷皂苷VI治療組，假手術(shù)組和模型組的β-catenin染色程度均較對照組輕（圖4）。續(xù)斷皂苷VI治療組，假手術(shù)組和對照組中Wnt3a、β-catenin、LRP5、Runx2和Osx蛋白的表達(dá)均高于模型組（圖5）。

圖5 免疫組織化學(xué)法染色半定量

表4 免疫組織化學(xué)法染色蛋白表達(dá)差異

圖4 免疫組織化學(xué)法染色蛋白表達(dá)差異

3.4 RT-PCR中Wnt3a、LRP5、β-catenin、Runx2和Osx mRNA的表達(dá)

如圖6所示，第6天，含續(xù)斷皂苷VI治療的血清中Wnt3a、LRP5、β-catenin、Runx2和Osx mRNA的表達(dá)高于其他各組，尤其是模型組（*P＜0.05，＃P＜0.05，&P＜0.05）。續(xù)斷皂苷VI治療組的SOST mRNA水平明顯低于模型組，略高于假手術(shù)組和對照組（*P＜0.05，＃P＜0.05，&P＜0.05）（表5）。

表5 Wnt3a、LRP5、β-catenin、Runx2和Osx mRNA的表達(dá)

圖6 RT-PCR mRNA的表達(dá)差異

3.5 Wnt/β-Catenin信號通路的蛋白表達(dá)對比

與假手術(shù)組與空白對照組相比，模型組SOST表達(dá)明顯上調(diào)，Wnt3a、β-catenin、Runx2、Osx表達(dá)明顯降低（表6）。與模型組相比，續(xù)斷皂苷VI治療組SOST表達(dá)明顯下調(diào)，Wnt3a、β-catenin、Runx2、Osx表達(dá)明顯升高。與假手術(shù)組相比，續(xù)斷皂苷VI治療組SOST的表達(dá)略有差異，Wnt3a、β-catenin和Osx的表達(dá)較弱，Runx2的表達(dá)較弱。與對照組相比，結(jié)果與假手術(shù)組相似。各組中LRP5的表達(dá)水平變化不大（圖7-圖8）。

圖7 Wntβ-Catenin信號通路的蛋白表達(dá)對比

圖8 Wntβ-Catenin信號通路的蛋白表達(dá)對比

表6 Wnt/β-Catenin信號通路的蛋白表達(dá)對比

4 討論

Wnt信號通路的觸發(fā)機(jī)制為Wnt蛋白家族的成員與卷曲蛋白（Fz，G蛋白偶聯(lián)受體樣蛋白）和LRP5或LRP6的共受體復(fù)合物結(jié)合。通過募集幾種蛋白質(zhì)到激活的Fz和LRP5和LRP6共受體的C末端細(xì)胞內(nèi)部分來傳輸信號。修飾蛋白質(zhì)后，可基于Wnt-LRP5和LRP6-Fz配合物的特異性，激活3個(gè)獨(dú)立的途徑：經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)，Wnt/PCP途徑和Wnt/Ca2+途徑。這三種途徑均調(diào)節(jié)LRP5和LRP6下游骨形成，而經(jīng)典的Wnt信號途徑是目前研究最多的途徑。經(jīng)典的Wnt信號通路需要活性LRP5和LRP6，以及許多細(xì)胞外激動劑，拮抗劑和細(xì)胞內(nèi)酶調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)[15-18]。Wnt信號的細(xì)胞外調(diào)節(jié)劑主要包括2種天然抑制劑，每種都靶向一種Wnt共同受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。第一種（Fz相關(guān)分泌蛋白）結(jié)合并中和Wnt蛋白，溶劑化Fz受體并阻止Wnt與Fz的結(jié)合。另一個(gè)包括可導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的LRP5和LRP6受體結(jié)合的dickkopf（Dkk）和SOST。在細(xì)胞中，Wnt信號通路最典型的抑制劑是GSK-3β和支架蛋白axin[20]。這些蛋白質(zhì)可形成β-catenin的磷酸化復(fù)合物，導(dǎo)致β-catenin降解，最后在細(xì)胞核中，β-catenin/Tcf復(fù)合物具有轉(zhuǎn)錄活性，或者也嚴(yán)格控制了核的ar定位。例如，研究表明Ctnnbip1/Icat或Cby/Chibby分別與β-catenin結(jié)合并抑制其與Tcf的相互作用并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中的過程[21]。轉(zhuǎn)錄阻遏物（例如Groucho）能夠與Tcf的特定主體結(jié)合，從而中和其在β-catenin下游的活性。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組與空白對照組相比，續(xù)斷皂苷VI治療組nt3a，βcatenin表達(dá)明顯升高，與模型組相比，Wnt3a、βcatenin表達(dá)明顯升高。

Runx2是經(jīng)典WNT信號通路的直接靶點(diǎn)，對于成骨細(xì)胞的分化至關(guān)重要。先前的研究表明，小鼠和人類內(nèi)Runx2基因的突變會導(dǎo)致顱骨發(fā)育不良和骨骼形成中的關(guān)鍵缺陷。成骨細(xì)胞含有一種名為Osx的特定轉(zhuǎn)錄因子，這種因子可在成骨細(xì)胞分化為成熟成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的過程中進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，所以當(dāng)發(fā)生Osx突變時(shí)，胚胎將不能形成骨骼并且不會表達(dá)特異性的成骨細(xì)胞標(biāo)記基因。Runx2基因?qū)τ贠sx表達(dá)至關(guān)重要[22-23]，在骨形成過程中，只有在表達(dá)Runx2的前體中表達(dá)Osx才能誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化為成熟的功能正常的成骨細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，續(xù)斷皂苷VI治療組，假手術(shù)組和對照組中Runx2和Osx蛋白的表達(dá)均高于模型組。

SOST是Wnt信號通路的拮抗劑，與另一種Wnt拮抗物同源：Wise和Sclerotin是CCN蛋白家族的成員，其被認(rèn)為具有結(jié)合、抑制BMP信號傳導(dǎo)的能力。研究表明，CCN蛋白可通過結(jié)合LRP5和LRP6來抑制Wnt信號通路的表達(dá)[24]。此外，SOST幾乎僅在骨細(xì)胞中表達(dá)，盡管在心臟，肝臟和腎臟等部位都可以表達(dá)SOST mRNA，但這些位點(diǎn)并未檢測到SOST，表明SOST的表達(dá)具有高度的組織特異性。SOST可通過其與LRP5的結(jié)合起到負(fù)調(diào)節(jié)骨形成作用，一旦該過程被抑制，將導(dǎo)致高骨量綜合癥。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，續(xù)斷皂苷VI治療組SOST表達(dá)明顯下調(diào)，與假手術(shù)組和對照組相比，續(xù)斷皂苷VI治療組SOST的表達(dá)略有差異。骨質(zhì)疏松性假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合癥（OPS）是一種常染色體顯性遺傳疾病，是因LRP5突變，與SOST結(jié)合失敗，從而阻止了Wnt/β-catenin信號通路的激活，最終導(dǎo)致骨形成減少，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。突變組中有范布赫姆病和硬化，它的骨密度要高得多，并且臨床表現(xiàn)很明顯，例如顱內(nèi)壓升高和耳聾。遺傳分析表明，硬化癥是由于SOST基因產(chǎn)物功能的喪失而引起的，而范布赫姆病則與SOST下游調(diào)控區(qū)的部分缺失有關(guān)。此外，研究表明，SOST基因敲除小鼠的骨礦物質(zhì)密度和骨形成率增加了[26]。SOST不僅可以促進(jìn)成骨成骨細(xì)胞的形成，而且還可以破壞骨骼。實(shí)驗(yàn)表明，SOST可以促進(jìn)碳酸酐酶mRNA和蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)pH值，并促進(jìn)鈣在礦化基質(zhì)中的釋放[27]。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SOST可以通過劑量依賴的方式減少OPG mRNA的表達(dá)，增加RANKL mRNA的表達(dá)，增加RANKL/OPG的表達(dá)比。這表明，破骨細(xì)胞可使用依賴RANKL促進(jìn)破骨細(xì)胞因子的方式被激活[28-29]。研究人員認(rèn)為，嵌入骨最小化基質(zhì)中的細(xì)胞是骨骼中的主要機(jī)械傳感器，參與骨骼形成的調(diào)節(jié)并通過骨骼重塑確定骨骼質(zhì)量和形狀[30]。盡管尚未完全闡明SOST在骨細(xì)胞中的確切生理作用，但最近的數(shù)據(jù)表明SOST的表達(dá)受機(jī)械負(fù)荷和PTH的影響，可以局部緩解內(nèi)源性Wnt抑制并激活骨形成。目前，研究人員已開發(fā)出SOST中和性單克隆抗體，并顯示出強(qiáng)大的骨骼代謝活性。在靈長類動物研究中，它還具有強(qiáng)大的藥代動力學(xué)特性和顯著的代謝活性。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，SOST基因與骨質(zhì)疏松可能與其表達(dá)產(chǎn)物有關(guān)。SOST可以抑制成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖和異位骨形成[31]。這表明，中國漢族婦女的SOST基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松性骨折密切相關(guān)。

本研究中，續(xù)斷皂苷VI治療組的小梁骨密度顯著高于對照組，并且束骨髓比增加，表明續(xù)斷皂苷VI治療對骨質(zhì)增生有明顯作用。續(xù)斷皂苷VI治療組股骨組織中SOST蛋白的含量明顯低于對照組，β-catenin蛋白的含量明顯高于對照組，Wnt信號通路的直接靶標(biāo)Runx2和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子明顯增加，表明續(xù)斷皂苷VI治療可以降低SOST的含量，使Wnt/βcatenin途徑順利進(jìn)行，促進(jìn)骨骼形成。對照組中SOST蛋白的升高和β-catenin含量的降低也證實(shí)了SOST蛋白在骨質(zhì)疏松癥的形成中起著重要作用——阻止SOST表達(dá)，促發(fā)骨形成，抑止骨吸收，為治療各種病因引起的骨質(zhì)流失提供了一種新途徑。由于Wnt途徑參與多種代謝途徑，因此該途徑的激活可能與其他疾病的復(fù)發(fā)有關(guān)，并且，由于SOST具有成骨細(xì)胞特異性，這也使SOST其自身成為治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶標(biāo)。另外，本文通過科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)探索續(xù)斷皂苷VI調(diào)控Wnt/β-Catenin通路對骨質(zhì)疏松的影響機(jī)制，推動了課題的發(fā)展，為課題提供了有理有據(jù)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對于課題的發(fā)展具有不可替代的重要意義。相信隨著分子遺傳學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展以及人們對SOST基因的深入了解，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病原因及斷皂苷VI治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制通路將被明確闡述。