劉 芳，蘇 慧，尹文娟，王麗燕，孫金生

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

甲殼動(dòng)物像其他無脊椎動(dòng)物一樣缺乏獲得性免疫（acquired or adaptive immunity）系統(tǒng)，僅擁有天然免疫（innate immunity）系統(tǒng).各種血細(xì)胞通過吞噬、包囊、結(jié)節(jié)、黑化以及分泌免疫活性分子等反應(yīng)在整個(gè)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1].甲殼動(dòng)物的血細(xì)胞通?？煞譃轭w粒細(xì)胞（granular cells，GC）、半顆粒細(xì)胞（semigranular cells，SGC）和透明細(xì)胞（hyaline cells，HC）[2].根據(jù)胞質(zhì)顆粒的大小、數(shù)量、遮光性和特定的核質(zhì)比等特征，一些甲殼動(dòng)物如格魯西東歐螯蝦、鋸緣青蟹和中華絨螯蟹等的血細(xì)胞又進(jìn)一步分為透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、中顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞[3-4]，它們都在機(jī)體固定或破壞外來微生物過程中起著關(guān)鍵作用[1].甲殼動(dòng)物生存環(huán)境復(fù)雜，經(jīng)常面對外界環(huán)境壓力、病原感染、爭斗以及蛻皮等生理過程，其血細(xì)胞數(shù)量和組成常會(huì)發(fā)生急劇變化，機(jī)體需不斷造血以更新和補(bǔ)充損耗的血細(xì)胞，因此，活躍的造血機(jī)能對甲殼動(dòng)物來說尤為重要[5].由造血干細(xì)胞產(chǎn)生成熟血細(xì)胞并釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的過程就是造血過程，造血過程生成形態(tài)各異的血細(xì)胞，構(gòu)成了甲殼動(dòng)物免疫的核心和基礎(chǔ).了解造血過程中血細(xì)胞的產(chǎn)生、分化和免疫功能是探究甲殼動(dòng)物免疫防御機(jī)制的前提和關(guān)鍵.甲殼動(dòng)物血細(xì)胞主要是由造血組織（hemopoietic tissue，HPT）分化產(chǎn)生[6]，研究者根據(jù)造血組織中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征如細(xì)胞大小、胞質(zhì)顆粒以及細(xì)胞器發(fā)育情況等，對其進(jìn)行了初步分類，主要包括4～5種不同的細(xì)胞類型[2，7].Van de Braak等[2]發(fā)現(xiàn)對蝦的造血組織中有4種主要的細(xì)胞類型：1型細(xì)胞為前體細(xì)胞，可進(jìn)一步分化為2型（未成熟SGC）和3型（未成熟GC）細(xì)胞，4型細(xì)胞為間質(zhì)細(xì)胞，1～3型細(xì)胞均可分裂.為更清楚地了解血細(xì)胞在造血組織中是如何分化產(chǎn)生的，研究人員嘗試尋找不同發(fā)育階段血細(xì)胞的特異標(biāo)志物來鑒定甲殼動(dòng)物的造血組織和血細(xì)胞譜系.近年來有研究者依據(jù)血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分類，從mRNA和蛋白水平對相應(yīng)的分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得了一些在不同血細(xì)胞中特異性表達(dá)的標(biāo)記分子，為研究甲殼動(dòng)物血細(xì)胞的功能分型奠定了基礎(chǔ)[8]，但這些標(biāo)記分子與血細(xì)胞分化過程中造血組織細(xì)胞的對應(yīng)關(guān)系以及在不同甲殼動(dòng)物中的適用性還有待進(jìn)一步研究.因此，同果蠅和其他模式動(dòng)物相比，甲殼類動(dòng)物的研究由于缺乏明確的遺傳和分子標(biāo)記而受到阻礙.

紅螯光殼螯蝦（Cherax quadricarinatus）隸屬甲殼動(dòng)物亞門（Crustacea）軟甲綱（Malacostraca）十足目（Decapoda）擬螯蝦科（Parastacidae）滑螯蝦屬（Cherax），原產(chǎn)于澳大利亞北部，又名澳洲淡水龍蝦，是一種適應(yīng)性極強(qiáng)的淡水蝦種[9]，其造血組織位于胃背側(cè)，呈半透明薄膜狀，整體由許多卵形小葉構(gòu)成，每個(gè)卵形小葉均由結(jié)締組織環(huán)繞構(gòu)成[10].本研究對失血刺激后紅螯光殼螯蝦造血組織細(xì)胞的增殖變化進(jìn)行觀察，利用流式細(xì)胞技術(shù)對失血和脂多糖（LPS）刺激后的螯蝦血細(xì)胞組成變化進(jìn)行研究，分析了紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞的可能生成過程，研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示甲殼動(dòng)物的造血作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為無脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

紅螯光殼螯蝦購自蘇州傲龍生態(tài)水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體質(zhì)量為（73.4±10.2）g，體長為（10.0±2.3）cm.實(shí)驗(yàn)前將螯蝦置于深缸內(nèi)暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖溫度為25℃，24 h連續(xù)充氣，每天喂食1次，使其適應(yīng)新環(huán)境.

固定液（4%多聚甲醛）、甘氨酸，生工生物工程（上海）股份有限公司；LPS，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；Cell-Light EdU Apollo488 In Vitro Kit、EdU檢測試劑盒，廣州銳博生物技術(shù)有限公司.磷酸緩沖液（CPBS）[11]：10 mmol/L Na2HPO4、10 mmol/L KH2PO4、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L CaCl2、10 mmol/L MnCl2、2.7 mmol/L KCl，pH值為6.8.抗凝劑：29.6 mmol/L檸檬酸鈉、167.7 mmol/L NaCl、100 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L檸檬酸、10 mmol/L EDTA（Na2），pH值為7.2.所有試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 失血刺激下紅螯光殼螯蝦造血組織的細(xì)胞增殖

隨機(jī)選取健康且活力較好的紅螯光殼螯蝦18只，9只為對照組，9只為實(shí)驗(yàn)組.向?qū)φ战M螯蝦的腹節(jié)注射150 μL 0.3 mg/mL的EdU（參考Cell-Light EdU Apollo488 In Vitro Kit使用說明）.實(shí)驗(yàn)組中，先用含2 mL預(yù)冷抗凝劑的注射器從每只螯蝦第2腹節(jié)的腹側(cè)血腔中抽血2 mL，之后注射EdU.在處理后的6、12、24 h，分別從對照組和實(shí)驗(yàn)組取3只螯蝦獲取其造血組織，參照文獻(xiàn)[5]中的方法分離螯蝦造血組織細(xì)胞，將細(xì)胞按照1×106個(gè)/孔的密度平鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用Cell-Light EdU Apollo488 In Vitro Kit試劑盒進(jìn)行染色，置于熒光顯微鏡下觀察.

1.2.2 紅螯光殼螯蝦的血細(xì)胞再生標(biāo)記

取3只健康、活力較好的紅螯光殼螯蝦，注射150μL 0.3 mg/mL的EdU于腹節(jié)，每隔3 d補(bǔ)充注射EdU.分別在注射后2、4、6、8 d時(shí)抽血1.5 mL，置于等量的4%多聚甲醛中固定30 min，在4℃、3 000 r/min條件下離心5min，收集血淋巴細(xì)胞，利用Cell-LightEdUApollo488 In Vitro Kit試劑盒對其進(jìn)行染色，并在顯微鏡下觀察.

1.2.3 失血刺激下紅螯光殼螯蝦血淋巴細(xì)胞的變化

取12只健康的紅螯光殼螯蝦，分別抽血1 mL.在抽血0、12、24、36 h后分別取3只螯蝦，各抽取血淋巴2 mL，于4%多聚甲醛中固定10 min，后懸于CPBS中，利用流式細(xì)胞儀（FlowSight多維全景分析儀，美國Merck Millipore公司）檢測各時(shí)間點(diǎn)各類型血細(xì)胞的變化情況.

1.2.4 LPS刺激下紅螯光殼螯蝦血淋巴細(xì)胞的變化

取18只健康的紅螯光殼螯蝦，9只為對照組，9只為實(shí)驗(yàn)組.對照組中每只螯蝦分別注射100μLCPBS，實(shí)驗(yàn)組中每只螯蝦分別注射100 μL 1 mg/mL的LPS.在對照組和實(shí)驗(yàn)組螯蝦注射12、24、36 h后，分別各取3只螯蝦，每只螯蝦抽取血淋巴2 mL，在4%多聚甲醛中固定10 min，后懸于CPBS中，利用流式細(xì)胞儀檢測各時(shí)間點(diǎn)各類型血細(xì)胞的變化情況.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用IDEAS Application軟件處理和分析各類型血細(xì)胞的變化情況，利用SPSS軟件對差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 失血刺激對造血組織細(xì)胞增殖的影響

利用EdU對紅螯光殼螯蝦造血組織細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1和表1所示.

圖1 失血刺激后紅螯光殼螯蝦造血組織細(xì)胞的EdU標(biāo)記情況Fig.1 EdU labeling of hemopoietic tissue cells of C.quadricarinatus after exsanguination stimulation

由圖1和表1可以看出，在失血處理后的6、12和24 h，無論失血與否，紅螯光殼螯蝦造血組織細(xì)胞都處于活躍的增殖狀態(tài)，無明顯增殖差異，說明正常情況下造血組織始終處于活躍的分裂狀態(tài).

表1 失血刺激后紅螯光殼螯蝦造血組織細(xì)胞增殖的比例Tab.1 Proliferation proportion of hemopoietic tissue cells of C.quadricarinatusafterexsanguination stimulation %

2.2 失血刺激對血淋巴細(xì)胞的影響

2.2.1 紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞的再生

用EdU標(biāo)記紅螯光殼螯蝦后，每隔2 d抽血1.5 mL，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示.從圖2可以看出，在第6天時(shí)，血細(xì)胞中出現(xiàn)被EdU標(biāo)記的新生血細(xì)胞；第8天時(shí)被標(biāo)記的血細(xì)胞數(shù)目增多，且被標(biāo)記的新生血細(xì)胞較其他血細(xì)胞體積小，核質(zhì)比高，大多呈圓形.

圖2 失血刺激后紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞的EdU標(biāo)記情況Fig.2 EdU labeling of hemocytes regeneration of C.quadricarinatus after exsanguination stimulation

2.2.2 失血刺激對血淋巴細(xì)胞比例的影響

利用流式細(xì)胞儀對紅螯光殼螯蝦血淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測分析，根據(jù)側(cè)向散射值可將血細(xì)胞分為4類：透明細(xì)胞（R4）、小顆粒細(xì)胞（R5）、中顆粒細(xì)胞（R6）以及大顆粒細(xì)胞（R7），如圖3所示.失血刺激后各類血細(xì)胞比例如表2所示.由表2可知，失血刺激12 h后，透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞的比例明顯升高，而中顆粒和大顆粒細(xì)胞的比例明顯降低；至24 h時(shí)，各類血細(xì)胞的比例基本恢復(fù)至正常水平.

表2 失血刺激后各類血細(xì)胞的比例Tab.2 Proportion of four types of hemocytes after exsanguination stimulation %

圖3 紅螯光殼螯蝦各類血細(xì)胞圖像流式分類分析Fig.3 Classification of all kinds of hemocytes in C.quadricarinatus by imaging flow cytometry

運(yùn)用流式細(xì)胞儀所得數(shù)據(jù)對紅螯光殼螯蝦的各類型血淋巴細(xì)胞大小進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示.由圖4可以看出，透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞主要分布在300～400 μm2之間，中顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞主要分布在400～500 μm2之間.將各類細(xì)胞按200～300、300～400、400～500和500～600 μm2分為Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類和Ⅳ類，失血刺激后各類細(xì)胞所占比例的變化如表3所示.

表3 失血刺激后各類型血細(xì)胞中不同大小細(xì)胞的比例Tab.3 Proportion of hemocytes with different size in four types of hemocytes after exsanguination simulation %

由表3可知，失血12 h時(shí)，透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞中Ⅰ類細(xì)胞的比例顯著增加，透明細(xì)胞中Ⅲ類和Ⅳ類細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞中Ⅲ類細(xì)胞的比例顯著下降，中顆粒細(xì)胞中Ⅲ類細(xì)胞的比例在失血12和36 h時(shí)顯著下降.

2.3 LPS刺激對血淋巴細(xì)胞比例的影響

模擬病原刺激對紅螯光殼螯蝦進(jìn)行LPS刺激后，利用流式細(xì)胞儀對血淋巴細(xì)胞的比例進(jìn)行檢測分析，結(jié)果如表4所示.

表4 LPS刺激后各類型血細(xì)胞的比例Tab.4 Proportion of hemocytes in four types of hemocytes after LPS stimulation %

由表4可知，LPS刺激36 h時(shí)，小顆粒細(xì)胞的比例顯著升高；大顆粒細(xì)胞的比例在LPS刺激24和36 h時(shí)顯著降低.進(jìn)一步對各類型細(xì)胞中不同大小細(xì)胞的比例進(jìn)行分析，結(jié)果如表5所示.

表5 LPS刺激后各類型血細(xì)胞中不同大小細(xì)胞的比例Tab.5 Proportion of hemocytes with different size in four types of hemocytes after LPS stimulation%

由表5可知，在LPS刺激12 h時(shí)透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞中Ⅱ類細(xì)胞的比例均顯著下降，而透明細(xì)胞中Ⅲ類細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞中Ⅳ類細(xì)胞的比例顯著升高.至24 h時(shí)，透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞中Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)胞的比例都在LPS刺激后顯著升高，而透明細(xì)胞中Ⅲ類細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞中Ⅲ類與Ⅳ類細(xì)胞的比例均顯著下降.中顆粒細(xì)胞中Ⅱ類細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞中Ⅱ、Ⅲ類細(xì)胞的比例也在LPS刺激24 h時(shí)顯著上升，大顆粒細(xì)胞中Ⅳ類細(xì)胞的比例在LPS刺激24 h和36 h時(shí)顯著下降.

3 討論

血細(xì)胞是甲殼動(dòng)物的主要免疫細(xì)胞，由造血組織產(chǎn)生.紅螯光殼螯蝦的造血組織由造血干細(xì)胞、原血細(xì)胞以及一些接近成熟的血細(xì)胞構(gòu)成[10，12].為了維持免疫系統(tǒng)功能，甲殼動(dòng)物整個(gè)生命周期都需要連續(xù)且成比例地補(bǔ)充形成新的血細(xì)胞[13]，因此新生血細(xì)胞的產(chǎn)生、分化與釋放對于甲殼動(dòng)物免疫防御具有重要意義.BrdU和EdU法常用于細(xì)胞增殖檢測，可測出S期細(xì)胞的比例[10]，而病原刺激易導(dǎo)致機(jī)體血細(xì)胞總數(shù)顯著降低[11，14]，并刺激造血組織細(xì)胞分裂以及釋放血細(xì)胞.為了探討紅螯光殼螯蝦造血組織在血細(xì)胞生成過程中的細(xì)胞增殖活性變化，本研究利用EdU法對失血刺激下紅螯光殼螯蝦造血組織細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在失血刺激6～24 h時(shí)，無論失血與否，螯蝦造血組織細(xì)胞都處于活躍的增殖狀態(tài)，無明顯增殖差異，說明正常情況下的紅螯光殼螯蝦造血組織始終處于活躍的分裂狀態(tài)，維持正常的造血功能.對失血的紅螯光殼螯蝦新生血細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)標(biāo)記，在失血刺激6 d后發(fā)現(xiàn)，螯蝦血淋巴中出現(xiàn)的EdU標(biāo)記的新生血細(xì)胞較其他成熟血細(xì)胞小且圓.這些較小的血細(xì)胞在其他十足類動(dòng)物，如小龍蝦（Homarus americanus）和蜘蛛蟹（Hyas araneus）的循環(huán)血細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)，它們具有體積較小、球形、高核質(zhì)比的特征[15-16].由于這些血細(xì)胞體積小且未明顯分化，具有未成熟細(xì)胞的典型形態(tài)特征，因此Van de Braak等[2]和Wu等[8]認(rèn)為它們是前血細(xì)胞.

血細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)對所有生物的健康至關(guān)重要，當(dāng)甲殼動(dòng)物受到外傷或者外來微生物入侵時(shí)，血細(xì)胞會(huì)發(fā)揮免疫功能，導(dǎo)致循環(huán)血淋巴細(xì)胞數(shù)目下降，從而啟動(dòng)造血過程.本研究模擬紅螯光殼螯蝦自然生存面臨的失血和感染危機(jī)，分別對其進(jìn)行失血和LPS刺激，利用流式細(xì)胞儀對血細(xì)胞的類型及大小變化進(jìn)行分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，失血刺激12 h時(shí)，透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞增多，而中顆粒和大顆粒細(xì)胞減少.鑒于本研究利用EdU標(biāo)記發(fā)現(xiàn)的新生血細(xì)胞形態(tài)較小，為深入分析各種血細(xì)胞的形成過程，進(jìn)一步將各類型血細(xì)胞按大小分為Ⅰ類（200～300 μm2）、Ⅱ類（300～400 μm2）、Ⅲ類（400～500 μm2）和Ⅳ類（500～600 μm2），發(fā)現(xiàn)透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞主要為Ⅱ類細(xì)胞，分布在300～400 μm2之間，中顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞主要為Ⅲ類細(xì)胞，分布在400～500 μm2之間.隨著血細(xì)胞顆粒性的增加，細(xì)胞逐漸增大，同一類群不同細(xì)胞大小的差異暗示了血細(xì)胞在血淋巴中存在“成長”.失血刺激12 h時(shí)，發(fā)現(xiàn)透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞的增加主要由各自的Ⅰ類細(xì)胞比例顯著增加造成，推測失血后螯蝦啟動(dòng)造血過程可能最先產(chǎn)生釋放的為此類較小的前血細(xì)胞，在血淋巴循環(huán)系統(tǒng)中可進(jìn)一步分化形成較大的成熟血細(xì)胞.這與Li等[17]報(bào)道的螯蝦成熟血細(xì)胞的形成模式比較類似，即由造血組織細(xì)胞產(chǎn)生的前血細(xì)胞在造血組織中分化產(chǎn)生，未成熟的血細(xì)胞從造血組織中釋放出來后，在循環(huán)系統(tǒng)中經(jīng)過1～3個(gè)月的時(shí)間分化成熟，循環(huán)血細(xì)胞中的半顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞可能代表血細(xì)胞的不同發(fā)育階段.另有一些原始甲殼類動(dòng)物在血液循環(huán)中有血細(xì)胞分裂的現(xiàn)象，但這種現(xiàn)象在較高級的甲殼類動(dòng)物中比較少見[18]，因此，循環(huán)系統(tǒng)中的S期血細(xì)胞反映了未成熟血細(xì)胞或原血細(xì)胞的過早釋放[16，19].蜘蛛蟹（Hyas araneus）的反復(fù)出血也會(huì)出現(xiàn)類似未成熟血細(xì)胞的產(chǎn)生，這些細(xì)胞被鑒定為原血細(xì)胞，在血淋巴丟失后被誘導(dǎo)釋放[16].Van de Braak等[2]認(rèn)為對蝦造血組織中的2、3型細(xì)胞與傳統(tǒng)意義上循環(huán)血淋巴中的透明血細(xì)胞類似，推測2、3型細(xì)胞以透明細(xì)胞的形式釋放到循環(huán)血淋巴后，成熟為SGC和GC.

病原侵染引起的血細(xì)胞免疫反應(yīng)是造成甲殼動(dòng)物大量血細(xì)胞損失的另一重要因素[20].中顆粒和大顆粒細(xì)胞在參與免疫過程中，通常會(huì)伴隨著脫顆粒破裂而釋放一些酶類，如酚氧化酶、酸性磷酸酶、溶菌酶等，可以直接殺滅外來病原菌[21]，這種細(xì)胞特性導(dǎo)致感染早期中顆粒和大顆粒細(xì)胞數(shù)量急劇減少.血細(xì)胞的恢復(fù)最終主要依賴于潛在造血組織不斷地產(chǎn)生血細(xì)胞，維持循環(huán)中的血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[22].本研究對紅螯光殼螯蝦進(jìn)行LPS刺激以模擬病原刺激，發(fā)現(xiàn)LPS刺激36 h時(shí)，小顆粒細(xì)胞的比例顯著升高，大顆粒細(xì)胞的比例顯著下降.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LPS刺激12 h時(shí)，透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞中的Ⅱ類細(xì)胞比例明顯下降，至24 h時(shí)Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)胞比例開始顯著升高.由此認(rèn)為，LPS刺激與失血刺激對螯蝦血細(xì)胞類群產(chǎn)生的影響不同，可能通過不同方式作用于血細(xì)胞的生成以及成熟.Hammond等[23]對梭子蟹進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)LPS注射液可以誘導(dǎo)血細(xì)胞釋放進(jìn)入S期循環(huán).Van de Braak等[2]發(fā)現(xiàn)LPS刺激和重復(fù)出血可促進(jìn)對蝦血淋巴細(xì)胞的釋放.Zhou等[24]研究發(fā)現(xiàn)，擬穴青蟹在溶藻弧菌和Poly（I∶C）的刺激下，透明細(xì)胞的比例顯著升高，細(xì)菌攻毒組48 h和病毒攻毒組24 h、96 h時(shí)半顆粒細(xì)胞的比例顯著下降，推測不同病原刺激會(huì)引起不同血細(xì)胞類群的變化，可能跟各血細(xì)胞類群在防御不同病原體感染方面發(fā)揮著不同作用有關(guān).

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)紅螯光殼螯蝦造血組織細(xì)胞無論失血與否一直處于活躍的增殖狀態(tài)；中顆粒和大顆粒細(xì)胞的體積比透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞的體積大，同種類型血細(xì)胞體積也存在差異，表明螯蝦血細(xì)胞在血淋巴中可能存在由小到大的“成長”.失血刺激12 h時(shí)發(fā)現(xiàn)有較小的新生血細(xì)胞釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，推測為前血細(xì)胞.LPS刺激12 h時(shí)發(fā)現(xiàn)，透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞中Ⅱ類細(xì)胞的比例顯著下降；至24 h時(shí)，Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)胞比例開始顯著增多.由此可知，失血刺激和LPS刺激對血細(xì)胞生成具有不同的促進(jìn)作用，可能通過不同的作用方式調(diào)控造血.這些結(jié)果為甲殼動(dòng)物血細(xì)胞生成及其他相關(guān)研究提供了一定的理論依據(jù).