譚明濤 姜 礅 武 帥 張 杰 劉 磊 趙佳齊 孟昭軍 嚴善春,2

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營教育部重點實驗室 哈爾濱 150040;2.黑龍江省外來林木病蟲害監(jiān)測與防控重點實驗室 哈爾濱 150040)

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizae fungi, AMF) 廣泛存在于自然界中，屬球囊菌門(Glomeromycota)，能在土壤中與植物根系形成互利共生體系。AMF可通過宿主植物獲取其生長發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)，幫助植物吸收N、P等礦質(zhì)元素，并通過提高植物對N、P的利用促進植物生長(邢易梅等, 2020; Taoetal., 2016; Gaoetal., 2020; 辜曉婷等, 2020)。接種AMF的植物，其葉綠素和營養(yǎng)物質(zhì)含量增加，應(yīng)對旱、澇、病原菌侵染等不良環(huán)境的能力顯著提高(Shrivastavaetal., 2015; Benhibaetal., 2015; 秦海濱等, 2014)。張蓓蓓等(2019)在干旱條件下將根內(nèi)球囊霉(Glomusintraradices，GI)接種在小麥(Triticumaestivum)上，發(fā)現(xiàn)小麥植株籽粒的N、P含量顯著增加，抗旱能力增強。董艷等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF可顯著降低豌豆枯萎病的病情指數(shù)。AMF還會誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)，提高植物的防御能力，從而影響植食性昆蟲的取食傾向、生長和繁殖(Jungetal., 2012; 何磊等, 2017)。何磊等(2017)發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾(Spodopteralitura)取食接種AMF的花生(Arachishypogaea)和番茄(Lycopersiconesculentum)后，幼蟲存活率下降，幼蟲歷期和蛹期明顯延長。Nishida等(2010)分別將GI等6種叢枝菌根真菌接種到日本百脈根(Lotusjaponicus)，發(fā)現(xiàn)其葉片內(nèi)酚類的含量顯著提高，并抑制二斑葉螨(Tetranychusurticae)的取食和產(chǎn)卵。昆蟲為了適應(yīng)寄主植物的這些不利影響，會激活體內(nèi)的消化酶和解毒酶等應(yīng)激機制，以維持其正常的取食和生長發(fā)育(李壽銀等, 2019; 陳澄宇等, 2015)。但AMF在樹木-昆蟲之間的作用知之尚少。

銀中楊(Populusalba×P.berolinensis)是銀白楊(P.alba)與中東楊(P.berolinensis)雜交培育成的楊樹新品種，具有生長快、樹勢壯及耐不良環(huán)境的特點(楊國日等, 2020)。美國白蛾(Hyphantriacunea)屬鱗翅目(Lepidoptera)燈蛾科(Arctiidae)，是我國危害較為嚴重的檢疫性害蟲，原產(chǎn)于北美洲，1979年于遼寧首次發(fā)現(xiàn)(Baietal., 2020)。美國白蛾食性雜，食量大，對林木、果園和農(nóng)作物等造成嚴重危害和經(jīng)濟損失(Zhangetal., 2016)。為探明美國白蛾對接種AMF銀中楊的生長適應(yīng)及生理響應(yīng)，本研究使用接種摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)的銀中楊的葉片飼喂美國白蛾幼蟲，觀察美國白蛾幼蟲的生長發(fā)育、食物的利用情況，分析其消化酶和解毒酶的活性變化，為揭示AMF在林木與植食性昆蟲之間的相互作用奠定基礎(chǔ)，并為利用AMF誘導(dǎo)增強林木化學(xué)防御提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試銀中楊幼苗及處理

2020年5月于東北林業(yè)大學(xué)苗圃，將1年生銀中楊扦插苗沙埋1周，澆水保濕。將經(jīng)沙埋的插穗取出后用500 mg·L-1生根粉溶液浸泡12 h后種植于規(guī)格為高230 mm、直徑250 mm的花盆中。土壤基質(zhì)為沙土∶草炭土∶蛭石=1∶3∶1，混合后在121 ℃下高壓滅菌2 h。將花盆分為2組，處理組裝入2 kg滅菌土壤與20 g GM的均勻混合物； 對照組只裝入2 kg滅菌土壤。每組150株，2組共300株。GM由甘肅農(nóng)科院提供，通過宿主玉米和三葉草擴繁完成，菌劑中包含孢子、菌絲、根段和沙子，其中孢子含量15個·g-1。AMF侵染率測定根據(jù)Phillips等(1970)和薛世通等(2020)方法并加以優(yōu)化。在接種后90天，GM侵染率達到最高(45.6%)。

1.2 供試美國白蛾卵及試驗處理

2020年8月末，從中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所昆蟲病毒研發(fā)中心購買美國白蛾卵。于檢疫防控實驗室，將卵置于光照培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司HPG-280HX型)，在溫度為(25±1)℃、相對濕度為(70±1)%、光周期為16 L∶8D的條件下孵化。因初孵幼蟲抵抗力差，死亡率高，所以幼蟲孵化后在相同條件下用人工飼料喂養(yǎng)至2齡后進行試驗處理。將蛻皮的2齡幼蟲分為2組，每組100頭。接種GM 90天后，分別采摘對照組和GM組的新鮮葉片飼喂幼蟲。每天更換1次葉片，直至幼蟲化蛹或死亡。

1.3 美國白蛾幼蟲生長發(fā)育指標測定

試驗過程中，從對照組和處理組分別各隨機選取30頭蛻皮時間不超過24 h的3～6齡幼蟲，稱量體質(zhì)量并記錄其發(fā)育歷期，用于計算3～6齡幼蟲相對生長率。根據(jù)馬孝龍(2019)的方法計算美國白蛾幼蟲相對生長率，計算公式如下：

相對生長率(RGR)=體質(zhì)量增加量/(平均體質(zhì)量×取食天數(shù))×100%。

1.4 美國白蛾幼蟲食物利用指標測定

根據(jù)美國白蛾特性，低齡幼蟲取食量小，生長發(fā)育緩慢，而老熟齡幼蟲食量大，且寄主植物對幼蟲食物利用的影響需要一定時間的積累效應(yīng)，因此選取5、6齡幼蟲測定其食物利用情況(潘忠玉等，2020)。從2個組再分別隨機選取5、6齡幼蟲各5頭作為1個重復(fù)，測定取食前幼蟲體質(zhì)量、鮮葉質(zhì)量，以及取食24 h后幼蟲體質(zhì)量、排糞質(zhì)量和殘葉質(zhì)量，每組測4個重復(fù)，測后繼續(xù)分組飼養(yǎng)； 用未飼喂幼蟲的葉片測算校正失水率； 分析其食物利用情況。根據(jù)馬孝龍(2019)和Yazdanfar等(2016)方法計算美國白蛾幼蟲食物消耗率、轉(zhuǎn)化率及利用率，計算公式如下：

取食量=(取食前鮮葉質(zhì)量-取食后殘葉質(zhì)量)/(1-校正失水率)，食物消耗率(EAD)=(取食量-排糞質(zhì)量)/取食量×100%，食物轉(zhuǎn)化率(ECI)=昆蟲體質(zhì)量增長質(zhì)量/(取食量-排糞質(zhì)量)×100%，食物利用率(ECD)=昆蟲體質(zhì)量增長量/取食量×100%。

1.5 美國白蛾消化酶及解毒酶活性測定

從對照組和處理組各選取12頭蛻皮時間不超過24 h的5、6齡幼蟲，置于-40 ℃冰箱中保存，用于消化酶及解毒酶的活性測定。消化酶選取脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶進行測定； 解毒酶選取對分解外源毒物和維持昆蟲正常生理代謝起重要作用的羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)進行測定(樊艷平等，2020； Zhangetal., 2013)。將樣品從冰箱中取出，每3頭相同齡期的幼蟲為1個重復(fù)(姜礅，2019)，置于玻璃勻漿器中，容器中加入3 mL預(yù)冷的生理鹽水，冰浴下研磨后轉(zhuǎn)入離心管。4 ℃離心，取上清液用于酶活測定。每組每齡期4個重復(fù)。各種酶活性均使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

用Excel軟件將測得的實驗數(shù)據(jù)進行處理和繪圖。使用SPSS22.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)的平均值和標準誤差。以LSD(最小顯著法)在0.05水平下檢驗相同齡期處理組與對照組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMF定殖銀中楊對美國白蛾幼蟲生長發(fā)育的影響

取食GM組葉片后，美國白蛾幼蟲的生長發(fā)育情況見表1、圖1、2。對照組3～6齡幼蟲體質(zhì)量均不同程度的高于GM組，但差異不顯著。GM組2～5齡幼蟲發(fā)育歷期顯著延長(P<0.05)，6齡幼蟲發(fā)育歷期縮短，但與對照差異不顯著。GM組3～6齡幼蟲相對生長率均不同程度的低于對照(P<0.05)，其中3、5齡幼蟲與對照差異顯著。

表1 AMF定殖銀中楊對美國白蛾齡幼蟲體質(zhì)量的影響①Tab.1 Effects of P. alba×P. berolinensis colonized by AMF on body weight of larvae of H. cunea

2.2 AMF定殖銀中楊對美國白蛾幼蟲食物利用的影響

接種GM的銀中楊對美國白蛾5齡幼蟲食物消耗率無顯著影響，但顯著抑制5齡幼蟲的食物轉(zhuǎn)化率和食物利用率(P<0.05)，而美國白蛾6齡幼蟲的食物消耗率、轉(zhuǎn)化率和利用率雖低于對照，但差異不顯著(圖3)。

2.3 美國白蛾幼蟲消化酶活性對AMF定殖銀中楊的響應(yīng)

取食接種GM組葉片后，美國白蛾5、6齡幼蟲的脂肪酶活性均顯著提高(P<0.05)； 蛋白酶活性和淀粉酶活性呈齡期特異性，表現(xiàn)為5齡幼蟲均略高于對照，但差異均不顯著； 6齡幼蟲均顯著高于對照(P<0.05)(圖4)。

圖1 AMF定殖銀中楊對美國白蛾齡幼蟲發(fā)育歷期的影響Fig. 1 Effects of P. alba×P. berolinensis colonized by AMF on developmental duration of larvae of Hyphantria cunea*同一齡期不同處理之間差異顯著 (P<0.05)，下同。The asterisk indicated that there were significant differences among different treatments at the same instar (P < 0.05), the same below.

圖2 飼喂GM組葉片對美國白蛾幼蟲相對生長率的影響Fig. 2 Effects of feeding GM leaves on the relative growth rate of larvae of H. cunea

圖3 飼喂GM組葉片對美國白蛾幼蟲食物消耗率、轉(zhuǎn)化率和利用率的影響Fig. 3 Effects of feeding GM group leaves on food digestion rate, food conversion rate and food utilization rate of larvae of H. cunea

圖4 飼喂GM組葉片對美國白蛾幼蟲消化酶活性的影響Fig. 4 Effects of feeding GM group leaves on digestive enzymes activities of larvae of H. cunea

2.4 美國白蛾幼蟲解毒酶活性對AMF定殖銀中楊的響應(yīng)

GM組CarE活性，5齡幼蟲略高于對照但差異不顯著，6齡幼蟲顯著提高(P<0.05)； GSTs活性，在5齡時被顯著抑制，6齡時被顯著激發(fā)(P<0.05)。

圖5 飼喂GM組葉片對美國白蛾幼蟲解毒酶活性的影響Fig. 5 Effects of feeding GM leaves on detoxification enzymes activities of larvae of H. cunea

3 討論

本研究表明，外源接種GM的銀中楊對美國白蛾幼蟲的生長發(fā)育和食物利用均有不同程度抑制作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，接種GM的銀中楊體內(nèi)的總酚、黃酮、木質(zhì)素、單寧等次生代謝物質(zhì)，以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、胰凝乳蛋白酶抑制劑(CI)和胰蛋白酶抑制劑(TI)等防御蛋白活性顯著增加，這可能是GM組初期對美國白蛾幼蟲生長發(fā)育和食物利用的表現(xiàn)為抑制作用的原因。Murrell等(2020)發(fā)現(xiàn)玉米的防御能力隨著AMF定殖量增加而增強，歐洲玉米螟發(fā)育速率隨玉米防御能力增強而降低。Selvaraj等(2020)研究發(fā)現(xiàn)，接種GI能提高黑吉豆(Vignamungo)葉片中酚類、木質(zhì)素等防御代謝產(chǎn)物含量及防御蛋白活性，顯著降低斜紋夜蛾(Spodopteralitura)的取食效率。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，GM組美國白蛾3～5齡幼蟲的體質(zhì)量雖與對照無顯著差異，但其發(fā)育歷期顯著延長，導(dǎo)致其相對生長速率降低。說明GM處理能降低美國白蛾的發(fā)育速率，延長其暴露于不良環(huán)境的時間，增加被天敵捕食的風(fēng)險。而GM組6齡幼蟲的體質(zhì)量和發(fā)育歷期均與對照無顯著差異，表明美國白蛾具有較強的抗逆響應(yīng)能力，在生長發(fā)育過程中能逐漸適應(yīng)不良寄主植物，這從一個側(cè)面反映了美國白蛾能夠經(jīng)常性暴發(fā)成災(zāi)的機理。

消化酶是由昆蟲消化系統(tǒng)分泌的一類水解酶，包括脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶，能將食物中包含的營養(yǎng)成份分解成可被吸收和利用的小分子物質(zhì)，為昆蟲的生長發(fā)育提供所需的營養(yǎng)和能量(Baghbanetal., 2014; 李藝瓊等, 2017)。本研究發(fā)現(xiàn)，取食GM組葉片后，美國白蛾5齡幼蟲對食物的利用受到顯著抑制，僅脂肪酶活性被顯著激發(fā)，其原因可能是美國白蛾幼蟲取食GM定殖銀中楊葉片后的自我生理調(diào)節(jié)(魯智慧等, 2020; 向玉勇等, 2020)； 而6齡幼蟲3種消化酶活性均顯著增加，對食物的利用沒有受到顯著抑制。表明隨著處理時間延長，美國白蛾幼蟲會激活消化系統(tǒng)，適應(yīng)寄主質(zhì)量的變化。消化酶活性的變化反映出美國白蛾對消化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力和對寄主植物的適應(yīng)能力。

解毒酶是一種以協(xié)助昆蟲直接溶解或消化外源毒物為目的的防御酶，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和羧酸酯酶作為昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶，其活性能夠被多種次生物質(zhì)誘導(dǎo)，以增強對次生物質(zhì)的代謝能力，提高對寄主的適應(yīng)性并維持自身正常的生長發(fā)育(陳銳等, 2020; 黃敏燕等, 2018)。本研究中，美國白蛾5齡幼蟲的GSTs活性顯著低于對照，CarE活性與對照相近，而美國白蛾6齡幼蟲的GSTs與CarE活性均顯著高于對照，說明美國白蛾幼蟲能夠通過提高解毒能力去響應(yīng)寄主植物質(zhì)量的變化，逐漸抵御和適應(yīng)不良寄主植物造成的毒害。姜礅等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯能誘導(dǎo)增強長白落葉的化學(xué)防御，落葉松毛蟲取食后，其體內(nèi)解毒酶活性的響應(yīng)趨勢表現(xiàn)為4齡時均顯著低于CK，5齡時不同程度地高于CK。潘忠玉等(2020)發(fā)現(xiàn)使用高濃度綠原酸處理后，美國白蛾幼蟲腸道中的GSTs等解毒酶的活性顯著提高，說明美國白蛾幼蟲可能通過誘導(dǎo)其解毒酶活性從而對食物中的綠原酸產(chǎn)生適應(yīng)性。美國白蛾解毒酶活性的顯著提高，再次反映出其擁有極強的抗逆響應(yīng)能力。

解毒酶與消化酶一起構(gòu)成了美國白蛾應(yīng)對不同質(zhì)量寄主植物的重要防線。Chen等(2020)發(fā)現(xiàn)美國白蛾營養(yǎng)代謝和解毒相關(guān)基因在寄主選擇和適應(yīng)時顯著表達，說明這些基因參與調(diào)控美國白蛾適應(yīng)寄主植物。Wu等(2019)發(fā)現(xiàn)在美國白蛾基因組中，與碳水化合物代謝和味覺受體相關(guān)的基因和途徑大量擴增，并在入侵種群中顯示出功能多態(tài)性，揭示了美國白蛾作為外來物種的入侵性和適應(yīng)性強的分子機制。因此，在基因調(diào)控下激活由解毒酶和消化酶組成的抵御機制可能是美國白蛾經(jīng)常暴發(fā)并難以防治的重要原因之一。

4 結(jié)論

GM定殖銀中楊能夠影響美國白蛾幼蟲的生長發(fā)育和食物利用能力，說明AM真菌可被作為化學(xué)類藥劑的潛在替代品，應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)過程中害蟲的防治。然而，美國白蛾幼蟲會激活其消化及解毒機制來適應(yīng)和響應(yīng)AMF定殖后寄主植物質(zhì)量的惡化，以維持其正常的生長發(fā)育。