孫宇潔，常永龍，郭錦晨，吳 凡，張 彎，施衛(wèi)兵

安徽中醫(yī)藥大學(xué)：1.第一臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)專業(yè)；2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室；3.第一附屬醫(yī)院感染科（合肥 230038）

宣白承氣湯組成藥物為生石膏、生大黃、杏仁及瓜蔞皮，該方出自吳鞠通所著《溫病條辨》一書，為吳氏所創(chuàng)的八個新承氣湯之一。以所用藥物而論，方中生大黃藥性苦寒，泄熱通腑、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)；石膏、瓜蔞皮性寒，清熱化痰、利氣寬胸；杏仁味苦而性溫，功可祛痰止咳、降氣平喘兼以通便潤腸。四藥合用，通腑化痰、清熱定喘，一方之中，同時巧妙體現(xiàn)了“肺腸同治”、“上下同治”、“臟腑同治”的辨治思想[1]。已有現(xiàn)代藥理學(xué)實驗研究證實宣白承氣湯可通過“承順胃氣”宣上通下，發(fā)揮通利大腸的作用，可改善COPD 模型大鼠肺功能、減輕肺部炎癥[2]。

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以氣流持續(xù)受限為典型特征的肺部疾病，氣流限制過程不完全可逆，主要累及肺部，也可對肺外器官造成損害[3]。從中醫(yī)學(xué)角度分析，COPD 可歸于“喘病”“哮病”“肺脹”范疇。該病為肺虛不能化津，故以痰濁為早期主要病理因素，后期臟腑虛損不能運化，隨之產(chǎn)生痰飲、瘀血等病理產(chǎn)物[4]。其病理變化可用本虛標(biāo)實四字概括，肺病日久遷延不愈致肺臟虧虛，肺虛漸漸牽累脾腎二臟，加之病人多為老年，正氣素虛，難御外邪，六淫之邪乘虛而入，痰濁、水飲、血瘀等病理因素相互影響，故病程纏綿，遷延難愈。治療上，當(dāng)標(biāo)本兼顧，以宣肺化痰、降逆平喘為治療原則，兼顧溫陽利水。宣白承氣湯方在清肺、肅肺同時采用通腑法，調(diào)暢腸腑氣機。上下一氣，腑氣得通，肺氣得降，咳喘等癥自然得以緩解。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和模擬分子對接技術(shù)，旨在揭示宣白承氣湯“肺腸同治”COPD的具體作用機制，以期為臨床診治COPD 提供借鑒，為宣白承氣湯的進一步應(yīng)用拓展思路。

1 資料與方法

1.1 藥物潛在活性成分及對應(yīng)作用靶點的篩選

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）分別檢索宣白承氣湯組成藥物（石膏、大黃、杏仁、瓜蔞）的化學(xué)成分，由于TCMSP 無石膏的相關(guān)數(shù)據(jù)，故選用TCMID（http://119.3.41.228：8000/tcmid/）數(shù)據(jù)庫查詢其化學(xué)成分。數(shù)據(jù)收集時間截至2020年9月29日，得出宣白承氣湯中活性較高的化學(xué)成分，同時獲取相應(yīng)作用靶點。

1.2 COPD相關(guān)靶點的篩選

將“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”作為關(guān)鍵 詞，對GeenCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）五個數(shù)據(jù)庫進行檢索，并對上述數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果進行整理，合并去重后作為疾病靶點數(shù)據(jù)庫備用。

1.3 藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及可視化

利用Venn在線軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將藥物與疾病靶點取交集，運用Cytoscape3.7.2（http://www.cytoscape.org/）軟件將宣白承氣湯治療COPD的“活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）的構(gòu)建

將1.3 篩選得到的藥物-疾病共同靶點上傳至String（https：//string-db.org/）在線平臺數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，限定研究物種為“人”（“Homo sapiens”），設(shè)置置信度大于0.4，其余參數(shù)設(shè)置保持默認，導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)聚類

應(yīng)用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件將宣白承氣湯與COPD 的交集靶點進行聚類分析，該插件根據(jù)拓撲結(jié)構(gòu)對網(wǎng)絡(luò)進行聚類，以尋找關(guān)系密切，可能協(xié)同發(fā)揮作用的靶點集群。

1.6 GO功能分析及KEGG通路富集分析

將宣白承氣湯的有效作用靶點上傳至David 6.8（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8），以人類為研究對象，進行基因功能（GO，gene ontology）分析以了解靶點主要的作用過程。利用R 語言3.6.3 中的“clusterProfiler”包對關(guān)鍵靶點進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/）富集分析。

1.7 分子對接

從RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫中（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）獲取關(guān)鍵靶點的3D 結(jié)構(gòu)，從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲取宣白承氣湯活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，利用Chem3D軟件對活性成分小分子結(jié)構(gòu)逐個進行優(yōu)化，使小分子結(jié)構(gòu)還原為最低能量形式，更貼近對接時的狀態(tài)。應(yīng)用PyMOL 2.4.0 軟件對關(guān)鍵靶點進行預(yù)處理。應(yīng)用AutoDock Vina 軟件進行分子對接，最后對對接結(jié)果進行三維和二維可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 宣白承氣湯活性成分的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索宣白承氣湯組成藥物的化學(xué)成分，共計下載得到285 個化學(xué)成分，再以ADME參數(shù)中的OB 和DL 為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選（OB ≥30%，DL ≥0.18），同時篩去無對應(yīng)靶點的成分，最終共獲得宣白承氣湯45個潛在的有效成分，見表1。

表1 宣白承氣湯潛在有效成分表Table 1 Potential effective ingredients of Xuanbai Chengqi Decoction

2.2 宣白承氣湯活性成分-COPD靶點預(yù)測

將從數(shù)據(jù)庫獲取的數(shù)據(jù)整合，得到45種活性成分及293個靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，匯總?cè)ブ睾蟮玫?8 個靶點。設(shè)置relevance score ≥7，由Genecards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫檢索整合去重后得到COPD 靶點共計7 037個，將宣白承氣湯潛在活性成分與COPD 各自對應(yīng)靶點取交集，得到活性成分-疾病共同靶點80 個，對應(yīng)的韋恩圖見圖1。

圖1 宣白承氣湯活性成分與COPD交集靶點Venn圖Figure 1 Venn diagram of intersection targets between COPD and active ingredients in Xuanbai Chengqi Decoction

2.3 “化合物-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

為更立體直觀的顯示宣白承氣湯有效成分、靶點與COPD 之間的相互作用關(guān)系，利用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“有效成分-交集靶點-COPD”可視化網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），結(jié)果顯示，宣白承氣湯中發(fā)揮治療COPD作用的潛在化學(xué)成分主要有beta-sitosterol、Stigmasterol、l-SPD、estrone、Glabridin、Machiline、aloe-emodin等，主要作用于PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90AB1、PGR、ESR1、ADRB2、CHRM1等靶點。

圖2 “化合物-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Visualization network diagram of"compound-target-disease"

2.4 宣白承氣湯治療COPD靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

設(shè)置置信度大于0.4，將藥物-疾病交集靶點上傳至STRING在線數(shù)據(jù)庫平臺，導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）。運用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件篩選宣白承氣湯治療COPD 的關(guān)鍵靶蛋白，篩選過程及結(jié)果見圖4，主要包 括NR3C1、MYC、CASP3、AR、JUN、ESR1、PGR、TP53等。

圖3 宣白承氣湯治療COPD相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of targets related to COPD treated by Xuanbai Chengqi Decoction

圖4 （a-c）宣白承氣湯治療COPD的關(guān)鍵靶點篩選過程圖Figure 4 （a-c）Screening process of key targets of Xuanbai Chengqi Decoction for the treatment of COPD

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點聚類

結(jié)果顯示，宣白承氣湯治療COPD 的相關(guān)靶點主要可分為5 個聚類簇，可視化網(wǎng)絡(luò)圖評分從高到低見圖5（A-E）。

圖5 宣白承氣湯治療COPD的關(guān)鍵靶點聚類圖Figure 5 Cluster diagram of Xuanbai Chengqi Decoction for the treatment of COPD

2.6 宣白承氣湯的GO富集分析

利用DAVID 平臺進行GO 功能富集分析，設(shè)定閾值P＜0.01，對篩選得到的80個關(guān)鍵靶點進行分析（見圖6），這些靶點主要涉及了細胞對藥物的反應(yīng)、腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路等804 條生物過程；提示了突觸后膜的組成部分、突觸后膜的內(nèi)在組成部分等53 條細胞組分；同時包括G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素能受體的活動等71條分子功能。

圖6 有效組分-基因靶點-分子功能的GO富集分析柱狀圖Figure 6 Histogram of GO enrichment analysis of active componentgene target-molecular function

2.7 宣白承氣湯治療COPD的KEGG通路富集分析

使用clusterprofiler R 包對80 個交集靶點進行KEGG 富集分析，以P＜0.01 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終得出112 條通路富集結(jié)果。并通過微生信網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/）對富集結(jié)果的前20 位進行可視化處理（見圖7）。

圖7 KEGG通路富集分析對應(yīng)氣泡圖Figure 7 Bubble chart corresponding to KEGG pathway enrichment analysis

2.8 宣白承氣湯活性成分治療COPD 分子對接結(jié)果分析

使用Cytoscape中的CytoNCA對宣白承氣湯活性成分治療COPD 分子靶點進行打分，得到網(wǎng)絡(luò)核心靶點，Degree ≥13 的潛在靶點有8 個，分別為：TP53、ESR1、MYC、CASP3、JUN、AR、PGR、NR3C1。本研究以結(jié)合能≤-8.0kcal/mol作為篩選條件，見表2，繼而對接結(jié)果進行可視化分析，見圖8（A-F）。

圖8 （A-F）部分靶點對接結(jié)果Figure 8 （A-F）Docking results of targets

表2 宣白承氣湯活性成分與靶點的結(jié)合能Table 2 Binding energy of active ingredients and targets in Xuanbai Chengqi Decoction

3 討論

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)基礎(chǔ)理論中的重要理論之一，由于手太陰肺經(jīng)與手陽明大腸經(jīng)之間相互絡(luò)屬，肺的肅降功能一方面有利大腸向下排出糟粕，另一方面疏布津液下達，濡潤腸壁；大腸功能傳導(dǎo)正常，糟粕得以順利排出，亦有助肺氣的肅降以及水液的下行。目前已有組織胚胎學(xué)研究證實肺、氣管與腸的結(jié)構(gòu)來源相同，肺、氣管組織可由原腸的前腸發(fā)展而成，由此可知肺、腸在組織上具有同源性。韓俊閣等也在試驗中發(fā)現(xiàn)高氧狀態(tài)下的大鼠模型肺與腸黏膜細胞因子在黏膜免疫方面具有同步性[5]?！胺文c同治”正是基于肺與大腸相表里的關(guān)系所提出的治療大法，肺病兼以治腸，則糟粕下行，肺氣宣通，水液布達；腸病兼以治肺，則提壺揭蓋，上通下達，氣機得以肅降，腸壁得以濡潤，糟粕隨之順暢而出。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究模式，探討了“肺腸同治”思想理論的代表方劑宣白承氣湯治療COPD 的作用網(wǎng)絡(luò)與潛在機制以及其中所體現(xiàn)的“肺腸同治”理論，根據(jù)表1、表2 及圖2 研究顯示，宣白承氣湯主要有效化合物有45 個，其中發(fā)揮治療COPD 作用的可能關(guān)鍵成分包括蘆薈大黃素、原花青素、維生素E以及甘草苷。李曉紅等[6]研究得出蘆薈大黃素通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達降低對應(yīng)細胞釋放一氧化氮，從而發(fā)揮抗炎作用。根據(jù)現(xiàn)有研究，免疫系統(tǒng)在COPD 的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用，其中重復(fù)和進行性激活多種免疫細胞引起了慢性炎癥的發(fā)病[7]。李新等[8]實驗結(jié)果顯示，蘆薈大黃素通過調(diào)節(jié)機體內(nèi)白細胞介素-2（IL-2）的水平，可顯著抑制T細胞的增殖，達到調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)功能的效用。COPD 急性加重期時人體的氧化與抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡被打破，機體氧化應(yīng)激水平增加，氣道和肺實質(zhì)炎性物質(zhì)滲出增多，損傷肺組織[9]。亦有報道顯示蘆薈大黃素可降低便秘小鼠結(jié)腸慢波頻率，同時升高小鼠結(jié)腸中胃腸活動調(diào)節(jié)物質(zhì)P 物質(zhì)和血管活性腸肽的含量[10]。原花青素的抗氧化活性極強，可在有效對抗自由基的同時抑制脂質(zhì)過氧化[11]，從而改善COPD 病人的氣道病變，減輕炎性反應(yīng)。此外，原花青素對肢體缺血再灌注的大鼠腸黏膜屏障功能損傷具有保護作用[12]。維生素E在人體的抗氧化過程中扮演了重要角色，同時也是良好的自由基清除劑，在機體內(nèi)可對抗氧化應(yīng)激、消除炎癥。維生素E作為一種抗氧化劑，可明顯改善COPD大鼠的炎癥反應(yīng)，從而保護機體。劉江濤等[13]使用維生素E分別干預(yù)高溫和PM 2.5 暴露下的COPD 大鼠，發(fā)現(xiàn)兩組大鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）含量均顯著降低（P＜0.05）。甘草苷通過抑制細胞因子誘導(dǎo)谷胱甘肽（GSH）生物合成，具有抗氧化作用，保護肺上皮細胞免受香煙介導(dǎo)的氧化應(yīng)激。YUAN 等[14]實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)甘草苷治療的肺上皮細胞損傷小鼠肺部炎癥明顯減輕，提示甘草苷可能是COPD上皮細胞損傷的有效保護劑。

結(jié)合圖1、2、3、4 可知，宣白承氣湯對應(yīng)有效作用靶點88個，COPD靶點7 037個，兩者交集靶點80個，綜合數(shù)據(jù)分析結(jié)果及往年文獻報道，總結(jié)出其中關(guān)鍵作用靶點有MYC、JUN、TP53等。參與COPD氣道重塑的細胞主要包括平滑肌細胞和成纖維細胞，目前已有研究表明，原癌基因（C-MYC）在成纖維細胞增殖過程中受到激活，提示C-MYC參與了COPD 氣道重塑過程中成纖維細胞的分化、增殖和表型轉(zhuǎn)化[15]。JUN基因的關(guān)鍵作用是在細胞水平上調(diào)控各種功能和過程，如增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。AMJAD 等[16]實驗結(jié)果表明，JUN基因在吸煙的COPD 病人和正常吸煙病人中均呈顯著集中高表達狀態(tài)（P＜0.05），同時AP1 信號通路亞單位JUN和FOS的基因表達在吸煙的COPD病人中顯著升高[17]。RONALD 等[18]研究表明，炎癥基因（如NF-kB、IL-6）和TP53基因的表達呈負相關(guān)關(guān)系，可能是炎癥機體在試圖愈合損傷和生長新組織時，需要關(guān)閉像TP53這樣的基因，這些基因會阻止損傷細胞的生長并導(dǎo)致細胞凋亡。PPI網(wǎng)絡(luò)聚類顯示聚類簇a評分最高，其中Caspase家族蛋白與細胞凋亡關(guān)系密切，臨床試驗顯示敲除CASP8基因可促進非小細胞肺癌（NSCLC）病人細胞的生長和自噬，同時降低化療敏感性和凋亡細胞死亡[19]，CASP9特有基因型是NSCLC的危險因素[20]。CCNA2和CCNB1的影響有助于有絲分裂的啟動和維持[21]。同時CDK 家族蛋白和CHEK1 蛋白都是細胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[22]。SOD1做為抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，可清除細胞內(nèi)產(chǎn)生的對生物系統(tǒng)有毒的自由基[23]，減輕COPD 的炎癥反應(yīng)。通過分子對接，發(fā)現(xiàn)PGR、ESR1、AR、NR3C1、TP53 與多個宣白承氣湯活性成分具有較好的結(jié)合性。

GO 功能富集分析結(jié)果主要包括G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素能受體的活動、兒茶酚胺綁定、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活動、類固醇激素受體活性。KEGG通路富集分析顯示，這些靶點參與了PI3K-Akt 信號通路、艾巴氏病毒感染、人類巨細胞病毒感染、細胞周期等信號通路的調(diào)控。氣道在受到炎癥及組織損傷后，氣道平滑肌表現(xiàn)趨于增殖修復(fù)氣道的狀態(tài)，發(fā)生異常的過度增殖導(dǎo)致氣道重塑[24]。NARSA M 等[25]研究表明，PI3K/PKB 通路的激活可以促進氣道平滑肌的增殖。PI3K/PKB 信號通路成為氣道重塑的潛在治療靶點，潛伏病毒感染在慢性阻塞性肺疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮了作用，其中包括艾巴氏病毒（EBV）感染[26]。人類巨細胞病毒（CMV）作為一種血管內(nèi)皮細胞的持續(xù)病毒感染，非常適合誘導(dǎo)促炎細胞因子，導(dǎo)致老年人炎癥和疾病[27]。研究顯示，人類巨細胞病毒感染機體時巨噬細胞相關(guān)抗原的表達加劇了機體的炎癥。GUSTAVO[28]等發(fā)現(xiàn)抗炎和抗氧化劑可能作用于幾種細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達和功能，慢性炎癥參與調(diào)控細胞周期關(guān)鍵檢查點的遺傳和表觀遺傳學(xué)改變的機制，與炎癥性疾病的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

4 結(jié)論與后續(xù)研究

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法構(gòu)建并分析“化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，推測宣白承氣湯通過蘆薈大黃素、原花青素、維生素E、甘草苷潛在藥效成分協(xié)同作用于MYC、JUN、TP53 等多個靶點，通過PI3K-Akt信號通路、艾巴氏病毒感染、人類巨細胞病毒感染、細胞周期等信號通路發(fā)揮治療COPD 的作用，初步揭示了宣白承氣湯通過多成分、多靶點、多通路聯(lián)合作用，共同發(fā)揮治療COPD 作用的相關(guān)機制。為進一步探討其發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究提供了方向，其后續(xù)尚需體內(nèi)外實驗進一步證實其功效網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和作用靶點。

（利益沖突：無）