肖嘉聰 麥嘉樂 張罡瑜 何琪 楊均政 潘兆豐 王海彬

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510000 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科實驗室，廣東 廣州 510000 3. 廣州市正骨醫(yī)院，廣東 廣州 510000 4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科，廣東 廣州 510000

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是臨床上常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，其主要特征是軟骨破壞、滑膜炎癥、骨贅形成和軟骨下骨重塑[1-3]。近些年的研究表明，骨關(guān)節(jié)炎不僅是一種與機械壓力和衰老相關(guān)的關(guān)節(jié)疾病，也是一種與“代謝綜合征”相關(guān)的疾病[4]。代謝綜合征包括胰島素抵抗、肥胖、高血壓和血脂異常，其中膽固醇代謝和骨關(guān)節(jié)炎存在顯著的相關(guān)性[5-6]。在骨關(guān)節(jié)炎期間，軟骨細胞中出現(xiàn)脂質(zhì)代謝失調(diào)和膽固醇累積[7]。Choi等[8]的研究表明，靶向調(diào)控 CH25H/CYP7B1/RORα 軸能夠改善關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中的膽固醇代謝，從而減輕骨關(guān)節(jié)炎。

槲皮素是一種天然存在的黃酮類化合物，存在于大量的水果和蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抑制膽固醇合成等功效[9-11]。槲皮素能夠直接清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，減弱促炎細胞因子的表達，并且對新脂肪酸和膽固醇的合成產(chǎn)生快速和直接的抑制作用[12]。有研究表明，槲皮素能夠減輕關(guān)節(jié)炎小鼠炎癥指數(shù)、減輕關(guān)節(jié)的破壞、發(fā)揮抗炎作用[13]。這些證據(jù)表明，槲皮素能在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮保護作用。

本研究以骨關(guān)節(jié)炎中的膽固醇代謝為切入點，探討槲皮素是否能夠通過調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中的膽固醇代謝，減輕軟骨細胞炎癥和細胞外基質(zhì)降解。

1 材料和方法

1.1 藥品及試劑

槲皮素(純度>98 %，CAS：117-39-5)，購自上海源葉生物科技有限公司；IL-1β購自派普泰克生物科技公司；胎牛血清、DMEM/F12 培養(yǎng)基購自賽默飛生物公司；總膽固醇檢測試劑盒購自索萊寶生物科技公司；細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自碧云天生物公司；引物合成由北京擎科生物公司完成，所有引物序列見表1；一抗CH25H、CYP7B 1、RORα、MMP3、MMP13 和β-actin購自美國Abcam公司；二抗購自武漢博士德生物公司。

1.2 小鼠軟骨細胞分離培養(yǎng)及鑒定

從廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號：SYXK(粵)2018-0092]購買3周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠，過量麻醉處死。取雙膝關(guān)節(jié)分離軟骨并剪碎，先用含有0.25 %胰蛋白酶-EDTA的培養(yǎng)基預(yù)消化30 min，然后使用含0.1%Ⅱ型膠原酶的培養(yǎng)基消化6 h，離心收集細胞，將細胞培養(yǎng)在含有10 %胎牛血清和1 %抗生素的 DMEM/F12 培養(yǎng)基中。細胞每2天更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細胞融合至80 %～90 %時進行傳代。P1、P2代軟骨細胞用于后續(xù)實驗。軟骨細胞使用甲苯胺藍染色鑒定。

1.3 小鼠軟骨細胞骨關(guān)節(jié)炎模型建立及分組

本研究使用IL-1β(10 ng/mL)刺激軟骨細胞模擬體外骨關(guān)節(jié)炎環(huán)境。細胞分為對照組、模型組(IL-1β，10 ng/mL)、低濃度組(IL-1β+5 μmol/L槲皮素)、高濃度組(IL-1β+10 μmol/L槲皮素)。

1.4 CCK-8 檢測軟骨細胞增殖

將軟骨細胞接種到 96 孔板(每孔 5×103個細胞)中，細胞貼壁后，在含或不含IL-1β的培養(yǎng)基中加入不同濃度的槲皮素(0、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L)干預(yù)24 h，干預(yù)結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測波長 450 nm 處的吸光值。

1.5 細胞內(nèi)總膽固醇(TC)水平檢測

將軟骨細胞以每孔3×105個細胞的密度接種于6孔板，干預(yù) 24 h 后按照總膽固醇檢測試劑盒說明書檢測軟骨細胞內(nèi)膽固醇水平。簡而言之，用異丙醇提取細胞內(nèi)總膽固醇，超聲裂解，高速離心后取上清，加入檢測工作液，在500 nm處檢測吸光值。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組細胞內(nèi)總膽固醇水平。

1.6 qRT-PCR

將軟骨細胞以每孔3×105個細胞的密度接種于6孔板，干預(yù)結(jié)束后，收集細胞，使用Trizol試劑提取總RNA，用 PrimeScript RT reagent 試劑盒將 1 μg 總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。采用 SYBR Green 染色法，以各組 cDNA 為模板，加入緩沖液、引物等進行 PCR。采用以下參數(shù)進行PCR擴增: 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，共40個循環(huán)，最后延伸步驟65 ℃ 5 s，0.5 ℃增量60 s。以18 s為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算相對mRNA表達量。所有引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 Western blot

將軟骨細胞以每孔3×105個細胞的密度接種于6孔板，干預(yù)結(jié)束后，收集細胞，加入含 1 %蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液冰上裂解細胞，14 000 r/min離心15 min，取上清，使用BCA Kit(碧云天)檢測蛋白濃度。蛋白樣品和Loading Buffer按照4∶1比例配置，100 ℃加熱5 min，放-80 ℃冰箱儲存以供后續(xù)使用。使用10 % SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)移到 PVDF膜，用5 %脫脂牛奶于室溫溫下封閉 2 h，加入一抗CH25H、CYP7B1、RORα、MMP3、MMP13、β-actin孵育，4 ℃過夜，TBST 清洗3次，二抗孵育1.5 h，TBST 清洗 3 次，使用凝膠成像儀進行成像。以β-actin作為內(nèi)參，使用Image J 進行定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對軟骨細胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，10 μmol/L濃度以下的槲皮素對軟骨細胞無毒性，而高濃度(25、50、100 μmol/L)的槲皮素會抑制軟骨細胞增殖(圖1C)。與對照組比較，IL-1β誘導(dǎo)的小鼠軟骨細胞活力受到抑制(P<0.05)，而1、2.5、5、10 μmol/L槲皮素能減輕IL-1β對軟骨細胞的增殖抑制(圖1D)。因此，我們選擇5、10 μmol/L濃度的槲皮素進行后續(xù)實驗。

注：與對照組比較，*P<0.05，**** P<0.0001；與模型組比較，# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001。圖1 A 槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；B 甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞；C槲皮素對軟骨細胞的毒性影響；D 槲皮素對 IL-1β誘導(dǎo)小鼠軟骨細胞增殖的影響Fig.1 A, Chemical structural formula of quercetin; B, Identification of chondrocytes by toluidine blue staining; C, Toxic effect of quercetin on chondrocytes; D, Effect of quercetin on IL-1β-induced chondrocyte proliferation in mice

2.2 槲皮素對軟骨細胞細中總膽固醇水平的影響

結(jié)果顯示(圖2)，模型組總膽固醇水平較對照組升高(P<0.05)；與模型組相比，槲皮素干預(yù)后的關(guān)節(jié)炎軟骨細胞內(nèi)總膽固醇水平有所降低(P<0.05)。這表明，槲皮素能夠調(diào)控關(guān)節(jié)炎軟骨細胞內(nèi)的膽固醇代謝。

注：與對照組比較，* P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。圖2 槲皮素對IL-1β誘導(dǎo)小鼠軟骨細胞細中總膽固醇含量的影響Fig.2 Effect of quercetin on IL-1β-induced total cholesterol content in fine mouse chondrocytes

2.3 槲皮素對軟骨細胞中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Col2a1、Il-6的mRNA 表達的影響

結(jié)果顯示(圖3)，與對照組比較，模型組中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Il-6的mRNA表達均有不同程度升高，而Col2a1的mRNA表達下降；相比于模型組，槲皮素組中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Il-6的mRNA表達有所下降，Col2a1的mRNA表達有所提高。這些結(jié)果表明，槲皮素能夠調(diào)控CH25H/CYP7B1/RORα信號通路，減輕關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中的炎癥和細胞外基質(zhì)降解。

注：與對照組比較，** P<0.01，*** P<0.001，**** P<0.0001；與模型組比較，# P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001。圖3 槲皮素對軟骨細胞中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Col2a1、Il-6的mRNA表達的影響Fig.3 Effect of quercetin on the mRNA expressions of Cyp7b1, Ch25h, Rorα, Mmp3, Mmp13, Col2a1 and Il-6 in chondrocytes

2.4 槲皮素對 CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3 和 MMP13 蛋白表達的影響

結(jié)果顯示(圖4)，與對照組比較，模型組軟骨細胞中CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3 和 MMP13 蛋白的表達均有不同程度上升，而槲皮素能夠部分抑制關(guān)節(jié)炎軟骨細中CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3和MMP13的蛋白表達(P<0.05)。這與qRT-PCR的結(jié)果一致。

注：與對照組比較，** P <0.01，*** P <0.001，**** P<0.0001；與IL-1β組比較，# P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，#### P<0.0001。圖4 槲皮素對軟骨細胞中CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3和MMP13的蛋白表達的影響Fig.4 Effect of quercetin on the protein expressions of CYP7B1, CH25H, RORα, MMP3, and MMP13 in chondrocytes

3 討論

隨著人口老齡化與肥胖人口的增加，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率越來越高，隨著病情的進展，晚期骨關(guān)節(jié)炎的患者只能通過手術(shù)來緩解疼痛，這給社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[14-15]。目前，臨床上用于治療骨關(guān)節(jié)炎的非甾體類抗炎藥和阿片類藥物只能暫時緩解疼痛，并不能延緩骨關(guān)節(jié)炎的進展[16]。此外，長期服用此類藥物容易導(dǎo)致心血管疾病[17]。因此，努力尋找可以緩解骨關(guān)節(jié)炎進展的藥物是骨關(guān)節(jié)炎新藥研發(fā)中的重要策略之一。

炎癥和細胞外基質(zhì)降解是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的關(guān)鍵因素[18-19]。IL-1β會導(dǎo)致促進炎癥因子IL-6的釋放，當(dāng)炎癥因子不斷釋放時，會引起軟骨細胞功能障礙甚至凋亡，最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[20-21]。細胞外基質(zhì)(ECM)降解會導(dǎo)致關(guān)節(jié)嚴(yán)重疼痛，運動能力喪失，進行性不可逆功能障礙，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)被認(rèn)為是細胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵分子[13]。MMP3和MMP13作為關(guān)節(jié)炎中的兩種關(guān)鍵酶，會隨著疾病的進展而表達增高，并不可逆地降解Ⅱ型膠原，造成關(guān)節(jié)軟骨的破壞和炎癥的發(fā)生[22-23]。我們的研究表明，IL-1β誘導(dǎo)后的軟骨細胞中MMP3、MMP13、IL-6的表達均有不同程度上升，Col2a1的表達有所下降；槲皮素處理后部分下調(diào)了MMP3、MMP13、IL-6的表達，上調(diào)了Col2a1的表達。這表明，槲皮素對關(guān)節(jié)炎軟骨細胞具有抗炎和延緩細胞外基質(zhì)降解的作用。

骨關(guān)節(jié)炎不僅僅是關(guān)節(jié)軟骨的局限性病變，還涉及全身的代謝異常，特別是膽固醇代謝紊亂，與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展有著密不可分的關(guān)系[24-25]。雖然膽固醇是維持細胞活性和功能不可或缺的物質(zhì)，但膽固醇的過度累積會抑制軟骨細胞基質(zhì)的合成和分泌，并破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細胞損傷甚至死亡[26]。綜上所述，膽固醇代謝與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，改善關(guān)節(jié)炎軟骨細胞膽固醇代謝可能成為治療骨關(guān)節(jié)炎的新途徑。我們的研究發(fā)現(xiàn)，使用IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中的總膽固醇水平較對照組升高，槲皮素處理后軟骨細胞中總膽固醇水平較模型組降低，這表明槲皮素能夠調(diào)控關(guān)節(jié)炎軟骨細胞內(nèi)的膽固醇代謝，發(fā)揮軟骨保護作用。

細胞內(nèi)膽固醇累積會導(dǎo)致細胞功能受損，大多數(shù)細胞都有嚴(yán)格的膽固醇流入和流出系統(tǒng)來防止細胞內(nèi)膽固醇積累[27]。膽固醇 25-羥化酶(CH25H)和25-羥基膽固醇7α-羥化酶(CYP7B1)是參與膽固醇代謝的重要基因，RORα是維甲酸相關(guān)孤兒受體家族成員之一，在炎癥、脂質(zhì)代謝等方面起重要的作用[8,28]。Li等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，靶向調(diào)控CH25H/CYP7B1/RORα軸能夠直接調(diào)節(jié)MMP3和MMP13的表達，改善骨關(guān)節(jié)炎的進展。我們的研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中CYP7B1、CH25H、RORα的基因和蛋白表達均有不同程度上升，而槲皮素降低了它們的表達。這表明，槲皮素能夠抑制關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中CH25H/CYP7B1/RORα信號通路的激活，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中的膽固醇代謝。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠改善關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中的膽固醇代謝、炎癥以及細胞外基質(zhì)降解，這可能是通過調(diào)控CH25H/CYP7B1/RORα信號通路來實現(xiàn)的。但是，本研究未能從體內(nèi)證明這些結(jié)果，因此存在一定的局限性，我們將在后續(xù)的實驗中為槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎提供更多的理論支持。