高麗娟，秦江月，徐 丹，申永春，陳 梅，陳 磊，文富強(qiáng)

1.四川大學(xué)華西醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科/生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室呼吸病學(xué)研究室（成都610041）；2.成都市第五人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（成都 611130）

慢性阻塞性肺疾?。ê?jiǎn)稱(chēng)慢阻肺）是一種以持續(xù)存在的呼吸系統(tǒng)癥狀以及不完全可逆的氣流受限為特征的常見(jiàn)慢性呼吸系統(tǒng)疾病，目前慢阻肺是全球排名前三位致死原因的疾病之一[1-2]。慢性支氣管炎（簡(jiǎn)稱(chēng)慢支炎）和肺氣腫是慢阻肺兩個(gè)經(jīng)典臨床表型[3]。慢阻肺病人的慢支炎表型通常定義為每年慢性咳嗽、咳痰大于或等于3 個(gè)月，至少連續(xù)兩年。慢支炎病理特征包括持續(xù)氣道炎癥，氣道粘液高分泌[4]，氣道重塑及狹窄[5-6]。慢阻肺病人的肺氣腫則是由于肺實(shí)質(zhì)的破壞，隨后終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端的氣道彈性下降，導(dǎo)致肺過(guò)度膨脹引起的[7-9]。慢支炎和肺氣腫病人的臨床癥狀和治療反應(yīng)存在明顯差異。與慢支炎病人相比，肺氣腫病人肺功能更差，呼吸困難癥狀更嚴(yán)重[10-11]。并且以肺氣腫為主的慢阻肺病人對(duì)吸入性糖皮質(zhì)激素和長(zhǎng)效β受體激動(dòng)劑的治療反應(yīng)欠佳，對(duì)于肺功能和呼吸困難的改善有限[12]。以上研究提示，慢支炎和肺氣腫病人的發(fā)病機(jī)制可能并不完全相同。然而目前關(guān)于慢阻肺病人慢支炎表型和肺氣腫表型的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明。而深入探索慢阻肺病人不同臨床表型發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)于慢阻肺病人的精準(zhǔn)治療具有重要的臨床意義。因此，本研究將通過(guò)分析數(shù)據(jù)庫(kù)GSE69818中慢阻肺病人的肺組織轉(zhuǎn)錄組信息，探究慢支炎表型和肺氣腫表型發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo是目前最完善的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)儲(chǔ)存庫(kù)，我們從中下載轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)GSE69818，數(shù)據(jù)是基于Affymetrix Human Genome U219 Array所獲得的人轉(zhuǎn)錄組生物信息。GSE69818包含70個(gè)慢阻肺病人肺組織樣本，其中包括38例肺氣腫表型和32例慢支炎表型病人[13-16]。

1.2 獲取差異表達(dá)基因

利用R 語(yǔ)言的Rank Pord 軟件包分析慢支炎表型和肺氣腫表型的差異表達(dá)基因，認(rèn)為P＜0.05為表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 差異表達(dá)基因的基因本體及通路富集分析

對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因，利用DAVID（http://david.abcc，ncifcrf.gov）在線(xiàn)分析軟件進(jìn)行基因本體（gene oncology，GO）分析以及京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。P及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）均小于0.05即視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 差異表達(dá)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://http://www.string-db.org/）是一個(gè)包含多種蛋白質(zhì)互作關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)差異基因編碼的蛋白利用STRING進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件導(dǎo)出編碼蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因分析

比較肺氣腫組和慢支炎組，篩選得到3 734個(gè)差異表達(dá)基因，其中肺氣腫組表達(dá)下調(diào)的基因2 073 個(gè)，表達(dá)上調(diào)的基因1 661個(gè)（見(jiàn)表1）。用差異基因繪制熱圖（見(jiàn)圖1），與慢支炎組相比，紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因?；鹕綀D則直接反映出差異基因的表達(dá)情況，如圖1 所示，肺氣腫組的基因大部分下調(diào)，這與下調(diào)的基因數(shù)的結(jié)果相符。

表1 前10名上調(diào)及下調(diào)差異表達(dá)基因Table1 The top 10 up-regulated and down-regulated mRNAs

圖1 差異基因的火山圖Figure 1 The volcanic map of DEGs

2.2 差異表達(dá)基因的GO分析

將篩選出的差異表達(dá)基因利用DAVID 進(jìn)行GO 分析。GO分析獲得了生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組成3個(gè)部分的結(jié)果。其中在生物學(xué)過(guò)程中，差異基因主要涉及生物行為、生物黏附和生物相，分子功能中主要富集到抗氧化活性和催化活性，細(xì)胞組成主要包括細(xì)胞連接、細(xì)胞外區(qū)域和大分子絡(luò)合物（見(jiàn)圖2）。其中在生物學(xué)過(guò)程中，上調(diào)基因主要涉及表皮的發(fā)育、運(yùn)動(dòng)節(jié)律和嘌呤堿基轉(zhuǎn)運(yùn)，分子功能主要涉及抗原結(jié)合、B細(xì)胞分化、和堿性磷酸酶活性，細(xì)胞組成主要包括T細(xì)胞受體復(fù)合體、高密度脂蛋白粒子和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體復(fù)合物。而對(duì)于下調(diào)的差異基因，在生物學(xué)過(guò)程中主要富集于無(wú)損側(cè)枝發(fā)芽、軸突中線(xiàn)選擇點(diǎn)識(shí)別和平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)。分子功能主要涉及肽酶激活活動(dòng)、膠原蛋白綁定和細(xì)胞骨架蛋白綁定。細(xì)胞組成主要包括基底膜、血小板α顆粒腔和頂體內(nèi)膜。

圖2 差異基因本體分析Figure 2 GO analysis

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG分析

根據(jù)KEGG 分析結(jié)果，差異基因主要富集到流體剪切應(yīng)力，動(dòng)脈粥樣硬化，小細(xì)胞肺癌和ECM 受體連接（見(jiàn)圖3）。差異表達(dá)基因中上調(diào)部分主要富集于甘油磷脂代謝、原發(fā)性免疫缺陷、甘油酸代謝，而下調(diào)部分主要涉及細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）-受體相互作用和cGMP-PKG信號(hào)通路。

圖3 差異基因KEGG信號(hào)通路富集分析Figure 3 KEGG analysis

2.4 差異表達(dá)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

選擇P小于0.01差異表達(dá)基因構(gòu)建蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)圖，其中包含738 個(gè)節(jié)點(diǎn)，通過(guò)Cyoscape 軟件篩選出排名前10的關(guān)鍵基因，包括ACTB、ITGB1、RHOA、FN1、SRSF1、CAV1、CTNNA1、VEGFA、HNRNPA1、APP（見(jiàn)圖4），其中有9 個(gè)下調(diào)基因（APP、ITGB1、FN1、RHOA、CAV1、CTNNA1、VEGFA、HNRNPA1、SRSF1），1 個(gè)上調(diào)基因（ACTB）。

圖4 差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 PPI analysis

3 討論

慢阻肺是一種慢性進(jìn)行性疾病，而慢支炎和肺氣腫是其重要臨床表型，不同臨床表型的慢阻肺病人對(duì)治療反應(yīng)以及臨床結(jié)局存在明顯差異。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究疾病的遺傳信息改變[17-18]，進(jìn)而了解疾病發(fā)生的分子機(jī)制。本研究表明，肺氣腫和慢支炎表型病人的肺組織在轉(zhuǎn)錄組水平上存在顯著差異。通過(guò)深入分析慢支炎和肺氣腫表型病人肺組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，有助于探索不同表型慢阻肺的分子機(jī)制的異質(zhì)性，為其精準(zhǔn)治療提供新思路。

本研究通過(guò)Rank Pord軟件包對(duì)GSE69818轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得慢支炎表型和肺氣腫表型慢阻肺病人肺組織差異表達(dá)的3 734 個(gè)基因，其中1 661 個(gè)上調(diào)基因，2 073 個(gè)下調(diào)基因。根據(jù)PPI 結(jié)果，篩選出10個(gè)關(guān)鍵基因，包括ACTB、ITGB1、RHOA、FN1、SRSF1、CAV1、CTNNA1、VEGFA、HNRNPA1、APP（圖4）。大量研究表明FN1編碼的纖連蛋白作為肺基質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要組成成分，在慢阻肺小氣道重塑中發(fā)揮著重要作用[19-20]。同時(shí)，篩選出的關(guān)鍵基因ITGB1可以編碼蛋白質(zhì)整合素β1，而整合素β1在肺發(fā)育過(guò)程中參與調(diào)節(jié)分支形態(tài)形成和肺泡形成[21]。并且有研究報(bào)道ITGB1基因突變小鼠肺組織在老年階段表現(xiàn)出慢阻肺樣改變，包括肺氣腫改變、淋巴結(jié)增生和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加[22]，提示ITGB1可能與慢阻肺肺氣腫的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不完全清楚。同時(shí)，本研究篩選出的關(guān)鍵基因CAV1的編碼蛋白是細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)成分之一，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)CAV1敲低后，香煙煙霧刺激誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡明顯增加，此外，慢性香煙煙霧暴露后，CAV1基因敲除小鼠肺組織的細(xì)胞自噬和凋亡水平顯著增加，肺氣腫改變更明顯[23]，提示CAV1可能參與調(diào)控香煙誘導(dǎo)的肺氣腫發(fā)生發(fā)展。但是，這些基因參與慢阻肺病人肺氣腫表型的具體致病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

通過(guò)GO富集分析，我們發(fā)現(xiàn)差異基因富集于B細(xì)胞分化等免疫反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)等生物過(guò)程。有報(bào)道提出吸煙慢阻肺病人肺組織中記憶B細(xì)胞水平顯著增加，并可能與抗原特異性免疫反應(yīng)相關(guān)[24]。同時(shí)ROCA 等[14]報(bào)道指出在慢阻肺合并肺氣腫病人肺組織中存在B 細(xì)胞相關(guān)基因的富集，而在慢支炎病人中卻并沒(méi)有相關(guān)基因富集。因此，B細(xì)胞相關(guān)免疫反應(yīng)可能與慢阻肺肺氣腫表型的發(fā)展密切相關(guān)，但是其相關(guān)的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。同時(shí)，有研究證實(shí)病毒刺激可以誘導(dǎo)支氣管細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子減少，從而擾亂細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，而細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量變化可以觸發(fā)NLRP3等炎癥小體激活以及炎癥因子IL-1β的分泌[25]，IL-1β則在慢阻肺的氣道炎癥發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，這提示本研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)可能參與慢阻肺慢支炎表型的發(fā)生發(fā)展，但暫無(wú)相關(guān)研究報(bào)道其中具體機(jī)制。因此，本研究篩選到的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程可以為今后更進(jìn)一步研究慢阻肺不同臨床表型的發(fā)病機(jī)制提供了新的可能和方向。

通過(guò)KEGG 路徑富集分析，本研究發(fā)現(xiàn)在慢支炎表型中上調(diào)的基因富集到了細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）-受體相互作用和cGMP-PKG 信號(hào)通路。以往的研究表明，異常的ECM 沉積可以驅(qū)動(dòng)氣道炎癥、修復(fù)、細(xì)胞遷移和增殖，也是慢阻肺小氣道重塑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)改變[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)FN1、COL4A1、COL4A2、COL6A3等基因均富集在了ECM 信號(hào)通路。其中COL4A1、COL4A2和FN1編碼蛋白都是ECM 的重要組成部分[29-30]。同時(shí)FRANCIS 等[31]研究發(fā)現(xiàn)COL6A3 參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的錨定和重塑。而本研究篩選出的關(guān)鍵基因SRSF1則是富含精氨酸/絲氨酸的剪接因子蛋白家族的成員，它們與ECM 組裝有著密切的關(guān)系[32]。SUN 等[33]發(fā)現(xiàn)沉默SRSF1 可以抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的人胎肺成纖維細(xì)胞增殖、分化和ECM沉積。以上參與調(diào)控ECM重塑的基因在慢支炎表型病人肺組織中上調(diào)，表明氣道和肺實(shí)質(zhì)中ECM 異常沉積可能參與影響慢支炎表型病人的氣道重塑，但具體機(jī)制目前尚未完全闡述清楚。此外，有研究指出在肺部炎癥病人的支氣管上皮細(xì)胞中，cGMP-PKG通路顯著下調(diào)[35]，提示cGMP-PKG通路可能影響肺部炎癥的發(fā)生，但其是否參與慢阻肺病人慢支炎的調(diào)控目前尚不清楚。因此，需要更多的研究探索慢阻肺病人慢支炎和肺氣腫表型的具體分子機(jī)制。

4 結(jié)論與啟示

本研究通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中慢阻肺病人慢支炎和肺氣腫表型肺組織的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘與生物信息學(xué)分析，初步明確了調(diào)控慢阻肺病人慢支炎表型和肺氣腫表型的可能關(guān)鍵基因及相關(guān)通路，為慢阻肺的精準(zhǔn)診治提供了潛在靶點(diǎn)，但后續(xù)還需要開(kāi)展進(jìn)一步的基礎(chǔ)與臨床研究，以探索慢阻肺病人的發(fā)病機(jī)制與臨床治療靶點(diǎn)。

（利益沖突：無(wú)）