尚佳州 高鈿惠 王衛(wèi)鋒 周新軍 宗毓錚

(1.山西農(nóng)業(yè)大學林學院 晉中 030801； 2.山西省桑干河楊樹豐產(chǎn)林實驗局科技服務中心 朔州 038300；3.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院 晉中 030801)

礦質(zhì)肥料施用、生物質(zhì)燃燒等人類活動，導致輸入到生物圈的氮快速增加(馮繼廣等, 2020)，目前，我國已成為繼歐美之后第三大氮沉降區(qū)，且高氮沉降區(qū)正從東南向西北逐漸蔓延(Yuetal., 2019)。施氮或氮沉降會使生態(tài)系統(tǒng)中氮有效性提高，緩解氮匱乏溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的氮限制(Schulte-Uebbingetal., 2018)，影響樹木生長以及木材特性(Borghettietal., 2017)。但長期氮增加會導致土壤酸化并降低植物和土壤微生物多樣性(Payneetal., 2017; Wangetal., 2018)。從樹木個體和器官尺度，開展碳氮分配、光合作用、水分傳輸?shù)确矫嫜芯?，對揭示樹木響應氮添加的機制有重要意義(馮繼廣等, 2020)。

土壤氮虧缺時，樹木可將更多光合產(chǎn)物分配于根系以增強氮吸收能力，當?shù)砑犹岣咄寥烙行У亢?，碳同化物更多分配于起支持和運輸作用的主莖和側(cè)枝，導致個體根冠比降低(李德軍等, 2005a; 吳茜等, 2011; 劉洋等, 2013)。氮添加可提高土壤有效氮含量并促進個體生長，但該促進作用存在閾值效應(H?gbergetal., 2006)。如氮添加量超過100 kg·hm-2a-1，水曲柳(Fraxinusmandshurica)個體生長會受到抑制(Wangetal., 2016)，且個體生長的閾值效應也存在種間差異。樹木體內(nèi)非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(nonstructural carbohydrate, NSC)對其生長代謝、抗寒防御甚至存活具有重要作用(Hartmannetal., 2016)，而NSC儲存及其根、莖、葉器官間分配對氮添加的響應與樹種有關(guān)。低氮下，長序榆(Ulmuselongata)葉中NSC積累較多；高氮下，NSC則多積累于根、莖中，這表明高氮可促進其葉片NSC向根和莖轉(zhuǎn)移(洪琮浩等, 2020)。上述研究中氮添加通常在春季或夏季進行，秋季適量氮添加也可顯著提高三倍體毛白楊(triploidPopulustomentosa)根系氮儲存和NSC積累，促進第2年造林后個體生長，但過量氮添加則會降低其造林后成活率(王苗苗等, 2021)。氮添加下葉片NSC積累可能是氮素促進葉片含氮量、光合色素及光合酶含量增加，從而增強葉片光合作用(Nakajietal., 2002)，而氮添加對樹木葉片光合作用的促進作用也存在閾值(王芳等, 2017)，過量氮添加可造成葉片營養(yǎng)元素比例失衡(李德軍等, 2005b)，進而導致葉片光合作用受抑制(張璐等, 2020)。低劑量氮添加可明顯提高紅松(Pinuskoraiensis)和紫椴(Tiliaamurensis)的葉綠素含量和凈光合速率，超過46 kg·hm-2a-1后的促進作用會減弱(孫金偉等, 2016)。過量氮添加下樹木葉片光合作用通常會受到抑制并限制生長，進一步明確該現(xiàn)象的生理生態(tài)原因有助于闡明樹木對氮添加的響應機制并預測全球變化下的森林生產(chǎn)力(馮繼廣等, 2020)。

楊樹(Populus)在我國人工林建設中具有重要地位，也是樹木生物學研究的模式樹種(Galvezetal., 2011)。傳統(tǒng)施肥和滴灌下,楊樹人工林的施氮技術(shù)參數(shù)已有系統(tǒng)研究(席本野等，2017)，但過量施氮后發(fā)生肥效降低甚至生長受抑制現(xiàn)象的原因尚不清楚?！薪饤?號’(P.×euramericana‘Zhongjin7’)是在山西金沙灘以美洲黑楊(P.deltoides)為母本、青楊(P.cathayana)為父本雜交選育的無性系良種，具有速生豐產(chǎn)、抗逆性強等特性，是半干旱地區(qū)新一代先鋒樹種(李文榮等, 2008)。本研究以‘中金楊7號’扦插幼苗為材料，探究連續(xù)2年不同強度氮添加對葉片光合特性、各器官生物量及NSC積累和分配的影響，明確過量氮添加下楊樹在碳氮分配、光合作用等方面的響應機制，以期為未來氮沉降下楊樹人工林精準施肥措供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

盆栽試驗在山西中部晉中盆地東北部山西農(nóng)業(yè)大學林業(yè)站(37°25′47″N，112°34′44″E)進行，海拔796 m，屬暖溫帶大陸性氣候，年均日照時數(shù)2 527.5 h，年均氣溫10.4 ℃，年均降水量397.1 mm，年均蒸發(fā)量1 649 mm，無霜期176天。

1.2 試驗設計

1.2.1 扦插育苗 2019年3月底，選取‘中金楊7號’(以下簡稱中金楊)1年生萌條，剪成15 cm長插穗扦插于高35 cm、直徑30 cm的塑料桶中，每桶1株。塑料桶置于透光遮雨棚下，以排除降雨和氮沉降對土壤的干擾。桶底平鋪1層直徑2～3 cm的小石子，石子上覆蓋2層報紙后每桶裝15 kg風干過篩土，土壤為林業(yè)站內(nèi)表層砂質(zhì)壤土，其基本理化性質(zhì)為： pH8.29，有機質(zhì)含量14.64 g·kg-1、全鹽量0.097%、全氮含量1.06 g·kg-1、有效氮含量48.76 mg·kg-1、有效磷含量9.57 mg·kg-1、速效鉀含量123.3 mg·kg-1、田間持水量26.94%。從插入石子中的塑料管澆水以防止土壤板結(jié)，每天傍晚稱重澆水以控制土壤含水量為田間持水量的75%±5%。

1.2.2 分組處理 萌芽后緩苗1個月左右，選取長勢一致的中金楊扦插苗40株，設計單因素隨機區(qū)組試驗，基于山西中部3 g·m-2a-1的總氮沉降強度(Yuetal., 2019)，以NH4NO3為氮源設置4個氮添加梯度： CK(0 g NH4NO3·plant-1a-1)、 N3(3 g NH4NO3·plant-1a-1)、N6(6 g NH4NO3·plant-1a-1)和N9(9 g NH4NO3·plant-1a-1)，分別相當于0、3、6、9 g·m-2a-1的氮沉降強度，每組10株重復隨機分布； 所有塑料桶按株行距50 cm×120 cm放置，以便透光和澆水。NH4NO3于5月初開始每10天1次共3次添加，每次將NH4NO3按株稱重后溶于水，傍晚澆水時施入桶中。2020年再次進行氮添加處理，施氮時間、施氮量和施氮方法與2019年相同。

1.2.3 指標測定 2020年8月19—21日、測定氣體交換和葉綠素熒光參數(shù)，隨后測定葉綠素含量和氣孔特征參數(shù)等指標； 10月底收獲植株，并測定生物量和碳氮含量等指標。

1.3 試驗方法

1.3.1 氣體交換參數(shù) 晴朗天氣上午10:00—11:00，每組隨機選取6～8株，每株分別在頂梢和側(cè)枝上選取1片健康功能葉，采用便攜式光合儀(Li-6400XT, Li-COR, USA)測定其凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(gs)和蒸騰速率(E)等指標。儀器參數(shù)設定為紅藍光源光強1 500 μmol·m-2s-1，葉溫28 ℃，流速500 μmol·s-1。計算葉片瞬時水分利用效率(water use efficiency, WUE)=Pn/E。

1.3.3 葉綠素含量 每組隨機選取5株，每株選取頂梢枝1片健康功能葉，采用乙醇提取比色法測定葉綠素a和葉綠素b含量(王學奎等, 2015)。

1.3.4 葉片厚度與氣孔特性 每組隨機選取5株，每株選取頂梢枝2片健康功能葉，在中間部位剪取1 cm2方塊用FAA固定，石蠟切片后測量葉片厚度； 暗適應20 min左右在葉中間部位用指甲油印跡法獲得氣孔印跡后使用Olympus BX51顯微鏡拍照，每個葉片分別在10倍和40倍物鏡下拍攝10張圖片，測量約200個保衛(wèi)細胞長度，統(tǒng)計氣孔密度。

1.3.5 生長指標測定 采用卷尺和游標卡尺測量株高、側(cè)枝長度和地徑； 使用掃描儀(DS-50000, EPSON, JPN)掃描葉片后用ImageJ軟件測量頂梢的單葉面積(leaf area, LA)，各處理均為5株重復，每株選取3片功能葉，105 ℃殺青1 h后于75 ℃烘至恒質(zhì)量，稱量其干質(zhì)量，分別計算單葉凈光合速率(net photosynthesis per leaf)和比葉質(zhì)量(leaf mass per area, LMA)。2020年10月底落葉后收獲植株時，先將根沖洗干凈，整株分為根、主莖和側(cè)枝3部分，分別105 ℃殺青1 h后于75 ℃烘至恒質(zhì)量，稱重并計算整株總干質(zhì)量、根冠比以及器官干物質(zhì)分配比例。將各器官干樣粉碎過200目篩，采用苯酚-硫酸法測定可溶性糖和淀粉含量(Landh?usseretal., 2018)，重鉻酸鉀氧化法測定全碳含量，凱氏定氮法測定全氮含量(王學奎等, 2015)，計算單位葉面積氮含量(leaf nitrogen per unit area,Narea)=葉氮含量×LMA，光合氮利用效率(photosynthetic nitrogen use efficiency, PNUE)=Pn max/Narea。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel2013軟件進行數(shù)據(jù)整理。利用SPSS 18.0軟件(IBM, Chicago, USA)先對數(shù)據(jù)進行初步檢驗，保證數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性，后用單因素ANOVA進行方差分析，LSD檢驗進行多重比較(P<0.05)。采用Sigmaplot 12.5軟件(Systat Software, SanJose, USA)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中金楊幼苗葉光合特性對氮添加的響應

連續(xù)2年氮添加后，中金楊幼苗頂梢葉單位葉面積的Pn降低，N9處理的Pn顯著低于CK(F=4.14;P=0.037)； 側(cè)枝葉單位葉面積的Pn表現(xiàn)出明顯促進，N6處理下Pn最大，N9處理的Pn顯著低于N6(F=10.23;P=0.026)，且與N3處理無顯著差異。頂梢和側(cè)枝的gs和Ci隨氮添加量增加均呈下降趨勢，而WUE顯著增大，表明氮添加下葉肉細胞利用CO2的能力增強、氣孔關(guān)閉并導致葉片用水效率提高(圖1)。

圖1 連續(xù)2年氮添加對中金楊幼苗頂梢和側(cè)枝葉氣體交換參數(shù)的影響(n=5)Fig. 1 Leaf gas exchanges of top and lateral branches in hybrid poplar (P. × euramericana ‘Zhongjin7’) seedlings after 2 years’ nitrogen addition數(shù)值為平均值±標準誤，不同小寫字母代表處理間存在顯著差異(LSD檢驗，P<0.05)，下同。Values are mean ± SE. Different lowercase letter means significant difference among treatments (LSD test; P<0.05). The same below.

隨著氮添加量增加，基于鮮質(zhì)量的葉綠素a含量(F=15.44;P=0.001)和葉綠素b含量(F=18.59;P=0.001)均顯著增加。N6和N9處理的葉綠素a含量較CK分別增加42.3%和53.6%，N3、N6和N9處理的葉綠素b含量較CK分別增加20.2%、46.2%和56.4%，且N6和N9顯著高于N3處理(表1)，這表明中金楊幼苗葉片葉綠素含量并未隨氮添加量增加而呈現(xiàn)下降趨勢。

表1 連續(xù)2年氮添加對中金楊幼苗葉片葉綠素含量的影響(n=5)Tab.1 Leaf chlorophyll content changes in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

3個氮添加處理中金楊頂梢枝功能葉的Fv/Fm與對照無顯著差異； N3和N6處理的ФPSⅡ(F=7.44;P=0.005)和ETR(F=7.64;P=0.005)均顯著低于CK，而N9處理與CK無顯著差異； NPQ的變化趨勢與之相反； 4個處理的qP無顯著變化。以上結(jié)果表明，N3和N6處理下光反應階段實際量子產(chǎn)量低于CK，且由于N3和N6處理的NPQ增加，導致供給暗反應的還原力下降； 而N9處理下光反應供給的還原力與CK相同(表2)。

表2 連續(xù)2年氮添加對中金楊幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響(n=5)Tab.2 Chlorophyll fluorescence parameter changes in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

連續(xù)2年氮添加后，中金楊頂梢功能葉N3和N6處理的單葉面積和單葉干質(zhì)量顯著高于CK，而N9處理與CK相同； N9處理的LMA較CK顯著降低(圖1A)； 葉氮含量(F=15.92;P<0.001)和單位葉面積氮含量(F=6.84;P=0.004)均隨氮添加量增加顯著增大； 由于其Pn呈下降趨勢，導致PNUE持續(xù)顯著降低。N6和N9處理的上、下表皮氣孔密度均顯著高于CK，氣孔長度則顯著低于CK，表明高氮添加下中金楊葉片變薄且氣孔變小變密(表3)。

表3 連續(xù)2年氮添加對中金楊幼苗頂梢葉經(jīng)濟性狀與氣孔特性的影響(n=15)Tab.3 Leaf economic and stomatal traits changes in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

2.2 中金楊幼苗生長與器官干物質(zhì)積累對氮添加的響應

氮添加第1年，中金楊幼苗株高和地徑顯著增加； 第2年株高增量僅N3和N6處理顯著高于CK，N9處理與CK無差異，4個處理地徑增量無顯著差異。氮添加后側(cè)枝數(shù)和側(cè)枝總?cè)~片數(shù)也顯著增加，表明氮添加對側(cè)枝和側(cè)枝葉片生長具有促進作用，而氮添加未增加頂梢葉片數(shù)。氮添加2年后，根干質(zhì)量(F=3.90;P=0.040)、主莖干質(zhì)量(F=77.35;P<0.001)和側(cè)枝干質(zhì)量(F=5.22;P=0.020)均顯著高于CK，但N9處理的主莖干質(zhì)量顯著低于N3和N6處理。連續(xù)2年氮添加后植株根莖總干質(zhì)量隨施氮量增加呈先升后降趨勢，N9處理仍顯著高于CK(表4)。

表4 連續(xù)2年氮添加對中金楊幼苗生長與器官干物質(zhì)積累的影響(n=5)Tab.4 Growth and organ dry matter accumulation in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

氮添加2年后，中金楊幼樹典型植株主莖和側(cè)枝的拓撲圖如圖2所示，隨氮添加量增加，持續(xù)促進側(cè)枝萌芽和伸長生長，而頂梢生長則表現(xiàn)閾值效應。

圖2 連續(xù)2年氮添加中金楊幼樹典型植株主莖與側(cè)枝的拓撲圖Fig. 2 Topological diagrams of typical poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

氮添加后根生物量分配比例顯著低于CK(F=5.24;P=0.020)，符合最優(yōu)生長理論，主莖生物量分配比例則顯著高于CK(F=4.60;P=0.029)； 但隨著氮添加量增加，N3、N6和N9處理間根和莖干物質(zhì)分配比例并無顯著差異； 氮添加后側(cè)枝生物量分配比例均值略有增大但與CK無顯著差異(圖3)。

圖3 連續(xù)2年氮添加對中金楊根莖枝生物量分配比例的影響Fig. 3 Biomass distribution percentage changes in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

氮添加2年后，葉可溶性糖含量(F=9.34;P=0.005)顯著高于CK； N9處理的葉片淀粉含量顯著低于N6處理(F=10.03;P=0.001)； 隨著氮添加量增加，主莖木材的淀粉含量(F=9.50;P=0.003)顯著降低； 樹皮可溶性糖積累而根可溶性糖含量略有降低，可能與根氮同化和生長增強消耗較多同化物有關(guān)(圖4)。

圖4 連續(xù)2年氮添加對中金楊幼苗各器官NSC含量的影響(n=3)Fig. 4 Organ NSC content changes in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

隨著氮添加量增加，中金楊葉(F=45.50;P<0.001)和根(F=12.23;P=0.002)全氮含量顯著增加； N3和N6處理的主莖木材和樹皮、N3處理的側(cè)枝全氮含量顯著低于CK，N6和N9處理的側(cè)枝含氮量顯著高于CK(圖5A)。N9處理的碳氮比在側(cè)枝(F=15.84;P<0.001)和根(F=10.96;P=0.001)顯著低于CK(圖5B)。 結(jié)合前述光合作用和生物量結(jié)果分析可知，即使有超出體內(nèi)生理代謝的氮需求量，高氮處理下中金楊葉和根等部位仍在吸收并同化氮素。

圖5 連續(xù)2年氮添加對中金楊幼苗各部位碳氮比的影響(n=4)Fig. 5 C/N changes of different positions in poplar seedlings after 2 years’ nitrogen addition

3 討論

3.1 頂梢和側(cè)枝葉光合特性對氮添加的響應機制

低劑量氮添加可提高葉片光合酶含量和光合速率，促進植株生物量積累。本研究連續(xù)2年氮添加后，中金楊幼苗頂梢和側(cè)枝功能葉雖然均表現(xiàn)出氣孔關(guān)閉和WUE升高，但其凈光合速率對氮添加表現(xiàn)出不同響應趨勢。中低劑量氮添加下頂梢葉葉面積增大、葉綠素和氮含量增加、氣孔變小變密，在促進根莖葉生物量積累的同時，使葉中淀粉和可溶性糖積累顯著提高，反饋抑制了光系統(tǒng)量子產(chǎn)量、電子傳遞以及凈光合速率，表現(xiàn)出明顯的庫限制。隨施氮量增加，黃麻(Corchoruscapsularis)葉片光呼吸速率持續(xù)增大，且光呼吸可為葉內(nèi)硝酸還原過程提供還原力(陳錦強等, 1983)。本研究中，相比于中低劑量氮添加處理，高劑量氮添加處理葉片淀粉含量降低、光量子產(chǎn)量和電子傳遞速率升高葉片氮含量增加，表明高氮下中金楊葉肉細胞內(nèi)硝酸同化過程可能消耗了大量的光反應還原力以及暗反應的碳同化物(Bloom, 1997; 2015)，競爭用于光合作用的還原力，進而造成葉內(nèi)淀粉含量減少，光合速率呈下降趨勢。這一過程也可能是高劑量氮添加處理下側(cè)枝葉凈光合速率下降的原因； 而中低劑量氮添加處理下，側(cè)枝生長量明顯高于CK，且可溶性糖和淀粉積累并無明顯增加，表明此時未發(fā)生庫限制，因此側(cè)枝葉片凈光合速率顯著增大。

3.2 過量氮添加對中金楊同化物分配的調(diào)控機制

氮添加第1年，中金楊幼苗株高和地徑顯著增大，高劑量氮添加處理未表現(xiàn)出生長抑制。氮添加2年后，中低劑量氮添加處理的單葉、莖和根生物量積累均顯著增加，而根的生物量比例降低，這符合最優(yōu)分配理論，但也可能是由于土壤NH4+濃度增大抑制根尖伸長和根系生長(Brittoetal., 2002)。高劑量氮添加處理的側(cè)枝生長量仍然最高，單葉干質(zhì)量、頂梢長和主莖分別比中低劑量氮添加處理降低25.8%、13.7%和13.1%，而根干質(zhì)量無顯著下降，即從形態(tài)學上端向下端降低比例逐漸變?。?單葉面積和凈光合速率均顯著低于中低劑量氮添加處理，表明此時中金楊頂梢、主莖和根系生長處于源限制。長期高劑量氮添加下，美洲黑楊人工林土壤外生菌根真菌物種豐富度和侵染率均顯著下降(Yangetal., 2021)，這可能是由于宿主樹木根系向真菌的碳投資減少所致，與本文高劑量氮添加下中金楊生長處于源限制的結(jié)果一致。低量滴灌施氮可顯著增加美洲黑楊(Leeetal., 2005)和毛白楊(席本野等, 2017)地上部生物量和林分生產(chǎn)力，而高施氮量則不明顯，本研究的盆栽試驗結(jié)果可從生理生態(tài)角度解釋該現(xiàn)象。另外，過量氮添加下小葉楊(P.simonii)葉和根中生長素含量降低而脫落酸含量升高(Luoetal., 2015)，過量NO3-可競爭性抑制硝酸轉(zhuǎn)運蛋白NRT1.1對生長素的運輸(Krouketal., 2010)。因此，頂梢生長素合成和運輸降低可能是本研究中高氮抑制頂梢生長、促進側(cè)枝生長以及葉氣孔密度增加的原因之一。今后可進一步研究過量氮添加下的莖尖生長素合成、葉片硝酸鹽同化、碳同化物裝載與卸載及其關(guān)系，以深入揭示氮添加下中金楊的碳氮關(guān)系響應機制。

4 結(jié)論

連續(xù)2年中低劑量氮添加顯著促進中金楊幼苗根莖葉器官生長，而根冠比降低，由于庫限制使得葉中非結(jié)構(gòu)性碳積累顯著增加并負反饋限制頂梢葉片光合作用； 由于側(cè)枝生長受到顯著促進，使得中、低劑量氮添加下側(cè)枝葉片光合作用顯著提高。高劑量氮添加處理下，葉片光合作用顯著低于中氮處理，可能由于葉片氮同化過程增強而競爭光合作用的還原力。生長素合成和運輸降低可能是高劑量氮添加處理下中金楊頂端優(yōu)勢弱化及碳氮分配變化的重要原因。