劉瑋煒，邵仲柏，陳 超，吳玉宇，蘇子欽，梁馨文，高田田，邱 敏，郭 雷

(江蘇海洋大學(xué) a.藥學(xué)院；b.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；d.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005)

目前我國水產(chǎn)生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，由于其具有集約化程度高、規(guī)模大、密度高等特點(diǎn)，易導(dǎo)致弧菌病爆發(fā)頻率的逐步提升、傳播速度的不斷加快，嚴(yán)重影響了水產(chǎn)生態(tài)養(yǎng)殖的進(jìn)一步發(fā)展[1-2].弧菌性疾病是危害水產(chǎn)生態(tài)養(yǎng)殖最嚴(yán)重的疾病之一[3-4]，水產(chǎn)養(yǎng)殖中如弧菌病治理不當(dāng)，易引發(fā)食品安全問題，給人類健康帶來巨大危害[5-6].當(dāng)前，治療弧菌病主要使用抗生素類藥物，但其長期過量使用，不僅導(dǎo)致水生環(huán)境中的弧菌產(chǎn)生耐藥性，而且水產(chǎn)品中的殘留給人體健康帶來巨大危害[7-8].大多數(shù)中草藥具有廣譜抗菌、來源廣、價(jià)格便宜、綠色安全、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，與抗生素作用不同，在防控疾病方面主要是通過提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的非特異性免疫而達(dá)到抗菌效果的[11]，所以用中草藥替代抗生素作為新型弧菌抑制劑在我國具有較高的研究價(jià)值.

山茱萸(Cornusofficinalis)作為山茱萸科植物[12]，在我國分布范圍廣泛，其藥用價(jià)值高[13-14]，最早被《神農(nóng)本草經(jīng)》所記載.山茱萸中有效成分的生物活性眾多，如抗菌、抗氧化、利尿、抗癌等[15-16].Shu等[17]認(rèn)為山茱萸酚酸類物質(zhì)能較好抑制金黃色葡萄球菌與金芽孢桿菌.Brindza[18]研究發(fā)現(xiàn)山茱萸中熊果酸對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和黑曲菌均有較強(qiáng)的抑制作用.本課題組前期首先進(jìn)行了山茱萸、沙棘、藿香等13種中草藥抑制哈氏弧菌、副溶血弧菌活性的篩選實(shí)驗(yàn)，并將山茱萸乙醇提取物與陽性對(duì)照大蒜素進(jìn)行活性對(duì)比，發(fā)現(xiàn)13種中草藥中山茱萸乙醇提取物抑制弧菌活性最好，同時(shí)山茱萸乙醇提取物的活性強(qiáng)于大蒜素；其次，利用大孔吸附樹脂柱層析和薄層層析法對(duì)山茱萸乙醇提取物進(jìn)行分離得到了3個(gè)組分，并采用化學(xué)定性檢測(cè)法對(duì)3個(gè)組分進(jìn)行鑒定，初步判定山茱萸抑菌活性成分為酚酸類化合物.因此，本研究對(duì)山茱萸總酚酸提取工藝[19]進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)其抗弧菌活性成分進(jìn)行初步研究，以期為山茱萸總酚酸資源開發(fā)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中弧菌性疾病防治提供借鑒.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸粉末，購自安徽毫州中藥廠，過80目篩，備用；指示菌為哈氏弧菌，購自中國普通微生物菌株保藏管理中心，由本實(shí)驗(yàn)室保存.

試驗(yàn)用沒食子酸(CAS號(hào)：149-91-7)、Folin-酚試劑，江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司；MH肉湯、海鹽、瓊脂粉，上海藍(lán)季生物有限公司；無水乙醇(EtOH)、石油醚(PE)、二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(nBuOH)為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；柱色譜硅膠(200～300目)、Sephadex LH-20凝膠柱，Pharmacia公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山茱萸總酚酸的提取

定量稱取干燥的山茱萸粉末10.0 g，置于500 mL三口瓶中，加入150 mL一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，設(shè)置超聲功率225 W、超聲溫度50 ℃.在一定時(shí)間內(nèi)，先超聲破碎，后回流提取，減壓抽濾，重復(fù)2次.收集2次濾液后濃縮，置于10 mL容量瓶中進(jìn)行定容，測(cè)定其在755 nm波長處的吸光值.

1.2.2 山茱萸總酚酸提取得率的測(cè)定

1.2.3 單因素試驗(yàn)

分別考察乙醇含量(體積分?jǐn)?shù)20%、40%、60%、80%、100%)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)、超聲持續(xù)時(shí)間(15、30、45、60、75 min)、回流時(shí)間(30、60、90、120、150 min)和回流溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)山茱萸中總酚酸提取得率的影響.

1.2.4 Plackett-Burman篩選試驗(yàn)中的關(guān)鍵因素

以單因素的試驗(yàn)結(jié)果為基準(zhǔn)，將總酚酸得率視為響應(yīng)值(Y)，對(duì)乙醇含量(X1)、液料比(X2)、超聲持續(xù)時(shí)間(X3)、回流時(shí)間(X4)及回流溫度(X5)5個(gè)影響因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出主效應(yīng)因子，每個(gè)因素取最低(-1)和最高(1)2個(gè)水平，共12組試驗(yàn).主要試驗(yàn)因素和水平的取值見表1.

STS教育就是在STS思想指導(dǎo)下，為培養(yǎng)了解科學(xué)技術(shù)、能積極參與科學(xué)技術(shù)相關(guān)社會(huì)問題的決策、具有一定科學(xué)素養(yǎng)的公民而進(jìn)行的一種教育，突出科學(xué)技術(shù)在個(gè)人和社會(huì)方面的應(yīng)用以及科學(xué)、技術(shù)和社會(huì)之間的相互作用。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

1.2.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)

以Plackett-Burman的試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果為基礎(chǔ)，通過選擇乙醇含量(A)、超聲持續(xù)時(shí)間(B)、回流時(shí)間(C)3個(gè)因素，完成了3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以篩選最佳工藝.具體試驗(yàn)因素和水平的取值見表2.

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

1.2.6 抗弧菌活性成分分析

將提取的山茱萸總酚酸溶液進(jìn)行減壓濃縮，得到山茱萸浸膏.用適量蒸餾水溶解浸膏，依次用PE、DCM、EA、nBuOH萃取，減壓濃縮，得到5個(gè)不同萃取部位.結(jié)合不同極性部位對(duì)哈氏弧菌的抑制效果進(jìn)行活性追蹤，發(fā)現(xiàn)EA部位抗哈氏弧菌活性最強(qiáng)，故而確定其作為下一步研究對(duì)象.

過硅膠柱，以DCM∶MeOH(10∶1～0∶1)進(jìn)行洗脫，分離出7個(gè)組分(Fr.1～Fr.7).通過活性追蹤，將抗哈氏弧菌活性最強(qiáng)的組分Fr.6再次過硅膠柱，以DCM∶MeOH(20∶1～0∶1)進(jìn)行洗脫，分離出組分Fr.6.1～Fr.6.6，其中Fr.6.2(化合物1)為淡黃色結(jié)晶.但此時(shí)通過活性追蹤發(fā)現(xiàn)，組分Fr.6.5活性最強(qiáng)，故對(duì)其進(jìn)行凝膠柱層析，以MeOH為洗脫劑，TLC點(diǎn)樣，相同組分合并，得到組分Fr.6.5.1～Fr.6.5.5，其中Fr.6.5.4(化合物2)為白色結(jié)晶.利用1H NMR、13C NMR及ESI-HRMS對(duì)化合物1、2進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)山茱萸總酚酸得率的影響

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山茱萸總酚酸得率的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～60%時(shí)，山茱萸總酚酸得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)上升而升高，并在60%時(shí)達(dá)到最高，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%～100%時(shí)，總酚酸得率逐漸下降(圖1).乙醇與水按照不同比例混合后配成梯度濃度溶劑，而不同梯度濃度的乙醇溶液對(duì)植物中化學(xué)物質(zhì)溶出度有一定影響，因此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%.

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山茱萸總酚酸得率的影響

2.1.2 液料比對(duì)山茱萸總酚酸得率的影響

圖2 液料比對(duì)山茱萸總酚酸得率的影響

2.1.3 超聲持續(xù)時(shí)間對(duì)山茱萸總酚酸得率的影響

山茱萸總酚酸得率在超聲持續(xù)時(shí)間為60 min時(shí)達(dá)到最大，而當(dāng)超聲持續(xù)時(shí)間大于60 min時(shí)，得率急劇下降(圖3).其原因可能是當(dāng)超聲持續(xù)時(shí)間為60 min時(shí)，山茱萸中總酚酸質(zhì)量濃度與60%乙醇提取溶劑中總酚酸的質(zhì)量濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡；而當(dāng)其超過60 min后，超聲處理會(huì)明顯升溫，造成物質(zhì)活性喪失，故得率隨之下降.因此，確定超聲持續(xù)時(shí)間為60 min.

圖3 超聲持續(xù)時(shí)間對(duì)總酚酸得率的影響

2.1.4 回流時(shí)間對(duì)山茱萸總酚酸得率的影響

山茱萸總酚酸得率隨著回流時(shí)間增加而增大，到120 min時(shí)達(dá)到最大，隨后下降(圖4).這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間延長，總酚酸被氧化導(dǎo)致得率下降.因此,確定回流時(shí)間為120 min左右.

圖4 回流時(shí)間對(duì)總酚酸得率的影響

2.1.5 回流溫度對(duì)山茱萸總酚酸得率的影響

山茱萸總酚酸得率在溫度為50 ℃時(shí)達(dá)到最大.當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí)，得率呈緩慢下降趨勢(shì)(圖5).推測(cè)是由于總酚酸類物質(zhì)熱穩(wěn)定性不好，長時(shí)間高溫加熱易被氧化，導(dǎo)致部分總酚酸類物質(zhì)丟失，得率下降.因此,選擇回流溫度為50 ℃左右.

圖5 回流溫度對(duì)總酚酸得率的影響

2.2 關(guān)鍵因素的確定

采用Design-Expert 10.0.7軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到山茱萸總酚酸得率為響應(yīng)值的最優(yōu)方程為：Y=3.043+0.196X1+0.057X2-0.106X3-0.115X4+0.068X5，且得到方差分析結(jié)果，見表4.由表4數(shù)據(jù)，根據(jù)效應(yīng)值的大小可知影響山茱萸總酚酸得率的關(guān)鍵因素依次為：X1>X3>X4>X5>X2.其中乙醇含量X1、超聲持續(xù)時(shí)間X3對(duì)山茱萸總酚酸得率的影響達(dá)到極其顯著水平(P<0.01)，回流時(shí)間X4則達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而回流溫度X5和液料比X2影響不顯著.故選擇乙醇含量、超聲持續(xù)時(shí)間、回流時(shí)間3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn).通過觀察單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并綜合考慮成本、效率等方面，將液料比和回流溫度這2個(gè)因素分別固定為15∶1(mL/g)和50 ℃.

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.3 響應(yīng)面分析的優(yōu)化

采用Design-Expert 10.0.7軟件對(duì)表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得總酚酸得率(Y)對(duì)乙醇含量(A)、超聲持續(xù)時(shí)間(B)以及回流時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=4.27+0.20A+0.22B-0.24C+0.11AB+0.061AC+0.17BC-0.43A2-0.80B2-0.59C2.對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6.由表6數(shù)據(jù)可知，該回歸模型P<0.000 1(極顯著)，失擬項(xiàng)P=0.906 5>0.05(不顯著)，說明該回歸模型可靠，可用于山茱萸總酚酸得率的優(yōu)化.并且，模型決定系數(shù)R2為0.992 5，表明擬合度較好；校正決定系數(shù)R2為0.982 8，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相關(guān)性高，所以此回歸模型可用于分析、預(yù)測(cè)山茱萸總酚酸得率.此外，在該回歸模型中，二次項(xiàng)AB對(duì)山茱萸總酚酸得率的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而A、B、C以及BC、A2、B2、C2則為極顯著水平(P<0.01)，AC無顯著影響.各因素響應(yīng)面如圖6所示.

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 回歸模型方差分析結(jié)果

圖6 各因素響應(yīng)面圖

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

通過軟件進(jìn)一步分析得到最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)62.35%、超聲持續(xù)時(shí)間61.33 min、回流時(shí)間116.53 min.在此條件下，山茱萸總酚酸得率最大理論值為4.324 mg/g.考慮到實(shí)際生產(chǎn)條件，將最佳工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲持續(xù)時(shí)間60 min、回流時(shí)間115 min.在該條件下進(jìn)行平行試驗(yàn)驗(yàn)證，測(cè)得總酚酸得率平均值為4.307 mg/g，而預(yù)測(cè)值為4.324 mg/g，兩者結(jié)果接近，相對(duì)誤差為0.39%，表明該模型具有較高的準(zhǔn)確度.

2.5 活性成分結(jié)構(gòu)表征

化合物1：淡黃色固體，ESI-MS m/z 171.026 7[M+Na]+；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:4.35(dd,J=7.5, 5.1 Hz, 1H,C-H),3.63(s,3H,CH3), 2.63(dd,J=15.8, 5.1 Hz,1H,CH),2.49(dd,J=15.8,7.5 Hz,1H,CH).13C NMR(126 MHz,DMSO-d6)δ=173.82(C-1),172.05(C-2),67.48(C-3),52.10(C-4),39.60(C-5).通過與文獻(xiàn)[21]數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物1為2-羥基丁二酸-1-甲酯，其結(jié)構(gòu)式見圖7.

圖7 化合物1的結(jié)構(gòu)

化合物2：白色無定形粉末，ESI-MS m/z 169.0163[M-H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:12.21(s, 1H, COOH),9.18(s, 2H, OH),8.81(s, 1H, OH),6.92(s, 2H, Ph-H);13C NMR(126MHz, DMSO-d6)δ:167.93(C-7),145.8(C-2,6),8.81(C-4),109.19(C-3,5).通過與文獻(xiàn)[22]數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物2為3,4,5-三羥基苯甲酸(沒食子酸)，其結(jié)構(gòu)式見圖8.

圖8 化合物2的結(jié)構(gòu)

3 結(jié)語

通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)以及Box-Behnken設(shè)計(jì)，優(yōu)化山茱萸總酚酸提取工藝，得到最優(yōu)提取條件為液料比15∶1 mL/g、回流溫度50 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲持續(xù)時(shí)間60 min、回流時(shí)間115 min.在該條件下，山茱萸總酚酸的得率為4.307 mg/g.另外，通過硅膠柱、凝膠柱層析及活性追蹤，初步探究山茱萸中抑制弧菌的活性成分，最終分離得到2個(gè)化合物,即2-羥基丁二酸-1-甲酯和沒食子酸.本文為山茱萸抑制弧菌活性成分的進(jìn)一步研究提供了借鑒，以求推動(dòng)水產(chǎn)抗菌藥的開發(fā).