韓運(yùn)祺，王 娜，石佳琦，李文妍，肖云峰，3＊＊

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)處 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價(jià)研究中心 呼和浩特 010110）

心臟疾病目前是對人類生命和健康構(gòu)成威脅的最常見疾病之一，也是大多數(shù)人的主要死亡原因之一[1]。冠心病的病理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血或壞死。臨床治療心肌缺血的主要策略是緩解心絞痛癥狀，恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流。然而，再灌注治療可導(dǎo)致顯著的心肌損傷，這種現(xiàn)象稱心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）[2]。

目前，對MIRI的發(fā)病機(jī)制認(rèn)為與細(xì)胞凋亡、心肌能量代謝障礙、氧自由基爆發(fā)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等有關(guān)[3-5]。然而研究表明，心肌能量代謝障礙又被認(rèn)為是心肌缺血再灌注損傷的始發(fā)環(huán)節(jié)[6]，能量代謝也作為心肌細(xì)胞活動(dòng)的重要參與者[7]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）作為調(diào)節(jié)能量代謝的核心分子，不僅能夠調(diào)節(jié)心臟功能，而且可以影響細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞器功能[8]。AMPK參與了體內(nèi)多種代謝過程的調(diào)節(jié)[9]。因此，通過調(diào)控信號通路來避免心肌細(xì)胞凋亡已被證明是有效的MIRI治療策略[10]。

丁香酚是從丁香或其它含丁香酚芳香油的植物中分離得到的淡黃色稠性油狀液體。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丁香酚具有多種藥理活性主要包括解熱鎮(zhèn)痛、抗炎抗氧化、麻醉、改善學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)?；サ茸饔肹11]。丁香酚保護(hù)心臟的作用被廣泛報(bào)道，但具體機(jī)制并未見詳細(xì)闡述。馬強(qiáng)等[12]報(bào)道指出丁香酚對H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷的影響中表明丁香酚可調(diào)節(jié)氧自由基的清除能力和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而增加SOD活力和減少M(fèi)DA的產(chǎn)生以及LDH的釋放，從而明顯增加受損心肌細(xì)胞的存活率，減少細(xì)胞凋亡，但是其機(jī)制尚未闡述。因此，本研究以丁香酚包合物為研究對象，利用手術(shù)法建立MIRI模型，并基于AMPK能量代謝信號通路，探究丁香酚對MIRI大鼠心肌保護(hù)作用的機(jī)制，為丁香酚的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

丁香酚Eugenol（羅恩試劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，批號：RH206547）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為20150026）；水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為20181217）；SOD、MDA測試盒（南京建成科技有限公司，批號為20210624、20210624）；LDH、CK、CKMB、AST試劑盒（寧波美康生物科技股份有限公司，批號190318102，190420101，190418201，190328201）；β-環(huán)糊精（天津南開允公合成技術(shù)有限公司，批號：20201018）；丁香酚/β-環(huán)糊精包合物（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自己制備，批號：20210824）;BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號080719200403）；鹽酸地爾硫?片（天津田邊制藥有限公司，批號：2007044）TTC染液（南京建成科技有限公司，批號：20200729）；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin美國CST公司,批號13E5）；山羊抗兔二抗（美國abbkine公司，批號ATTAP0801）；抗體AMPK、p-AMPK、GLUT4、cTn1（英國CST公司，批號分別為#2532，#2535，#2213，#13083）；RIPA裂解液（索萊寶科技有限公司，批號20180913）；PMSF（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號112520210223）；臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司，型號3K15）；Thermo-KS12生物安全柜（美國Thermo Fisher公司）；小動(dòng)物呼吸機(jī)（深圳市瑞沃德科技生命有限公司，型號RWD407）；金屬?。ū本┨旄萍加邢薰?，型號OSE-DB-01）；組織研磨儀（北京天根生化科技有限公司，型號SN1002358）；電泳儀（美國Bio-Rad公司，型號Mini Trans-Blot）；Multiskan MK3全 自 動(dòng) 酶 標(biāo) 儀（美 國Thermo Fisher公司）；全自動(dòng)生化分析儀（愛爾蘭Sapphire公司，型號ADS600）；紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司，型號ODYSSEY CLx）

1.2 丁香酚包合物的制備

精密稱取10 g β-環(huán)糊精粉末于250 mL具塞廣口瓶中，加入100 mL蒸餾水，水浴加熱70℃直至完全溶解后溶液呈透明澄清，室溫下降溫，備用。將丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品與無水乙醇按照（1:3）制備成丁香酚無水乙醇溶液充分溶解，備用。將冷卻置室溫的環(huán)糊精溶液置于25℃數(shù)顯攪拌器上，滴加丁香酚無水乙醇溶液，邊加邊攪拌，滴加結(jié)束后置于超聲儀器40 kHz超聲45 min，取出置于4℃冰箱過夜。次日取出后抽濾，得到初始粉末，用適當(dāng)蒸餾水洗滌抽濾，最后用石油醚溶液潤洗抽濾，于真空干燥箱中，40℃烘干8 h，即得丁香酚/β-環(huán)糊精包合物，高效液相色譜法檢測丁香酚包合物的含量為76.2%。

1.3 動(dòng)物、分組和模型制備

清潔級雄性Wistar體重在200-220 g大鼠70只，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（蒙）2020-0001。將70只大鼠隨機(jī)為7組，假手術(shù)組、I/R組、包合物基質(zhì)組、地爾硫?組和丁香酚包合物低劑量組（0.125 g/kg/天）、丁香酚包合物中劑量組（0.25 g/kg/天）、丁香酚包合物高劑量組（0.5 g/kg/天），每組10只?？瞻捉M與模型組灌胃給藥CMCNa，包合物基質(zhì)組灌胃給予環(huán)糊CMC-Na精混液，陽性藥組灌胃給予地爾硫?CMC-Na混懸液，丁香酚包合物低、中、高劑量組分別按0.125 g/kg/天、0.25 g/kg/天、0.5 g/kg/天（含有實(shí)際丁香酚含量95 mg、190.5 mg、381 mg）灌胃給予丁香酚包合物混懸液。各組每天給藥1次，連續(xù)給藥15天，末次給藥1 h后開始建立MIRI模型。手術(shù)法建立MIRI模型，將各組大鼠手術(shù)前12 h禁食不禁水。用碘伏進(jìn)行常規(guī)消毒，備皮，連接心電圖儀器，氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，頻率為60次/min，在左側(cè)心臟搏動(dòng)處往左稍偏切開一2 cm的縱行切口，分離肌肉組織后剪斷第3-4根肋骨，暴露心臟，在心臟冠狀動(dòng)脈左前降支，用7-0號線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈的前降支30 min，然后恢復(fù)再灌注24 h從內(nèi)向外逐層縫合，并記錄再灌注即刻心電圖。再灌注24 h后取材心臟，記錄再灌注24 h后心電圖。假手術(shù)組開胸后，在冠脈左前降支處僅穿線不結(jié)扎。

1.4 全自動(dòng)生化分析儀法檢測大鼠血清中LDH、CK、CK-MB、AST含量

建模成功后，再灌注24 h，各組大鼠腹主動(dòng)脈取血，采血管靜置30 min。離心機(jī)參數(shù)設(shè)置為3500 r·min-1，離心10 min吸取血清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測LDH、CK、CK-MB、AST的活力。

1.5 TBA、WST-1法檢測心肌組織中MDA、SOD含量

再灌注24 h后，手術(shù)取出的心臟組織迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，清洗組織血跡。心肌組織按質(zhì)量體積比1:9加生理鹽水剪碎，在低溫研磨，離心機(jī)以3000 r·min-1，離心10 min，取上清即得勻漿液。BCA檢測各組樣品蛋白濃度。之后按照相關(guān)試劑盒操作說明書酶標(biāo)儀測定心肌組織中SOD、MDA的活力。

1.6 采用Western blotting法檢測大鼠心肌組織中p-AMPK/AMPK、GLUT4、cTn1蛋白表達(dá)水平

Western blotting檢測AMPK信號通路相關(guān)基因（AMPK、p-AMPK）和心肌相關(guān)基因（cTn1）的表達(dá)。將建模成功后，取缺血的心臟組織置于預(yù)冷的生理鹽水中進(jìn)行清洗，待組織清洗置無血跡，濾紙吸去附著于組織上的生理鹽水，將組織剪成1-3 mm的碎塊。稱量組織，按組織：裂解液=1:10使用低溫組織研磨儀器進(jìn)行組織勻漿，充分研磨觀察至無明顯組織塊，放置30 min，4℃離心，12000 rpm·min-1，10 min，吸取上清即得組織蛋白提取液，按照BCA試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白上樣量為每孔20μg，與5×loading buffer緩沖液混合、上樣、轉(zhuǎn)置PVDF膜上、封閉液封閉，分別將轉(zhuǎn)膜成功的PVDF膜放于p-AMPK/AMPK、GLUT4、cTn1一抗溶液中（一抗按照1:1000稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min重復(fù)三次，放入熒光二抗中（二抗按照1:1000稀釋）室溫避光孵育1 h。TBST洗膜重復(fù)三次，TBS洗膜一次，每次10 min。置于紅外成像系統(tǒng)掃描并采集條帶照片，Image-J軟件分析目標(biāo)條帶并獲得灰度值，各組條帶與β-actin的比值作為蛋白相對表達(dá)量。

1.7 采用TTC染色法檢測MIRI大鼠心肌梗死面積

心肌缺血再灌注24 h之后，空白組、包合物基質(zhì)組、陽性藥對照組、丁香酚包合物低、中、高劑量組各組選兩只建模成功的大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液（注射劑量為0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，麻醉后用手術(shù)剪慢慢地剪開大鼠的胸腔，剝離其心肌組織，用剪刀將心臟剪下并用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈，立刻置于-80℃冰箱中冷凍5 min，將冷凍后的心臟切成約1-2 mm的薄片，置于預(yù)熱37℃的1%的TTC染液中，孵育15 min后，取出心臟用相機(jī)拍下并作相關(guān)記錄，用IMAGE pro plus進(jìn)行圖像處理，分析并計(jì)算心肌梗死面積。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心電信號檢測結(jié)果

當(dāng)心臟發(fā)生缺血時(shí)心電信號常伴有異常性特征，例如在ST段的形態(tài)變化，T波的幅值變化，心率及其變異性的變化等[13]。心電結(jié)果表明，大鼠進(jìn)行心肌缺血再灌注手術(shù)后ST段明顯抬高，顯示大鼠心肌發(fā)生缺血損傷樣改變，表明心肌缺血模型建立成功（圖1）。

圖1 大鼠造模不同時(shí)間點(diǎn)心電圖變化

2.2 丁香酚包合物對MIRI大鼠血清中LDH、CK、CKMB、AST含量的影響

與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB、AST活力均有顯著提高（P＜0.01）。與I/R組比較，各組丁香酚包合物血清中LDH、CK、CK-MB、AST活力呈劑量依賴性降低（P＜0.01）。包合物基質(zhì)組對心肌四種酶水平?jīng)]有影響（表1）。

表1 丁香酚包合物對心肌缺血再灌注損傷后LDH、CK、CK-MB和AST水平的影響（xˉ±s，n=8）

2.3 丁香酚包合物對MIRI大鼠心肌組織中MDA、SOD含量的檢測

與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠組織中心肌酶MDA活性升高（P＜0.01），SOD活性降低（P＜0.01）；與模型組比較，丁香酚包合物呈劑量依賴性的降低組織中MDA水平（P＜0.01），升高SOD水平（P＜0.01），陽性藥組降低組織中MDA水平（P＜0.01），升高SOD水平（P＜0.01），包合物基質(zhì)組對心肌二種酶水平?jīng)]有影響，說明丁香酚包合物對心肌損傷具有保護(hù)作用（表2）。

表2 丁香酚包合物對心肌缺血再灌注損傷后MDA和SOD水平的影響

2.4 丁香酚包合物對MIRI大鼠心肌組織p-AMPK/AMPK、GLUT4、cTn1表達(dá)的影響

結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組、包合物基質(zhì)組心肌組織中P-AMPK/AMPK，表達(dá)水平均有顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，不同濃度丁香酚包合物組心肌組織中P-AMPK/AMPK表達(dá)水平降低，其中以丁香酚包合物高劑量表達(dá)減少明顯，其差異具有顯著性（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、包合物基質(zhì)組的cTn1的表達(dá)水平升高，其差異具有顯著性（P＜0.01），表明心肌組織受到損傷，模型建立成功。與模型組相比，經(jīng)不同濃度的丁香酚包合物預(yù)處理后的cTn1的表達(dá)降低（P＜0.01），且具有劑量依賴性；與假手術(shù)組相比，模型組、包合物基質(zhì)組GLUT4蛋白表達(dá)明顯減少，其差異具有顯著性（P＜0.01），丁香酚包合物低、中、高劑量組GLUT4蛋白表達(dá)水平明顯升高，其差異具有顯著性（P＜0.01）。表明丁香酚能夠?qū)π募∪毖俟嘧p傷具有與保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2、表3。

圖2 丁香酚包合物對MIRI大鼠心肌組織P-AMPK/AMPK、GLUT4和cTn1蛋白表達(dá)的影響

表3 丁香酚包合物對MIRI大鼠心肌組織P-AMPK/AMPK、GLUT4和cTn1蛋白表達(dá)的影響（xˉ±s，n=3）

2.5 丁香酚包合物對MIRI大鼠心肌梗死面積的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組心肌出現(xiàn)梗死癥狀；與模型組相比，丁香酚包合物低、中、高劑量組出現(xiàn)的心肌梗死癥狀均有改善，其中丁香酚包合物高劑量組的心肌梗死面積與模型組相比差異明顯（P＜0.01）；地爾硫?組可減少心肌缺血導(dǎo)致的心肌梗死面積。說明丁香酚包合物對心肌缺血再灌注所引起的心肌梗死癥狀有緩解作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

3 討論

大量數(shù)據(jù)表明心血管疾病已經(jīng)成為危害人類生命健康、生活質(zhì)量甚至死亡的主要原因之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2019全球健康預(yù)測》概要表明，心血管現(xiàn)患病人數(shù)以及死亡率居首位，占由疾病構(gòu)成死亡人數(shù)的40%以上[14]。由于近年來對丁香酚藥理作用的深入研究，其抗氧化作用受到重視。有研究表明，丁香酚可通過調(diào)節(jié)各項(xiàng)生化指標(biāo)來緩解連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）導(dǎo)致的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型[15]。因此本課題以心肌缺血再灌注為模型，探討丁香酚對缺血、缺氧后能量代謝信號通路AMPK的影響。

圖4 丁香酚包合物對大鼠心肌的TTC染色結(jié)果

丁香酚為天然的藥物，作為揮發(fā)油類物質(zhì)現(xiàn)多見于臨床應(yīng)用，但是由于丁香酚具有揮發(fā)性和不穩(wěn)定性，不利于保存且對腸道存在刺激作用[16]。β-環(huán)糊精具有特殊的空間結(jié)構(gòu)，常作為藥用輔料使用，不僅可以提高藥物生物利用度而且可掩蓋丁香酚的不良?xì)馕禰17]。所以本課題組將丁香酚制成β-環(huán)糊精包合物供體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用不僅可減少丁香酚的腸道刺激作用而且將丁香酚液體藥物固體化利于保存。Xiaowei Sun等人研究表明[18]，100 mg的丁香酚可緩解腦缺血再灌注損傷后P-mTOR/mTOR的表達(dá)，因此本研究以心肌缺血再灌注損傷為研究對象，探討丁香酚對MIRI的作用是否與能量代謝通路AMPK有關(guān)，并以100 mg丁香酚作為研究劑量。本研究以地爾硫?作為陽性對照藥是因?yàn)樵谇捌谘芯恐袆⒂19]等人得出結(jié)論地爾硫?可通過減少炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的浸潤起到心臟的保護(hù)作用，并且Chunxia Chen[20]等人研究證明地爾硫?可減少心肌梗死面積和心律失常，并降低氧化應(yīng)激，衰減鈣超載，降低了Bax蛋白的表達(dá)，并相應(yīng)增加了Bcl-2與Bax的比率，抑制凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支30 mim，再灌注24 h發(fā)現(xiàn)可使大鼠心電信號S-T段抬高，說明大鼠MIRI模型建立成功，但是結(jié)扎即刻時(shí)心電信號顯示出不明顯的P波和T波，得知P波是由心房除極化活動(dòng)而產(chǎn)生，文中出現(xiàn)情況課題組考慮心房除極化活動(dòng)產(chǎn)生P波，但是該P(yáng)波與其前面發(fā)生的波形的位置發(fā)生重疊，因而導(dǎo)致P波消失。以往的研究中發(fā)現(xiàn)臨床上心肌缺血是一個(gè)發(fā)展較慢的過程而ST-T段的變化T波由直立至倒置、ST段由平直延伸至ST段壓低，易與非冠脈病的ST-T改變混淆在一起[21]。模型建立成功后各給藥組與MIRI模型組比較，丁香酚包合物低、中、高劑量組均能夠不同程度降低大鼠血清中CK、CK-MB、LDH和AST的活力，并且呈劑量依賴性。SOD是體內(nèi)氧自由基清除系統(tǒng)的主要酶，MDA作為反應(yīng)自由基對機(jī)體損傷程度的重要指標(biāo)也在缺氧復(fù)氧時(shí)起到重要作用[22]。本研究結(jié)果表明，不同濃度的丁香酚包合物可減少M(fèi)IRI大鼠心肌組織中MDA的水平，提高SOD水平。因此證明，丁香酚包合物對MIRI起到保護(hù)作用。

辛銘秀[23],研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷可通過調(diào)節(jié)能量代謝通路AMPK來起到保護(hù)作用。當(dāng)細(xì)胞或動(dòng)物出現(xiàn)缺血或者缺氧時(shí)AMPK信號通路被高度激活，這表明AMPK信號通路對MIRI具有重要的意義[24-25]。AMPK作為能量代謝的重要信號通路，參與多種能量代謝調(diào)節(jié)的過程，相關(guān)研究顯示，心肌缺血再灌注后處于應(yīng)激狀態(tài)的心肌細(xì)胞由于供氧的缺乏，使得ATP產(chǎn)成不足進(jìn)而AMP含量增加，從而使AMPK被磷酸化激活[26]。被激活的AMPK（即p-AMPK）對下游多種底物產(chǎn)生作用，其中最主要包括抑制了ATP的消耗，并重新將ATP的產(chǎn)生途徑激活以維持機(jī)體能量代謝平衡。PGC-1α作為調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性的重要物質(zhì)，不僅能減少M(fèi)DA+及活性氧（ROS）的含量，而且還能發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而達(dá)到保護(hù)心肌缺血性損傷的作用[27-28]。然而被磷酸化活化的AMPK則可進(jìn)一步影響下游PGC-1α的表達(dá)。心肌肌鈣蛋白I，是心肌損傷的重要標(biāo)示物，在血清中含量極少，但是在心肌梗死時(shí)含量明顯升高[29]。另外本實(shí)驗(yàn)證明，與MIRI模型組相比，經(jīng)過丁香酚包合物處理后P-AMPK/AMPK、cTn1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，并且呈劑量依賴性。TTC染色顯示心肌梗死面積減少。因此，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丁香酚包合物可減輕MIRI的作用與抑制磷酸化AMPK相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)將揮發(fā)性、不穩(wěn)定性藥物丁香酚經(jīng)過β-環(huán)糊精包合后增加藥物穩(wěn)定性，供體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用。實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論經(jīng)過丁香酚包合物處理后大鼠MIRI得到緩解，其機(jī)制可能與有效抑制磷酸化的AMPK蛋白表達(dá)和心肌肌鈣蛋白cTn1的表達(dá)有關(guān)。研究結(jié)果有望為丁香酚減輕MIRI的治療及機(jī)制研究提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。