李 翔，曾曉鈴，顧政平，李珊珊，徐世芬＊＊，李 蔚

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院 上海 200071；2.上海交通大學醫(yī)學院學術部 上海 200030；3.復旦大學基礎醫(yī)學院 上海 200231）

抑郁癥（Depression）是一種多因素導致的精神障礙，主要特征是情緒憂郁、缺乏興趣和動力[1]。世界衛(wèi)生組織認為抑郁癥是社會中負擔最重的疾病，它可能成為全球高致殘率的主要誘因之一[2-3]，在我國抑郁癥患病率在逐年上升，但有將近一半以上的患者未接受任何治療。目前對于抑郁癥的機制研究主要集中在神經(jīng)遞質的減少[4]，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸改變[5]，免疫功能異常[6]及神經(jīng)可塑性[7]等。然而現(xiàn)有的治療抑郁癥的藥物不能有效的改善抑郁癥狀，針灸作為一種安全綠色的治療方法，已經(jīng)被證實能夠有效的改善抑郁患者的癥狀[8-9]。因此，進一步了解針灸治療抑郁癥的作用機制可以為抑郁癥的預方和治療提供新的思路與方向。

隨著對抑郁癥的研究深入，通過蛋白組學、基因組學和代謝組學等組學方式揭示抑郁癥的發(fā)病機制被廣泛接受。代謝組學是通過分析比較機體內代謝物在不同病理生理狀態(tài)下的變化[10]，代表著生物體對內部和外部刺激的最終反應。目前，代謝組學廣泛用于電針治療各種疾病的研究中，路思宇[11]等人利用代謝組學研究電針對腦梗死大鼠的尿液代謝的影響，陳平[12]等運用代謝組學研究電針對類風濕關節(jié)炎動物模型內源代謝物的影響，新昕[13]等人通過血清代謝組學研究電針對消化不良大鼠模型的影響，因此，代謝組學特別有利于識別病理生理影響的過程，為疾病的發(fā)生提供重要的證據(jù)，能夠尋找出對疾病起著決定作用的生物標志物。

目前的研究已經(jīng)表明，抑郁癥的發(fā)生和代謝產(chǎn)物的變化有關[14-16]。針刺是在整體觀念的指導下對機體產(chǎn)生一系列的反應從而達到治療的效果。但是否能夠通過調節(jié)代謝產(chǎn)物，影響相關代謝通路起到改善抑郁行為需要進一步研究?；诖?，本研究將在證實電針能夠改善WKY抑郁大鼠抑郁樣行為的基礎上，進一步采用代謝組學的研究方法，探究電針是否能夠引起代謝產(chǎn)物變化，影響相關代謝通路，從代謝組學的方向評估針刺的抗抑郁作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

NewClassic MS電子天平（METTLER TOLEDO）；冷凍離心機（Eppendorf）；控溫超聲波清洗機-10L（寧波新芝生物科技股份有限公司）；多樣品冷凍研磨儀（上海萬柏生物科技有限公司）；臺式快速離心濃縮干燥器（太倉市華美生化儀器廠）；氮氣吹掃儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；液相色譜系統(tǒng)（AB SCIEX）；質譜儀（AB SCIEX）；華佗電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司）；針灸針（無錫佳健醫(yī)療器械股份有限公司），行為學示蹤系統(tǒng)（上海欣軟科技有限公司）。

1.2 動物

SPF級雄性Wistar大鼠和Wistar-Kyoto（WKY）雄性大鼠，6周齡左右，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有動物進入動物房后均需經(jīng)過一周的適應，期間自由攝食和飲水，然后再開始進行試驗。動物房室溫維持在22℃-27℃，濕度為40%-60%，噪音控制在50 dB以下，每天接受晝夜節(jié)律的光照。本次實驗中的所有動物實驗均是按照《上海中醫(yī)藥大學實驗動物準則和使用規(guī)范》及動物倫理實驗要求開展的。

1.3 動物分組及代謝樣本收集

24只WKY大鼠隨機分為模型組、電針組和假針組，8只Wistar大鼠作為對照組。電針組：抑郁模型大鼠進行電針干預。取穴：百會、足三里，參照《實驗動物針灸穴位圖譜》。操作方法：百會向前斜刺5 mm，足三里直刺3 mm，華佗電針儀，將正極連接于百會上，負極連接足三里，足三里單側交替進行連接，連續(xù)波，頻率2 Hz，電流根據(jù)大鼠頭部出現(xiàn)顫動并且不嘶叫為度，留針15 min，連續(xù)治療3周。為避免因動物捆綁而引起的應激反應而干擾實驗結果，大鼠在電針過程中被置于特制的塑料鼠籠中，使得大鼠有一定的活動空間。假電針組：抑郁模型大鼠進行假電針干預。采用同電針組同樣的抓取，將同樣的針灸針分別用膠帶固定于百會、足三里體表，并給予電極連接，但無電流，干預時間同電針組。電針干預結束收集對照組、模型組和電針組大鼠的糞便樣品，假針刺組不收集。

1.4 行為學測試

1.4.1 曠場實驗

曠場場地為一個50 cm×50 cm×40 cm的正方形區(qū)域。每次實驗將一只實驗大鼠置于曠場中，通過曠場實驗平臺軟件記錄大鼠5min內的運動情況。在進行下一只實驗前，用75%酒精擦拭曠場，待曠場充分干燥后放入大鼠。曠場底部被平分為9個區(qū)域，其中心為中央?yún)^(qū)域。大鼠在中央?yún)^(qū)的運動路程總和為中央距離，在曠場內前肢離地，后肢著地為直立狀態(tài)并記錄次數(shù)。曠場中的運動總路程為總距離將用來評估大鼠的運動能力。曠場實驗數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)使用上海欣軟平臺進行記錄與分析。

1.4.2 強迫游泳

往高45 cm、直徑18 cm的玻璃圓筒中倒入24℃-28℃的水，水深度30 cm。將大鼠置于圓筒中，通過軟件計時，記錄5 min內大鼠的不動時間。

1.4.3 新奇抑制攝食

實驗場地為長50 cm、高40 cm的正方形敞箱，在箱底中央固定一食盒，在盒中放入數(shù)塊糖丸。試驗開始前，動物禁食48 h，試驗時從任意位置將大鼠入敞箱中，通過攝像采集系統(tǒng)觀察5 min，記錄大鼠的活動量和放入大鼠到大鼠前肢抱起糖丸進食的潛伏時長。

1.5 代謝數(shù)據(jù)采集與處理

樣本制備：從-80℃冰箱中取出糞便樣品，使用電子天平精確稱取糞便樣品50 mg然后移至2 mL的離心管中，加入直徑6 mm的研磨珠研磨，往離心管內加入含0.02 mg·mL-1L-2-氯苯丙氨酸的提取液400μL，將樣品置于冷凍組織研磨儀研磨6 min，在4℃，40 KHz的低溫超聲中提取30 min，將上述結束的樣品于-20℃的條件靜置30 min，然后在4℃，13000 g的離心機中離心15 min，取上清液待上機分析，另外每個樣本各取20μL的上清液，混合均勻后作為質控樣本。

LC-MS分析液相條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d,1.8 μm;Waters,Milford,USA）；流動相A：95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流動相B：47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1%甲酸）；流速為0.40 mL·min-1，進樣量為10 μL，柱溫為40℃。

質譜條件：采用正、負離子模式采集質譜信號，檢測參數(shù)：正、負離子模式下離子源電壓分別為5000 V和4000 V，氣簾氣、噴霧氣和輔助加熱氣分別為30、50 psi和50 psi，質量掃描范圍m/z 50-1000，去簇電壓：80 V，離子源溫度為550℃。

代謝數(shù)據(jù)處理：將采集所得的LC-MS數(shù)據(jù)原始文件導入ProgenesisQI（WatersCorporation，Milford,USA）進行數(shù)據(jù)處理，最終得到含保留時間、質荷比和峰強度等信息的數(shù)據(jù)矩陣。將所得的數(shù)據(jù)進行歸一化處理后可用于篩選差異表達的代謝物。將篩選出的差異代謝物和數(shù)據(jù)庫進行注釋比對，可以獲得對應的代謝通路的代謝物集，通過Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca）進行通路富集分析并利用KEGG在線數(shù)據(jù)庫對差異代謝物所涉及的相關代謝通路進行分析。數(shù)據(jù)分析操作主要在美吉生信云平臺上完成。

1.6 統(tǒng)計分析

動物行為學檢測數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，符合正態(tài)分布及方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 行為學檢測結果

2.1.1 曠場實驗

與對照組相比，模型組在曠場試驗中的直立次數(shù)更少（P＜0.001），中央運動距離減少（P＜0.05）；與假針組相比，電針組在曠場試驗中的直立次數(shù)增加（P＜0.001），中央運動距離增加（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。四組在曠場試驗中的總運動距離沒有統(tǒng)計學差異，但是相較于對照組，模型組的總運動距離降低，相較于假針組，電針組總運動距離增加，結果如圖1所示。

圖1 曠場實驗的總距離（A）、直立次數(shù)(B)和中央距離(C)

2.1.2 強迫游泳

在強迫游泳中，與對照組相比，模型組大鼠不動時間延長（P＜0.001），與假針組相比，電針組在強迫游泳的不動時間縮短（P＜0.001），結果如圖2所示。

2.1.3 新奇抑制攝食

在新奇抑制攝食試驗中,與對照組相比，模型組的潛伏攝食時間增加（P＜0.001）。與假針組相比，電針組的潛在攝食時間減少（P＜0.001）。結果如圖2所示。

圖2 強迫游泳（A）和新奇抑制攝食（B）

2.2 WKY大鼠代謝物質變化

2.2.1 樣本多元統(tǒng)計分析

對電針組、模型組及對照組大鼠的糞便進行了質譜檢測，然后采用PCA（主成分分析）和PLS-DA（偏最小二乘判別分析）統(tǒng)計方法對結果進行識別分析。采用PCA方法對所有樣本的數(shù)據(jù)進行分析，結果見圖3。在正離子和負離子模式下，對照組和模型組均沿PC2軸分開，表明對照組與模型組主成分不同。電針組與對照組、模型組距離均較遠，說明電針的作用在代謝過程中對各組樣本糞便的代謝物組成的影響比較顯著。在利用PLS-DA分析時，結果如圖4所見，對照組、模型組和電針組在正離子和負離子模式下都能明顯的區(qū)分開來。說明三組之間具有明顯的組間差異，代謝產(chǎn)物具有差異。因此，無論是正離子模式還是負離子模式，PCA與PLS-DA方法能很好的區(qū)分各組之間表達差異明顯的代謝物。

圖3 PCA分析：正離子模式（A）和負離子模式（B）

圖4 PLS-DA分析：正離子（A）和負離子（B）

2.2.2 差異代謝物的篩選

為了分析對照組和模型組、模型組和電針組中存在顯著性差異的代謝物，將OPLS-DA（正交偏最小二乘判別分析）分析參數(shù)VIP＞2且單變量統(tǒng)計分析參數(shù)P＜0.05的代謝物作為顯著性差異代謝物。如圖5所示，在前30位顯著差異代謝物中，三組共同變化的代謝產(chǎn)物有7種，分別是甜菜苷、環(huán)己基氨基磺酸酯、10-氫過氧-H4-神經(jīng)前列腺素、15(S)-羥基二十碳三烯酸、地奧司明、2，6-壬烷-1-醇、9-氧代壬酸。其中甜菜苷在模型組中升高，在電針組中降低；環(huán)己基氨基磺酸酯、10-氫過氧-H4-神經(jīng)前列腺素、15(S)-羥基二十碳三烯酸、地奧司明在模型組中降低，在電針組中升高。

圖5 對照組與模型組、模型組和電針組差異代謝物分析

2.2.3 差異代謝通路分析

將得到的顯著性差異代謝物提交至KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）網(wǎng)站用于分析可能參與的代謝途徑。如圖6所示，代謝產(chǎn)物參與的與人類有機系統(tǒng)的通路有3條，主要是消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)；代謝相關的生物過程有9條通路，主要是脂質代謝、氨基酸代謝和生物素降解與代謝等途徑;疾病相關的網(wǎng)絡有3條通路，分別為腫瘤疾病、免疫疾病和感染性疾病。

圖6 差異代謝物的KEGG通路分析

3 討論

本研究通過測定強迫游泳、新奇抑制攝食和曠場實驗行為學改變等指標，評價WKY抑郁大鼠的抑郁狀態(tài)。其中強迫游泳不動時間反映大鼠的絕望狀態(tài)，被廣泛用于評估抑郁大鼠的抑郁樣行為；新奇抑制攝食潛伏時長反映大鼠對食物的欣快感；曠場實驗行為則通常用于評估大鼠在新異環(huán)境中的自主和探究行為。上述行為學檢測都能作為評估抑郁模型成功與否的標準。我們的實驗結果表明，相較于正常對照組，模型組大鼠直立次數(shù)減少，中央距離減少；強迫游泳不動時間延長；新奇抑制攝食潛伏時間增加，證實了WKY大鼠存在抑郁行為。通過3周電針干預后，電針組的直立次數(shù)增加，中央距離增加；強迫游泳不動時間減少；新奇抑制攝食潛伏時間減少。研究結果表明WKY大鼠可作為可靠的抑郁癥模型進行實驗研究，同時電針可以有效改善WKY大鼠的抑郁樣行為。

臨床研究中，電針治療抑郁癥被證實有效的。胡建芳[17]等人通過中藥聯(lián)合針刺百會、四神聰、足三里等穴治療腦卒中后抑郁，在治療4周后發(fā)現(xiàn)患者的漢密爾頓抑郁量表及卒中量表評分降低，腦卒中生存質量量表評分升高；黃娟[18]等在通過針刺百會、神門、太沖、足三里等穴配合音樂療法治療老年性抑郁患者的療效觀察中證明，持續(xù)治療6個療程后有效率達96.67%；肖彬[19]等人在一項觀察針灸配合耳穴治療乳腺癌繼發(fā)抑郁的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，針灸合谷、太沖、百會、足三里、氣海等穴治療有效率為86.7%，明顯高于對照組;于海英[20]等人在研究電針治療首發(fā)抑郁的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，與藥物組相比，針藥組的漢密爾頓抑郁量表總分和各因子得分均有統(tǒng)計學差異，電針可有效改善首發(fā)抑郁癥的臨床癥狀群。綜上，電針治療抑郁癥臨床療效顯著，我們的研究能為臨床提供新的治療方向。

代謝組學的研究思路與中醫(yī)思維的整體觀念是相似的，對認識疾病的發(fā)病過程，指導疾病的治療都有重要意義，也為疾病的研究開拓了的方法[21-22]。研究表明代謝組學技術的模式識別分析（PCA、PLS-DA）指標靈敏性較其它的技術明顯提高[23]，許多動物的行為學和形態(tài)學，甚至有限的生化指標不能表現(xiàn)出差別時，通過運用代謝組學方法既可以將其有效分類，又能夠尋找到與分類有關的特征性差異標志物。通過代謝組學的方法，我們尋找到對照組與模型組存在115種差異代謝物，模型組與電針組存在59種差異代謝物。通過對差異代謝物所參與的KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異代謝產(chǎn)物主要參與了脂質代謝、氨基酸代謝和生物素降解與代謝等途徑，進一步說明電針干預后，抑郁大鼠的代謝產(chǎn)物發(fā)生了改變，影響了脂質代謝、氨基酸代謝和生物素降解與代謝等代謝途徑。

脂質代謝是脂類物質在體內合成、消化與轉運的過程。脂質代謝異常與很多疾病有關，比如阿爾茲海默癥[24]、高血壓腦病[25]、骨關節(jié)炎[26]、抑郁癥[27]等。腦內存在很多特殊的脂類可以直接參與抑郁癥發(fā)病的過程。脂質代謝失調會影響很多遞質傳遞系統(tǒng)，其中和抑郁癥相關的主要包括磷脂代謝通路和大麻素信號通路[28]。有研究表明，脂肪酸及一些代謝物能在腦內特定的區(qū)域內發(fā)揮作用，調節(jié)許多過程，如神經(jīng)傳遞和信號通路，最終影響抑郁行為[29]，n-3多不飽和脂肪酸、甘油三酯和甘油磷脂等脂質的異?？梢哉T導焦慮和抑郁相關行為[30]。長期食用高脂肪飲食會導致非人類靈長類動物后代的血清素系統(tǒng)紊亂導致焦慮和抑郁樣行為增加[31]。

氨基酸代謝紊亂在抑郁癥中已有相關的研究進展，劉史佳[32]等基于抑郁患者的血清代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，抑郁患者血清中的苯丙氨酸、色氨酸等代謝產(chǎn)物發(fā)生顯著變化，呂夢等[33]運用核磁共振氫譜代謝組學技術研究慢性溫和不可預知應激抑郁大鼠糞便樣本，共篩選出10種與抑郁相關的差異氨基酸代謝物，主要涉及丙氨酸代謝、天冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等氨基酸代謝途徑。徐雪嬌等[34]基于血清代謝組學技術探究電針對慢性應激抑郁大鼠代謝產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)電針組的蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸等6種氨基酸發(fā)生變化，主要涉及相對應的氨基酸代謝途徑的改變。劉曉節(jié)等[35]通過代謝組學研究發(fā)現(xiàn)了抑郁癥的發(fā)病可能與能量代謝、氨基酸代謝和神經(jīng)遞質合成有關。張洪財[36]等利用代謝組學技術，探究中藥對抑郁模型血清代謝產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)抑郁模型大鼠中的色氨酸、尿酸、膽酸等代謝產(chǎn)物顯著變化，可能是調控了氧化應激、脂類代謝及氨基酸代謝發(fā)揮抗抑郁作用。

中醫(yī)認為，從陰陽屬性劃分，抑郁癥屬于陰癥，陰病治陽?！鹅`樞·海論》中有“髓海不足，則腦轉耳鳴……”的描述，說明督脈的病癥主要為腦病，腦病可選擇督脈穴位治療?！镀娼?jīng)八脈考》明確指出：“督脈……為陽脈之總督，故曰陽脈之海。”百會為督脈之穴，居顛頂部，督脈為一身陽脈之總督，主一身之陽，是“精髓升降之道路”，為健腦寧心，解郁安神之要穴?！端貑枴ちo大論》中有五氣之木郁、火郁、土郁、金郁、水郁；《景岳全書》有怒郁、思郁、憂郁、驚郁、悲郁、恐郁等情郁。目前也有研究提出“氣郁體質與抑郁狀態(tài)存在相關性”[37]及“脾胃功能障礙導致的氣機失調是抑郁癥的主要病機”[38]。因此治療抑郁癥疏肝健脾和胃也至關重要。針灸常選擇太沖、足三里等穴位配合治療。足三里為足陽明經(jīng)之合穴，足陽明經(jīng)亦為多氣多血之經(jīng)脈，陽明經(jīng)與督脈在頭部交匯，百會配合足三里可以起到整體調節(jié)作用。體現(xiàn)了“調督安神”的治療原則。本課題組長期應用于臨床抑郁癥的治療中[39-41]，可以有效的緩解患者的主癥，改善胃腸不適、焦慮和睡眠障礙等問題。

綜上，本研究通過WKY抑郁大鼠模型，證實了電針能明顯改善抑郁樣行為。同時，利用非靶向代謝組學的方法探究了與抑郁癥相關的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)電針后出現(xiàn)顯著變化的差異代謝產(chǎn)物主要涉及脂質代謝、氨基酸代謝和生物素降解與代謝等代謝途徑。初步揭示了電針的抗抑郁作用，為針灸治療抑郁癥提供了新的研究方向，后續(xù)可以通過更加精確的定量代謝組學方法進一步探究相關代謝通路中的差異代謝物的變化，從而找到電針作用的具體靶點，發(fā)現(xiàn)新的作用機制。