王靜 邵小美 譚德倫

肺癌是較普遍的惡性腫瘤，是最常見的全球癌癥相關(guān)死亡原因[1]。由于缺乏早期臨床癥狀，大多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已為晚期，失去了最佳治療時(shí)期。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌最常見的亞型，包括大細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，約占肺癌的85%[2]。不良飲食、吸煙、職業(yè)暴露和遺傳易感性是非小細(xì)胞肺癌的主要危險(xiǎn)因素[3]。盡管臨床治療手段已取得一定進(jìn)展，但NSCLC患者預(yù)后仍較差，5年生存率較低。耐藥性、腫瘤轉(zhuǎn)移等是治療NSCLC的主要障礙[4]。因此，亟待研究NSCLC病理機(jī)制和尋找新的治療策略。環(huán)狀RNA(circRNAs)是一種新型單鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，具有序列保守、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高和特異性高等特點(diǎn)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，沉默circ_0000218可抑制喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。circ_0000218高表達(dá)與大腸癌T分期和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加相關(guān)，下調(diào)circ_0000218可抑制大腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[7]。過表達(dá)circ_0000218可促進(jìn)腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。下調(diào)circ_0000218可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[9]。然而，circ_0000218在NSCLC中的作用筆者尚未見報(bào)道。Circinteractome預(yù)測顯示，circ_0000218與miR-1278 之間存在核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。有研究報(bào)道，miR-1278在肺癌細(xì)胞中低表達(dá)[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究circ_0000212在NSCLC中的作用以及其是否通過調(diào)控miR-1278表達(dá)影響NSCLC細(xì)胞H1299的增殖、遷移和侵襲。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2017年1月至2019年1月經(jīng)病理檢測為肺癌患者30例，獲得原發(fā)性肺癌組織及相應(yīng)癌旁組織，患者均知情且同意，手術(shù)切除后立即將樣本保存在-80℃。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 材料 肺癌細(xì)胞株H1299購自購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；Trziol、反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑購自美國Thermo Fisher公司；MTT 試劑盒購自美國Sciencell公司；Transwell小室日本Chemicon公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對數(shù)生長期H1299細(xì)胞，將si-NC、si-circ_0000218、miR-NC、miR-1278分別轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞，記為si-NC組、si-circ_0000218組、miR-NC組、miR-1278組；將si-circ_0000218分別與anti-miR-NC、anti-miR-1278共轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞，記為si-circ_0000218+anti-miR-NC組、si-circ_0000218+anti-miR-1278組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，circ_0000218和miR-1278分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5 MTT 取各組H1299細(xì)胞(2.5×104個(gè)/ml)，接種于96孔板(100 μl/L)，培養(yǎng)48 h后，加入MTT溶液20 μl/孔，培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO 150 μl/孔，室溫震蕩孵育5 min，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值。

1.6 Transwell 將各組H1299細(xì)胞接種于Transwell小室上室(5×104個(gè)/孔)，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液600 μl，在37℃下孵育24 h后，用棉簽擦去未穿膜細(xì)胞。多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。置于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.7 免疫印跡法(Western blot) 提取各組H1299細(xì)胞總蛋白，BCA進(jìn)行定量。進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF上，5%脫脂牛奶室溫封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，Image J軟件分析目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建circ_0000218野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-circ_0000218和MUT-circ_0000218，將其分別與miR-NC和miR-1278共轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞中，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 干擾circ_0000218表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-circ_0000218后，si-circ_0000218組circ_0000218表達(dá)水平降低，H1299細(xì)胞的OD值、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平降低，p21表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表1、2，圖1。

圖1 干擾circ_0000218表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響；A 增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)；B 肺癌H1299細(xì)胞的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色×200)

表1 干擾circ_0000218表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.2 circ_0000218和miR-1278在肺癌組織中的表達(dá) 肺癌組織中circ_0000218高于癌旁組織，miR-1278表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.05)。見表3。

表2 干擾circ_0000218表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白的影響

表3 circ_0000218和miR-1278在肺癌組織中的表達(dá)

2.3 circ_0000218靶向調(diào)控miR-1278的表達(dá)(Circinteractome Predicted) Circinteractome的數(shù)據(jù)預(yù)測顯示，circ_0000218與miR-1278之間存在互補(bǔ)核苷酸序列。與轉(zhuǎn)染miR-NC的WT-circ_0000218比較，轉(zhuǎn)染miR-1278的熒光素酶活性降低(P<0.05)；circ_0000218靶向負(fù)調(diào)控miR-1278的表達(dá)(P<0.05)。見表4、5，圖2。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 circ_0000218調(diào)控miR-1278表達(dá)

圖2 circ_0000218的序列中含有與miR-1278互補(bǔ)的核苷酸序列

2.4 過表達(dá)miR-1278對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1278后，miR-1278組miR-1278表達(dá)水平升高，H1299細(xì)胞的OD值、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平降低，p21表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表6、7，圖3。

圖3 過表達(dá)miR-1278對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響;A 增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)；B 肺癌H1299細(xì)胞的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色×200)

表6 過表達(dá)miR-1278對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

表7 過表達(dá)miR-1278對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 下調(diào)miR-1278逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0000218表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 H1299細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染后，si-circ_0000218+anti-miR-1278組miR-1278表達(dá)水平降低，H1299細(xì)胞的OD值、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平升高，p21表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖4，表8、9。

表8 下調(diào)miR-1278逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0000218表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 下調(diào)miR-1278逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0000218表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響；A 增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)；B 肺癌H1299細(xì)胞的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色×200)

3 討論

越來越多研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs的異常表達(dá)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。敲除circ_0003221可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[11]。上調(diào)circ0001686可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[12]。干擾circ_0072088可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。過表達(dá)circ_0030586可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞形成[14]。在甲狀腺乳頭狀癌組織中，circ_0137287表達(dá)降低，其低表達(dá)預(yù)示著低生存率，上調(diào)circ_0137287抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和有氧糖酵解，并誘導(dǎo)凋亡[15]。circ_0069244低表達(dá)與NSCLC患者生存期短和腫瘤組織學(xué)分級差有關(guān)，過表達(dá)circ_0069244抑制NSCLC細(xì)胞增殖和遷移[16]。與上述研究結(jié)果相似，本結(jié)果提示干擾circ_0000218表達(dá)可抑制H1299細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

表9 下調(diào)miR-1278逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0000218表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

研究表明，circ_0000218可作為競爭性內(nèi)源RNAs吸附microRNAs，并調(diào)控其下游基因的表達(dá)[6-8]。本實(shí)驗(yàn)的Circinteractome預(yù)測顯示，circ_0000218與miR-1278之間含有互補(bǔ)核苷酸序列，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，WT-circ_0000218中轉(zhuǎn)染miR-1278的熒光素酶活性顯著降低，且circ_0000218負(fù)調(diào)控miR-1278表達(dá)。眾多研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs與肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為相關(guān)[17]。

有數(shù)據(jù)顯示，miR-637作為一種腫瘤抑制因子，抑制NSCLC的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18]。也有發(fā)現(xiàn)miR-486-5p在NSCLC組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-486-5p通過抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制NSCLC腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[19]。在吉非替尼耐藥NSCLC細(xì)胞中，miR-133a-3p表達(dá)明顯下調(diào)，過表達(dá)miR-133a-3p增加了吉非替尼敏感性[20]。

miR-126-5p在NSCLC組織、順鉑耐藥NSCLC組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-126-5p抑制順鉑耐藥NSCLC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)細(xì)胞順鉑敏感性[21]。過表達(dá)miR-144-3p通過下調(diào)COL11A1表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[22]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，肺癌組織中miR-1278表達(dá)降低；過表達(dá)miR-1278降低了H1299細(xì)胞的OD值、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平，升高了p21水平。提示過表達(dá)miR-1278可抑制H1299細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-1278逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0000218表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，H1299細(xì)胞的OD值、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平升高，p21水平降低。提示circ_0000218可能通過靶向調(diào)控miR-1278表達(dá)影響H1299細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，circ_0000218在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，干擾circ_0000218表達(dá)可能通過靶向上調(diào)miR-1278抑制肺癌H1299細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。circ_0000218可能是新的治療靶點(diǎn)，還有待進(jìn)一步研究。