李鑫玉 王敏求 袁美靈 Saneyoshi Ueno 武星彤 蔡夢(mèng)穎, Yoshihiko Tsumura 文亞峰

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院 長(zhǎng)沙 410004； 2.日本森林綜合研究所森林分子遺傳學(xué)與生物技術(shù)部 筑波 305-8687；3.筑波大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 筑波 305-8572)

植物現(xiàn)代地理分布和遺傳變異格局是多種生物與非生物因素協(xié)同作用的結(jié)果 (Harrisonetal., 2001; Wangetal., 2013)，其中，地理和環(huán)境氣候變化是最關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)因素，會(huì)對(duì)物種形成、遺傳分化、種群進(jìn)化產(chǎn)生顯著影響 (Hewitt, 1996; 2004; Begonetal., 2006)。地理因素主要包括山脈隆起、陸地變遷、海水退卻等地質(zhì)事件，而全球氣候變化則以第四紀(jì)冰期-間冰期的循環(huán)最為劇烈，其對(duì)植物物種形成和現(xiàn)代地理分布所造成的影響極其深刻 (Bennett, 1997)。

現(xiàn)代植物類群中，第三紀(jì)孑遺植物以其起源古老、形態(tài)特殊、進(jìn)化緩慢吸引了眾多研究者的關(guān)注(Tiffney, 1985, Tiffneyetal., 2001; Milneetal., 2002)，被稱為植物“活化石”。晚第三紀(jì)和第四紀(jì)期間，受全球氣候變化的影響，這些曾在第三紀(jì)廣泛分布的植物逐漸退縮至東亞、北美和歐洲西南部三大冰期避難所 (Milneetal., 2002)。這些區(qū)域中，東亞植物區(qū)系是全球植物多樣性最為豐富和復(fù)雜的地區(qū)，擁有全球最古老和最完整的植物多樣性演化系列。同時(shí)，現(xiàn)代東亞植物區(qū)系反映了重大的古地質(zhì)和環(huán)境氣候變化 (邱英雄等，2017)，是研究北半球植物起源和進(jìn)化的關(guān)鍵地區(qū)。杉科 (Taxodiaceae) (現(xiàn)歸屬于柏科)是第三紀(jì)孑遺植物中獨(dú)特的裸子植物類群，多為單型屬或寡型屬。著名的活化石植物水杉在該區(qū)域的發(fā)現(xiàn)，也使其成為中國(guó)-日本植物區(qū)系的譜系代表 (Chenetal., 2018)。鑒于杉科植物悠久的演化歷史，獨(dú)特的生活習(xí)性，及其在東亞地區(qū)的廣泛分布，研究它的進(jìn)化歷史和地史分布對(duì)于揭示整個(gè)松杉類植物的系統(tǒng)演化、地理分布及全球古植物地理區(qū)系和古氣候變化均有重要意義。

柳杉屬(Cryptomeria)樹種為東亞特有，是現(xiàn)存杉科植物中最原始的類群，祖先的大多數(shù)原始性狀在該屬得到保留 (于永福，1995)。柳杉屬間斷分布于我國(guó)和日本，長(zhǎng)期的人工栽培與廣泛利用，使其起源、天然分布地和分類都存在很大爭(zhēng)議。有的認(rèn)為日本和我國(guó)東部的天目山、武夷山是該屬的起源地和天然種群分布中心 (王江等，2007； 袁美靈等，2019)，但也有認(rèn)為柳杉原產(chǎn)日本，柳杉在我國(guó)屬外來物種 (Chenetal., 2008)。柳杉屬的分類存在1個(gè)種和2個(gè)種的爭(zhēng)議，較多學(xué)者認(rèn)為柳杉屬是單種屬，包括柳杉(Cryptomeriajaponicavar.sinensis)和日本柳杉(Cryptomeriajaponicavar.japonica)兩個(gè)變種 (Hayashi, 1960； Fuetal., 1999)，也有認(rèn)為長(zhǎng)期的地理隔離和種群分化，使柳杉和日本柳杉產(chǎn)生了可遺傳的表型變異，其應(yīng)屬于2個(gè)獨(dú)立的種(Cryptomeriafortunei和Cryptomeriajaponica) (王江等，2007)。

日本柳杉作為日本的“國(guó)樹”，不僅占據(jù)了44 %的人工林資源，而且其天然林分布廣泛 (Tsumuraetal.,2011)，從北部的青森縣至南部的屋久島都有較大面積分布。迄今為止，柳杉屬的遺傳學(xué)和譜系地理學(xué)研究多以日本柳杉為主。早期的表型分析和現(xiàn)代分子遺傳學(xué)研究表明，日本柳杉天然種群間存在顯著的遺傳分化 (Kojo, 1987； Tsumuraetal., 2007；2012； 2014; Kimuraetal., 2013)，可分為Omote-sugi和Ura-sugi2個(gè)地理變種，分別分布于日本島的太平洋沿岸和日本海沿岸。日本柳杉的種群進(jìn)化歷史也廣受關(guān)注，花粉化石資料顯示，170萬年前的氣候變化使日本柳杉產(chǎn)生了適應(yīng)性特征，種群分化可能發(fā)生在30萬年前。Kimura等(2014)基于SSR數(shù)據(jù)和貝葉斯計(jì)算方法，認(rèn)為日本柳杉不同地理譜系的分化時(shí)間為8萬年前。利用核基因組序列數(shù)據(jù)，Moriguchi等(2019)得到的日本柳杉分化時(shí)間為30萬年前。在化石資料不足的情況下，估算物種的分化時(shí)間，既與不同的標(biāo)記方法有關(guān)，也與遺傳分化模型和基因突變率的選擇有直接關(guān)系。雖然以上2個(gè)研究的分化時(shí)間略有差異，但共同顯示日本柳杉譜系分化發(fā)生在末次盛冰期(LGM)之前的較近時(shí)間，類似于“活化石”植物銀杏(Ginkgobiloba)，中國(guó)現(xiàn)存銀杏種群的遺傳足跡僅可追溯至39萬年前 (Hohmannetal., 2018)。最近的研究也表明，第四紀(jì)冰期氣候變化，特別是末次盛冰期對(duì)東亞地區(qū)柳杉的遺傳多樣性和遺傳分化產(chǎn)生了深刻影響 (Tsumuraetal., 2020)，但該研究只用了1個(gè)柳杉天然種群，對(duì)于分析柳杉和日本柳杉的種群進(jìn)化歷史尚有不足。因此，東亞全域范圍內(nèi)的柳杉種群研究，特別是柳杉和日本柳杉的遺傳分化和種群歷史動(dòng)態(tài)有待進(jìn)一步深入。

基于此，本研究以東亞全域分布柳杉屬樹種的天然種群為研究材料，利用核基因組微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，解析該屬的遺傳變異格局，以期掌握其遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，闡明其種群進(jìn)化歷史。在此基礎(chǔ)上，分析地理和氣候變化在柳杉遺傳分化中的作用，進(jìn)一步探討柳杉屬的起源和分類等科學(xué)問題。

1 材料與方法

1.1 研究材料

根據(jù)我國(guó)柳杉資源分布現(xiàn)狀，選取浙江、福建和安徽等省區(qū)的柳杉天然林(或古樹林)種群為研究材料。2017—2018年采集到10個(gè)種群共189個(gè)單株(胸徑大于100 cm)樣本(表1、圖1)，取嫩葉適量，利用改良CTAB法提取基因組DNA (張景麗，2014)，符合質(zhì)量要求的DNA稀釋至20～30 ng·μL-1用于試驗(yàn)分析。日本柳杉樣本來源于日本青森縣、秋田縣和新瀉縣等8個(gè)天然種群的109個(gè)單株，其DNA由日本森林綜合研究所提供(表1、圖1)。

1.2 基因分型

從日本柳杉核基因微衛(wèi)星(nSSR)中篩選14個(gè)多態(tài)性豐富的位點(diǎn)用于基因分型 (Tanietal., 2003； Moriguchietal., 2003; Moriguchietal., 2014) (表2)，這些位點(diǎn)經(jīng)檢測(cè)分析均不含無效等位基因。正向引物5′端加熒光接頭FAM，HEX或TAMRA。PCR擴(kuò)增體系為15 μL，含2 × Taq PCR MasterMix (Tiangen) 7.5 μL，正向引物(F)和反向引物(R)各0.75 μL(10 μmol·L-1)，DNA模板3 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。1.6 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用ABI3730xL分析儀進(jìn)行基因分型(Liz 500為內(nèi)標(biāo))，GeneMarker version 2.20軟件 (Hulceetal., 2011)統(tǒng)計(jì)基因分型結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 遺傳多樣性與遺傳分化 利用GenAlEx6.5 (Peakalletal., 2012)統(tǒng)計(jì)等位基因數(shù)(Na)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和基因流(Nm)等遺傳參數(shù)。HP-Rare 1.1 (Kalinowski，2005)計(jì)算各種群等位基因豐富度(Ar)和私有等位基因豐富度(PAr)。FSTAT (Goudet，1995)用于估算近交系數(shù)(FIS)、總的遺傳多樣性(Ht)、種群內(nèi)遺傳多樣性(Hs)和遺傳分化系數(shù)(GST和FST)?；蛄鞲鶕?jù)公式Nm= (1/FST-1)/4計(jì)算獲得。

1.3.2 遺傳結(jié)構(gòu) 根據(jù)地理來源將東亞地區(qū)的柳杉屬植物樣本分為柳杉和日本柳杉2個(gè)組群，利用Arlequin 3.0 (Excoffieretal.，2005) 按組群間、種群間和種群內(nèi)進(jìn)行遺傳變異分子方差分析(AMOVA)。STRUCTURE 2.3.3 (Pritchardetal.，2000) 用于遺傳結(jié)構(gòu)分析，在混合模型 (Admixture model)下，設(shè)置Burn in period和MCMC (Markov Chain Monte Carlo) 的迭代參數(shù)分別為50 000和100 000，K值設(shè)定為1～18，每個(gè)K值運(yùn)算10次，其余使用默認(rèn)設(shè)置(Q值為0.9)。根據(jù)STRUCTURE HARVESTER (Earletal.，2012)計(jì)算ΔK數(shù)值的分布，確定最優(yōu)K值。利用CLUMPP軟件 (Jakobssonetal., 2007) 計(jì)算對(duì)應(yīng)K值的最優(yōu)Q-matrix結(jié)果，并利用Distruct軟件 (Rosenberg, 2004) 輸出可視化圖形?；诜N群間FST矩陣，利用MEGA 7軟件(Kumaretal.，2016)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法neighbor-joining, NJ)?；赗語(yǔ)言平臺(tái)，執(zhí)行‘a(chǎn).score’主成分判別分析(DAPC) (Jombart, 2008)。用GenAlEx6.5軟件(Peakalletal., 2012)進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，檢測(cè)地理距離和遺傳距離的相關(guān)性，設(shè)置999次隨機(jī)置換。

1.3.3 種群歷史動(dòng)態(tài) 利用DIY ABC軟件 (Cornuetetal.，2014)基于近似貝葉斯算法，模擬分析柳杉屬種群的歷史動(dòng)態(tài)。95%置信水平下，采用Logistic回歸，使用最接近模擬數(shù)據(jù)的1%觀測(cè)數(shù)據(jù)，估算每個(gè)進(jìn)化事件的后驗(yàn)概率(posterior probability, PP)，后驗(yàn)概率最大的進(jìn)化事件為最優(yōu)進(jìn)化事件。根據(jù)STRUCTURE、主成分判別分析(DAPC)和NJ聚類分析結(jié)果，按不同的基因庫(kù)分別構(gòu)建東亞地區(qū)柳杉的種群進(jìn)化事件。

表1 柳杉屬種群地理位置及樣本數(shù)量Tab.1 Locality information and sample size of Cryptomeria populations

圖1 柳杉屬種群地理分布及基于CLUMPP結(jié)果的基因庫(kù)分布圖(K = 4)Fig. 1 Geographic distribution of Cryptomeria populations and gene pool distribution map of each population based on CLUMPP results (K = 4)

(1)K=2時(shí)，分為柳杉(CHN)和日本柳杉(JAN)2個(gè)基因庫(kù)，構(gòu)建3種進(jìn)化事件：

事件1： 柳杉(CHN)和日本柳杉(JAN)由同一祖先種群分化而來(t1)；

事件2： 日本柳杉(JAN)在t1時(shí)間由柳杉(CHN)分化而來；

事件3： 柳杉(CHN)在t1時(shí)間由日本柳杉(JAN)分化而來。

(2)K=4時(shí)，分為中國(guó)東南部種群(CHS)、廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi) 4個(gè)基因庫(kù)，構(gòu)建4種進(jìn)化事件：

事件1： 日本海沿岸種群(Ura-sugi)于t1時(shí)分化出太平洋沿岸種群(Omote-sugi)，隨后t2、t3時(shí)間依次分化出廬山種群(LS)和中國(guó)東南部種群(CHS)；

事件2： 中國(guó)東南部種群(CHS)和日本海沿岸種群(Ura-sugi)由同一祖先種群分化而來(t1)，隨后，二者于t2時(shí)間發(fā)生混合事件，產(chǎn)生太平洋沿岸種群(Omote-sugi)，t3時(shí)間，太平洋沿岸種群(Omote-sugi)與中國(guó)東南部種群(CHS)混合，分化出廬山種群(LS)；

事件3： 中國(guó)東南部種群(CHS)、廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi)由同一祖先種群分化而來(t1)；

事件4： 廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi)種群于t1時(shí)間從同一祖先種群分化而來，隨后t2時(shí)間中國(guó)東南部種群(CHS)由廬山種群(LS)分化而來。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性與遺傳分化

14個(gè)nSSR位點(diǎn)共檢測(cè)到219個(gè)等位基因，不同位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)從2到33不等，平均為15.643。柳杉屬總的遺傳多樣性(Ht)為0.570，種群內(nèi)遺傳多樣性(Hs)為0.508 (表2)。不同種群的平均等位基因數(shù)(Na)在2.714～9.286之間，平均期望雜合度(He)和觀測(cè)雜合度(Ho)分別為0.488和0.472。以最小種群樣本數(shù)6為基數(shù)，廬山種群(LS)具有最高的等位基因豐富度和私有等位基因豐富度 (Ar = 5.271，(PAr = 0.976)，天寶巖高海拔種群(TB)的等位基因豐富度最低(Ar = 2.453)。柳杉屬種群遺傳分化系數(shù)(FST)為0.136，基因流(Nm)為1.588 (表4)，近交系數(shù)(FIS)從-0.100到0.294，平均值為0.060。在組群水平，柳杉的遺傳多樣性(Na= 4.571，Ho= 0.442)低于日本柳杉(Na= 4.634，Ho= 0.510) (表3)，但柳杉的遺傳分化程度(FST= 0.121)明顯高于日本柳杉(FST= 0.028)。

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)

根據(jù)AMOVA分析結(jié)果，柳杉屬的遺傳變異主要來自種群內(nèi)的個(gè)體間，種群內(nèi)遺傳變異占總變異的86.37% (P< 0.001) (表4)。STRUCTURE分析表明，K= 2時(shí)出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)并取得最大值，說明柳杉屬種群最有可能劃分為2個(gè)基因庫(kù)(gene pool) (圖2a、b)，分別對(duì)應(yīng)柳杉(除LS種群)和日本柳杉。K= 3時(shí)，柳杉種群中出現(xiàn)新的基因庫(kù)(黃色)，日本柳杉種群未出現(xiàn)新的基因庫(kù)。K= 4時(shí)，日本柳杉分為Ura-sugi和Omote-sugi兩個(gè)明顯的地理譜系，而中國(guó)廬山種群(LS)與Omote-sugi屬同一基因庫(kù)(綠色) (圖2c)。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹與主成分判別分析(DAPC)結(jié)果顯示柳杉屬可分為中國(guó)東南部(CHS)、中國(guó)廬山(LS)、日本海沿岸(Ura-sugi)和太平洋沿岸(Omote-sugi)四個(gè)譜系(圖3、4)。

Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示，柳杉屬種群的遺傳距離和地理距離之間不具有顯著相關(guān)性(R2=0.008 5，P=0.171) (圖5a)。在組群的水平上，柳杉(排除廬山種群)中沒有發(fā)現(xiàn)二者之間的顯著相關(guān)性(R2=0.016 4，P=0.226) (圖5b)，但日本柳杉中則具有顯著相關(guān)性(R2=0.223 5，P=0.018) (圖5c)。

表2 14個(gè)nSSR位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of 14 nSSR loci

表3 柳杉屬種群的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of the Cryptomeria populations

表4 柳杉屬種群間分子方差分析(AMOVA)Tab.4 Analysis of molecular variance (AMOVA) of Cryptomeria populations

圖2 柳杉屬種群STRUCTURE分析結(jié)果Fig. 2 Results of STRUCTURE analysis of the Cryptomeria populationsa: K值與Delta K關(guān)系圖; b: K值與Mean LnK關(guān)系圖; c: 當(dāng)K=2, 3, 4時(shí), STRUCTURE分析結(jié)果的直方圖。 CHS: 中國(guó)東南部種群; LS: 中國(guó)廬山種群; Ura-sugi: 日本海沿岸種群; Omote-sugi: 太平洋沿岸種群。a: Relationship between Delta K and K value; b: Relationship between Mean LnK and K value; c: Histogram of the STRUCTURE analysis for the model with K=2, K=3 and K=4;； CHS: the populations of Southeastern China; LS: the populations of Lushan China; Ura-sugi: the populations of the Japan Sea coast; Omote-sugi: the populations of the Pacific coast.

圖3 基于成對(duì)FST矩陣的柳杉屬種群系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法)Fig. 3 Phylogenetic tree of the Cryptomeria populations based on pairwise FST values (NJ method)CHS: 中國(guó)東南部種群; LS: 中國(guó)廬山種群; Ura-sugi: 日本海沿岸種群; Omote-sugi: 太平洋沿岸種群。CHS: the populations of Southeastern China; LS: the populations of Lushan China; Ura-sugi: the populations of the Japan Sea coast; Omote-sugi: the populations of the Pacific coast.

圖4 柳杉屬種群的主成分判別分析圖(DAPC)Fig. 4 Principal component discriminant analysis (DAPC) of the Cryptomeria populationsCHS: 中國(guó)東南部種群; LS: 中國(guó)廬山種群; Ura-sugi: 日本海沿岸種群; Omote-sugi: 太平洋沿岸種群。CHS: the populations of Southeastern China; LS: the populations of Lushan China; Ura-sugi: the populations of the Japan Sea coast; Omote-sugi: the populations of the Pacific coast.

圖5 柳杉屬種群地理距離與遺傳距離相關(guān)性檢驗(yàn)Fig. 5 Geographical distance against genetic distance for the Cryptomeria populationsa: 柳杉屬種群; b: 柳杉種群(除廬山LS); c: 日本柳杉種群。a: Cryptomeria populations; b: C. japonica var. sinensis populations (except LS); c: C. japonica var. japonica populations.

2.3 種群歷史動(dòng)態(tài)

為闡明柳杉屬樹種的種群歷史動(dòng)態(tài)，根據(jù)STRUCTURE與DAPC分析結(jié)果，按不同的基因庫(kù)分2步對(duì)其種群歷史進(jìn)行模擬分析。當(dāng)K=2時(shí)，3個(gè)進(jìn)化事件的后驗(yàn)概率(PP)分別為0.994 9，0.005 0和0.000 1，事件1為最優(yōu)事件，即柳杉和日本柳杉在t1(1 010代)時(shí)從同一祖先種群分化而來，其有效種群分別為N1= 3 880；N2= 9 240；NA= 92 (圖6)。當(dāng)K=4時(shí)，最優(yōu)事件為3 (PP=0.991 9)，即中國(guó)東南部種群(CHS)、中國(guó)廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi)由同一祖先種群分化而來，分化時(shí)間t1為1 140代，其有效種群分別為N1= 3 820；N2= 7 840；N3= 4 850；N4= 7 350；NA= 44.6 (圖7、表5)。

圖6 基于近似貝葉斯算法的柳杉屬進(jìn)化事件模型(K = 2)Fig. 6 The scenarios of Cryptomeria populations based on Approximate Bayesian Computation (K = 2)CHN: 柳杉種群; JAN: 日本柳杉種群; PP: 事件的后驗(yàn)概率; t1: 事件的分化代數(shù); N1, N2, NA: 有效種群的大小。CHN: C. japonica var. sinensis; JAN: C. japonica var. japonica; PP: the posterior probability of scenario; t1: the generation of scenario; N1, N2, NA: the size of effective population.

圖7 基于近似貝葉斯算法的柳杉進(jìn)化事件模型(K = 4)Fig. 7 The scenarios of Cryptomeria populations based on Approximate Bayesian Computation (K = 4)CHS: 中國(guó)東南部種群; LS: 中國(guó)廬山種群; Ura-sugi: 日本海沿岸種群; Omote-sugi: 太平洋沿岸種群; t1, t2, t3: 事件的分化代數(shù); N1, N2, N3, N4, NA: 有效種群的大小。CHS: the populations of Southeastern China; LS: the populations of Lushan China; Ura-sugi: the populations of the Japan Sea coast; Omote-sugi: the populations of the Pacific coast; t1, t2, t3: the generation of scenario; N1, N2, N3, N4, NA: the size of effective population.

表5 基于DIY ABC的各進(jìn)化事件的后驗(yàn)分布的中值估計(jì)(K = 4)Tab.5 Median estimation of posterior distributions for each scenario based on DIY ABC (K = 4)

3 討論

3.1 種群遺傳多樣性與遺傳分化

本研究表明，柳杉屬樹種的遺傳多樣性水平中等(Ho= 0.472，He= 0.488)，其值低于杉木(Cunninghamialanceolata) (He= 0.687) (李霞等，2020) 和長(zhǎng)苞冷杉(Abiesgeorgei) (He= 0.751) (程小毛等，2016)，但高于水松(Glyptostrobuspensilis) (Ho= 0.317，He= 0.272) (Wuetal.，2019) 、臺(tái)灣杉(Taiwaniacryptomerioides) (Ho= 0.231，He= 0.370) (李江偉，2014) 等杉科孑遺植物。種群間存在較高的遺傳分化(FST= 0.136)，可分為柳杉和日本柳杉2個(gè)地理種群。柳杉具有遺傳多樣性低、種群間遺傳分化大、基因流小的特點(diǎn)(Na= 4.571，Ho= 0.442，F(xiàn)ST= 0.121)。

植物遺傳多樣性會(huì)受繁育系統(tǒng)、遺傳漂變、基因流和人為干擾等因素的影響 (文亞峰等，2010)，近交繁殖、遺傳漂變、基因流受限、種群規(guī)模變小都會(huì)導(dǎo)致遺傳多樣性的降低。和日本柳杉相比較，柳杉表現(xiàn)出明顯的近交繁殖特性(FIS= 0.123)，種群間基因流十分有限(Nm= 1.816)，遠(yuǎn)低于日本柳杉的基因流指數(shù)(Nm= 8.679)，更低于針葉樹種基因流平均值(Nm> 3) (Ledig，1998)?？紤]到86.37%的變異發(fā)生在種群內(nèi)，我們認(rèn)為有限的基因流以及由此所導(dǎo)致的近交繁殖是造成柳杉遺傳多樣性低的主要原因。根據(jù)Cai等(2020)的研究結(jié)果，柳杉的種群數(shù)量自中更新世以來呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，而全新世以來人類活動(dòng)的增強(qiáng)使柳杉生境片斷化日趨嚴(yán)重，這些因素進(jìn)一步加劇了其遺傳多樣性的衰減。相比較而言，日本柳杉天然林分布廣泛，且得到了較好地保護(hù)，人為干擾少，保持了較高的遺傳多樣性。日本島中部的山地阻隔，太平洋和日本海兩側(cè)環(huán)境氣候的差異，從而導(dǎo)致日本柳杉種群產(chǎn)生了顯著的遺傳分化，分為Omote-sugi和Ura-sugi兩個(gè)地理變種 (Kojo, 1987； Tsumuraetal.，2007, 2012, 2014)，本文基于東亞地區(qū)全域的柳杉屬種群研究也支持這一結(jié)論。

3.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)

從STRUCTURE分析結(jié)果可看出，除中國(guó)廬山種群(LS)外，與其地理來源一致，所有柳杉屬樹種種群可分為柳杉和日本柳杉2個(gè)地理種群(K= 2)，DAPC分析結(jié)果則分為更明顯的4個(gè)譜系，分別是中國(guó)東南部種群(CHS)、中國(guó)廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi)?；贔ST的NJ聚類結(jié)果，日本柳杉種群間有較近的親緣關(guān)系，而柳杉種群間的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，顯示出松散的聚類關(guān)系，分布地之間互有交叉。地理隔離(IBD)分析結(jié)果很好地證實(shí)了這一點(diǎn)，柳杉種群的地理距離與遺傳距離間相關(guān)性不顯著，而分布范圍較小的日本柳杉種群則存在地理隔離現(xiàn)象。

一般來說，如果沒有強(qiáng)烈的人為干擾和選擇作用，植物會(huì)表現(xiàn)出明顯的地理隔離。柳杉種群IBD消失的原因可能與人為干擾有關(guān)，古代頻繁的貿(mào)易活動(dòng)和長(zhǎng)期人工栽培為遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移提供了可能，從而使不同地理起源的柳杉種群產(chǎn)生了混雜。令人驚奇的是中國(guó)廬山種群(LS)并未歸入柳杉聚類群，而是與日本柳杉有更近的親緣關(guān)系。Cai等 (2020)認(rèn)為中國(guó)廬山種群是日本柳杉引種而來，也有研究表明日本柳杉在20世紀(jì)初首先在廬山引種成功 (沈作奎等，2004)。但從我們分析結(jié)果來看，中國(guó)廬山種群不僅具有最高的遺傳多樣性，而且該種群的私有等位基因豐富度也顯著高于日本柳杉，且DAPC分析進(jìn)一步顯示，中國(guó)廬山種群雖歸入日本柳杉類群，但仍與日本柳杉的兩個(gè)譜系Omote-sugi和Ura-sugi有較遠(yuǎn)的遺傳距離。因此，關(guān)于中國(guó)廬山種群的起源和來源值得進(jìn)一步深入研究。

3.3 種群進(jìn)化歷史

DIY ABC基于近似貝葉斯算法估算種群分化時(shí)間和有效種群數(shù)量。不同基因庫(kù)(K= 2和K= 4)模擬分析結(jié)果共同顯示： 柳杉屬是由同一祖先種群(NA)分化而來，兩組進(jìn)化事件所對(duì)應(yīng)的分化時(shí)間也較為一致，分別為1 010代(K= 2)和1 140代(K= 4)。柳杉通常需要20-30年開花結(jié)實(shí)，自然條件下，由于光照，林間郁閉等因素影響，其開花結(jié)實(shí)時(shí)間會(huì)有所推遲。參考日本柳杉研究結(jié)果 (Kimuraetal.，2014； Tsumuraetal.，2020)，設(shè)定柳杉的自然更新時(shí)間為100～300年，最優(yōu)進(jìn)化事件所對(duì)應(yīng)的種群分化時(shí)間在11萬～34萬年前，即柳杉和日本柳杉的最早分化時(shí)間發(fā)生在34萬年前，結(jié)果與日本柳杉不同種群的分化時(shí)間大致相同 (Moriguchietal.，2019)。柳杉作為第三紀(jì)孑遺植物，其種的形成和分化可追溯至108.1百萬年前，但其譜系分化時(shí)間僅只有34萬年，類似于“活化石”銀杏 (Ginkgobiloba) (Hohmannetal.，2018)，其現(xiàn)存種群的譜系分化時(shí)間也僅39萬年，表現(xiàn)為古老的孑遺種，年輕的譜系分化。根據(jù)化石資料，柳杉在侏羅紀(jì)晚期或更早起源于東亞東北地區(qū) (于永福，1995)，隨后擴(kuò)散至歐洲和北美各地，第三紀(jì)晚期和第四紀(jì)冰期的全球氣候變化導(dǎo)致柳杉在歐洲和北美相繼滅絕，僅在東亞有所保留，成為著名的第三紀(jì)孑遺植物。第四紀(jì)冰期的氣候變化對(duì)其種群分化和種群數(shù)量產(chǎn)生了顯著影響 (Tsumuraetal.，2020)。我們認(rèn)為，11萬～34萬年前受第四紀(jì)三次亞冰期(廬山亞冰期)的影響，東亞地區(qū)柳杉種群數(shù)量迅速減少，退縮至中國(guó)東南部和日本西南部的避難所，分化為柳杉和日本柳杉種群，后隨著間冰期的到來，海平面的上升使東海作為地理屏障隔離并加劇了東亞地區(qū)柳杉譜系間的分化。在此期間，第四紀(jì)亞冰期多次暴露的東海陸橋 (200萬～130萬年前，20萬～1.5 萬年前) 起到了“擴(kuò)散廊道”的作用，為柳杉和日本柳杉提供了二次接觸的機(jī)會(huì)。中國(guó)-日本植物區(qū)系中的很多植物，如蛛網(wǎng)萼(Platycraterarguta) (Qietal.，2014) 、領(lǐng)春木屬(Euptelea) (Caoetal.，2016)、黃山梅屬(Kirengeshoma) (Qiuetal.，2009； Yuanetal.，2014)也存在這種現(xiàn)象。綜合現(xiàn)有證據(jù)，中國(guó)廬山種群可能是冰期避難所交匯地的殘存種群，也可能是日本柳杉引種的結(jié)果 (Caietal.，2020)，還需要后續(xù)更深入的研究。

3.4 柳杉屬的分類及其科學(xué)保護(hù)

種群進(jìn)化歷史分析表明，雖然柳杉屬樹種起源古老，但柳杉和日本柳杉的譜系分化時(shí)間并不是很長(zhǎng)，地理隔離使2個(gè)種群之間產(chǎn)生了一定程度的遺傳變異和分化，但對(duì)于物種形成而言，34萬年的遺傳分化尚不足以形成新種。根據(jù)“整合物種概念”(劉建全，2016)，我們認(rèn)為柳杉和日本柳杉屬于分化路上的姊妹種。與日本柳杉相比較，柳杉資源豐富，但總體遺傳多樣性不高，天然林破壞嚴(yán)重，使其遺傳資源亟待有效保護(hù)。浙江省天目山種群(XTM)擁有最著名、保存最好的柳杉種群，在中國(guó)東南部柳杉種群中遺傳多樣性最高(Ho= 0.508)，福建天寶巖(TBY)和福建武夷山種群(WYS)存在較多私有等位基因，種群變異特殊，應(yīng)作為核心種群予以重點(diǎn)保護(hù)。安徽黃山(WT)、福建天寶巖高海拔地區(qū)(TB)以及福建南平(YTG)種群數(shù)量少，遺傳多樣性低，需優(yōu)先予以保護(hù)。針對(duì)其他散生柳杉資源或人工林，應(yīng)采取就地和遷地保護(hù)相結(jié)合的措施，通過建立保護(hù)小區(qū)的方式，加強(qiáng)管理，減少人類活動(dòng)干擾。同時(shí)，加強(qiáng)種質(zhì)資源的保護(hù)和收集，特別是大樹、古樹和風(fēng)水林種群，以達(dá)到保護(hù)遺傳多樣性的目的。

4 結(jié)論

柳杉屬樹種可分為柳杉和日本柳杉2個(gè)地理種群，以及中國(guó)東南部種群(CHS)、中國(guó)廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi) 4個(gè)遺傳譜系。柳杉屬的總遺傳多樣性中等，種群間存在較高的遺傳分化。柳杉和日本柳杉是由同一祖先種群在11萬～34萬年前同時(shí)分化而成，分化后兩個(gè)地理種群擁有各自獨(dú)立的進(jìn)化路線。第四紀(jì)氣候變化、地理隔離和全新世以來的人為干擾是東亞地區(qū)柳杉遺傳變異格局形成的主要原因。與日本柳杉相比較，柳杉資源豐富，但總體遺傳多樣性不高，天然林種群破壞嚴(yán)重，亟待科學(xué)有效保護(hù)。