李甜，張珊，李孟華，吳夢蘭，段昕辰，林慧敏

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316021）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是我國經(jīng)濟(jì)價值較高的對蝦品種之一，其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費者青睞。但捕撈失活后，凡納濱對蝦體表色素易沉著，即黑變，影響其感官品質(zhì)。盡管凡納濱對蝦輕微的黑變對健康無害，但卻極大地影響了對蝦的銷售質(zhì)量。對蝦的黑變是由多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）將酚類氧化生成醌類，醌類化合物與蛋白質(zhì)聚合，進(jìn)一步生成色素導(dǎo)致的[1]。蝦內(nèi)源性多酚氧化酶活性變化與黑變的發(fā)展密切相關(guān)，因此，有效抑制多酚氧化酶的活性會延緩儲藏期間對蝦黑變[1]。冷凍儲藏可以防止蝦黑變，但傳統(tǒng)的冷凍方法可能會改變?nèi)饨M織中水分的含量和分布[2]，從而導(dǎo)致大冰晶的形成，蝦的品質(zhì)發(fā)生變化，同時解凍產(chǎn)品的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)也會發(fā)生過度氧化[3]。這些變化可能會大大降低蝦制品的質(zhì)量。因此，人們致力于開發(fā)新的冷凍方法以達(dá)到“冷凍保鮮”的目的，如高壓[4]、超聲[5]、磁場[6]、等離子體[7]和高壓靜電場[8]，但這些方法往往成本高、不方便、不穩(wěn)定，短期內(nèi)難以大規(guī)模應(yīng)用于肉類加工。

近年來，低壓靜電場已被證明是在冷凍過程中保存食品的有效方法，該方法易于實現(xiàn)，適用于多種食品，且價格低廉[9]。Xie等[10]研究發(fā)現(xiàn)在牛扒冷凍過程中施加低壓靜電場，可以降低牛扒的汁液損失和質(zhì)構(gòu)損失。張珊等[11]研究發(fā)現(xiàn)，低壓靜電場通過抑制蝦肉中腐敗微生物的生成，使對蝦pH值與揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值、蒸煮損失率始終比對照組低，但該研究并未對蝦體內(nèi)的多酚氧化酶進(jìn)行研究報道。

本文以凡納濱對蝦為研究對象，通過多酚氧化酶性質(zhì)，如酶活性、表面疏水性、超微量Ca2+-三磷酸腺苷酶（Ca2+-adenosine triphosphatase，Ca2+-ATPase）活性、聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrohoresis，SDS-PAGE）、圓二色譜在兩種貯藏條件下的差異性，研究微凍條件下低壓靜電場對凡納濱對蝦多酚氧化酶酶活性影響。本研究將為低壓靜電場（low voltage electrostatic field，LVEF）在對蝦冷凍貯藏中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活凡納濱對蝦，購于舟山國際水產(chǎn)城，保溫箱中加冰充氧，30 min內(nèi)運(yùn)送到實驗室，立即剔除死亡、不完整的個體后用純凈水沖洗2次，用碎冰將對蝦猝死，挑選個體差異不大、肢體完整、體表有光澤的對蝦作為研究樣品，用冰水（0℃～4℃）清洗后瀝干。

SDS-PAGE試劑盒（包括蛋白上樣緩沖液、凝膠快速配制試劑）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；R250考馬斯亮藍(lán)染色液：武漢谷歌生物科技有限公司；寬分子量蛋白質(zhì)Marker：美國Thero Scientific公司；pH8.0的20 mmol/LTris-HCl溶液、固體硫酸銨、pH6.5磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、左旋多巴（levodopa，L-DOPA）、溴酚藍(lán)指示劑（均為分析純）、Ca2+-ATPase活性試劑、巰基試劑盒、總蛋白試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

BX－2000型靜電場裝置：浙江馳力科技股份有限公司；Eppendorf 5425R高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PHS-25型酸度計：梅特勒托利多公司；FSH-2型可調(diào)高速勻漿機(jī)：常州國華電器有限公司；DZF-150真空冷凍干燥箱：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV5900紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；JASCO-J-720CD光譜偏振儀：北京市六一儀器廠。

1.3 低壓靜電場裝置及試驗分組

低壓靜電場裝置：本試驗的靜電場裝置由靜電場發(fā)生裝置和放電板組成，其中靜電場發(fā)生裝置為AC220 V、50/60 Hz，放電板（140 mm×120 mm）在冰箱（-7℃）內(nèi)產(chǎn)生低壓靜電場，形成負(fù)離子環(huán)境，放電板垂直放置，試驗樣品與放電板平行確保物料不與放電板直接接觸，靜電場發(fā)生裝置輸出電壓為2 500 V、電流為0.2 mA。靜電場環(huán)境模擬圖見圖1。

圖1 對蝦樣品在靜電場環(huán)境中的放置模擬圖Fig.1 Simulation of sample placement in LVEF

試驗分組：將瀝干的對蝦樣品先裝入無菌密封袋中再放入保鮮盒內(nèi)，一組為在低壓靜電場條件下貯藏的處理組，即LVEF組；一組為在冰箱中貯藏的對照組（Con組），兩組樣品儲藏溫度均為-7℃。將購買蝦的當(dāng)天記做試驗第0天，每4 d對蝦的各項指標(biāo)取樣檢測，試驗重復(fù)兩次、每個重復(fù)中各指標(biāo)分別進(jìn)行3次檢測。

1.4 多酚氧化酶性質(zhì)研究

1.4.1 多酚氧化酶的制備

參考López-Caballero等[12]的多酚氧化酶的制備方法并略有改動。將LVEF組和Con組的凡納濱對蝦取出，在無菌密封袋封裝條件下用流水解凍，至半解凍狀態(tài)下時，取對蝦頭部并去除頭部外殼，取出完整的腦部組織20 g，用消毒過的剪刀將腦組織剪碎成小塊肉粒，按 1∶4（g/mL）向蝦腦組織中加入80 mLpH8.0、20 mmol/LTris-HCl，充分混合后在4℃下勻漿10min，然后在冰水中靜置3h，冷凍離心25min（4℃，8000r/min），取上清液，上清液中添加固體硫酸銨，（20±2）℃下靜置30 min，當(dāng)飽和度達(dá)到40%時，先進(jìn)行硫酸銨鹽析24 h再用20 mmol/LTris-HCl（pH8.0）作為透析液透析12 h，透析過程中每4 h需要更換一次透析液，透析完成后冷凍離心 10 min（4℃，4 000 r/min），所得上清液即為多酚氧化酶粗液，酶液冷凍保存于-80℃冰箱中備用。

1.4.2 酶活性測定

參考Xu等[13]多酚氧化酶活性測定方法并稍作修改。在離心管中加入1.0 mL、15 mmol/L的左旋多巴及pH6.5、1.6 mL、0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液，再加入0.4 mL的酶液。充分混合后于37℃的水浴鍋中反應(yīng)3 min，而后在490 nm處測吸光值。根據(jù)多酚氧化酶作用于底物釋放的物質(zhì)在490 nm有最大吸光值來計算酶活性值，1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶量稱為1酶單位（U），用A/（min·mL）表示。

1.4.3 總巰基含量的測定

參照試劑盒說明書測定多酚氧化酶的總巰基含量。

1.4.4 表面疏水性的測定

參考梁慧等[14]多酚氧化酶表面疏水性的測定方法進(jìn)行測定，在20 μL、1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液中加入2 mL酶液并充分混勻。Con組直接在溴酚藍(lán)溶液加入2 mL的pH8.0、20 mmol/LTris-HCl緩沖液。在室溫（20±2）℃下充分振蕩10 min后在595 nm處測定其吸光值。表面疏水性的計算公式如下。

1.4.5 總蛋白含量的測定

參照試劑盒說明書測定總蛋白含量。

1.4.6 Ca2+-ATPase活性的測定

參照試劑盒說明書測定多酚氧化酶Ca2+-ATPase活性。以每小時每毫克蛋白中三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）分解ATP所釋放的無機(jī)磷的量表示（U/mg prot）。

1.4.7 SDS-PAGE測定

多酚氧化酶首先用SDS-PAGE試劑盒中蛋白上樣緩沖液溶解（1∶1體積比混合），然后在95℃水浴下反應(yīng)20 min。電泳凝膠板厚1 mm，下層膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，上層膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，每次上樣量10 μL。電泳設(shè)置的電流為80 mV，電泳時間為3 h，當(dāng)樣品由上層膠進(jìn)入下層膠界面后立刻將電流調(diào)至120 mV。電泳結(jié)束后，用預(yù)先配制好的0.1%考馬斯亮藍(lán)染色液在培養(yǎng)皿中對膠片進(jìn)行染色，水平搖床染色30 min，用超純水沖洗3次后用含7%冰醋酸和5%甲醇的脫色液脫色至蛋白條帶清晰即可。

1.4.8 圓二色譜的測定

根據(jù)Zhou等[15]的方法進(jìn)行圓二色譜（circular dichromatography，CD）分析。在180 nm～260 nm即遠(yuǎn)紫外范圍內(nèi)，以1 nm的帶寬和50 nm/min速度掃描18 CD光譜。每次處理后24 h內(nèi)掃描0.2 mL 1.0 mg/mL PPO。所有測得的CD光譜用pH6.5、50 mL磷酸鹽緩沖液進(jìn)行基線校正，PPO二級結(jié)構(gòu)的含量依據(jù)Dichroweb網(wǎng)站的SELCON3算法來計算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有樣品進(jìn)行3次平行試驗，數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)作圖采用Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 LVEF對PPO酶活性的影響

LVEF對PPO酶活性的影響見圖2。

圖2 LVEF對PPO酶活性的影響Fig.2 Effect of LVEF on polyphenol oxidase activity

由圖2可知，兩組PPO的酶活性變化趨勢相同。隨著貯藏時間的延長，都呈先上升后降低再上升的趨勢。貯藏0～4 d時小幅度增高，4 d～12 d時Con組酶活性從92.0 A/（min·mL）降為82.3 A/（min·mL），LVEF組從91.4 A/（min·mL）降到84.7 A/（min·mL）。對蝦死亡后，體內(nèi)糖原在無氧環(huán)境下發(fā)生糖酵解而產(chǎn)生大量酸類物質(zhì)，pH值下降進(jìn)而影響了PPO的酶活性[16]。12 d后，PPO酶活性逐漸回升，原因是隨貯藏時間的延長而被逐漸激活。在24 d的貯藏試驗中，除12 d外，其余貯藏時間Con組酶活性高于LVEF組，這說明LVEF能夠有效抑制PPO的活性。

2.2 LVEF對PPO總巰基的影響

LVEF對PPO總巰基含量的影響見圖3。

圖3 LVEF對PPO總巰基含量的影響Fig.3 Effect of LVEF on the content of thiol in polyphenol oxidase

巰基一般指蛋白質(zhì)或多肽鏈上半胱氨酸殘基上的巰基基團(tuán)，它在維持蛋白質(zhì)活性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定上有重要作用。圖3顯示，隨著貯藏時間的延長，兩組樣品的總巰基含量整體呈下降趨勢。其中Con組PPO的總巰基含量從初始0.102 4 mmol/g prot到貯藏結(jié)束時下降到0.071 5 mmol/g prot，LVEF組的PPO的總巰基含量從初始0.102 4 mmol/g prot到貯藏結(jié)束時下降到0.021 1 mmol/g prot，分別下降了30.18%和79.39%，LVEF組的PPO的巰基含量下降更明顯。

在體內(nèi)或者人工環(huán)境條件下，蛋白質(zhì)或多肽鏈上巰基和二硫鍵會相互轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化在一定程度上反映了蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的折疊和去折疊的互相轉(zhuǎn)化。由圖3可知，LVEF組樣品的巰基含量在整個貯藏過程中下降速度比Con組快，其原因可能是低壓靜電使得原本在PPO內(nèi)部的活性巰基基團(tuán)因蛋白酶空間折疊和去折疊構(gòu)象的轉(zhuǎn)變而被暴露于表面，激化了化學(xué)反應(yīng)從而導(dǎo)致巰基含量顯著下降[17]。Jia等[18]在用高壓靜電場（high voltage electrostatic field，HVEF）解凍豬肉時發(fā)現(xiàn)，HVEF組比對照組豬肉的肌原纖維蛋白的巰基含量明顯減少。這也顯示電場環(huán)境下蛋白空間構(gòu)象發(fā)生改變進(jìn)而使巰基含量改變。

2.3 LVEF對PPO表面疏水性的影響

蛋白表面疏水性是對蛋白質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)變化的一個敏感測量指標(biāo)，被用于進(jìn)一步評估蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性。在LVEF條件下凡納濱對蝦PPO表面疏水性的變化如圖4所示。

圖4 LVEF對PPO表面疏水性的影響Fig.4 Effect of LVEF on the surface hydrophobicity of PPO

圖4顯示，在冷凍處理條件下，PPO分子被展開和拉伸，空間結(jié)構(gòu)變得松散，因此隨著貯藏時間的延長，兩組樣品的表面疏水性均呈上升趨勢。經(jīng)過24 d的貯藏，其中Con組對蝦樣品PPO表面疏水性從初始值的28.47 μg升高到 73.90 μg，而LVEF組對蝦樣品PPO表面疏水性則由初始值28.47 μg升高到85.10 μg，LVEF組升高較Con組明顯。在貯藏過程中因腐敗微生物代謝和生化反應(yīng)使蛋白質(zhì)變質(zhì)，構(gòu)象破壞，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致疏水性增加。而LVEF組的表面疏水性上升較Con組高的原因可能是靜電場釋放O3會使得蛋白質(zhì)的表面疏水性增加。

2.4 LVEF對PPO總蛋白的影響

總蛋白含量是反映蛋白質(zhì)變性程度的一個重要指標(biāo)。對蝦在冷凍貯藏期間，腐敗微生物代謝及生物內(nèi)源酶會使對蝦體內(nèi)蛋白質(zhì)被逐漸分解，蛋白質(zhì)的構(gòu)象被破壞，因此總體蛋白含量下降。LVEF對PPO總蛋白的影響見圖5。

圖5 LVEF對PPO總蛋白的影響Fig.5 Effect of LVEF on total protein of polyphenol oxidase

圖5顯示，在24d的貯藏期間，兩組的總蛋白含量均呈下降趨勢，但Con組總蛋白含量下降速率較LVEF組更緩慢。LVEF組的總蛋白含量由初始值84.88 gprot/L降為42.48 gprot/L，Con組由84.81gprot/L降為58.87gprot/L。說明LVEF對于PPO的蛋白變性具有促進(jìn)作用。貯藏20 d后，LVEF處理加速了PPO的變性，蛋白質(zhì)變性成為總蛋白含量下降的主要原因，導(dǎo)致總蛋白呈“斷崖式”下降。

2.5 LVEF對PPO的Ca2+-ATPase活性的影響

不同貯藏方式下的PPO中Ca2+-ATPase活性差異如圖6所示。

圖6 LVEF對Ca2+-ATPase的影響Fig.6 Effect of LVEF on Ca2+-ATPase

由圖6可知，LVEF組的Ca2+-ATPase活性初始值為 0.064 2 U/mg prot，24 d 后僅為 0.022 7 U/mg prot；Con組的Ca2+-ATPase活性初始值為0.064 2U/mg prot，24 d后為0.042 8 U/mg prot。兩組在前期下降速度緩慢，但貯藏20 d時，Con組的Ca2+-ATPase下降速率較穩(wěn)定，而LVEF組則下降明顯，說明貯藏后期蛋白質(zhì)變性程度加劇，這與總蛋白含量的研究結(jié)果一致。Ca2+-ATPase活性可作為蛋白質(zhì)的變性指標(biāo)，說明了LVEF會加速PPO蛋白變性。Huang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，電場可以降低酯酶的活性，維持產(chǎn)品的質(zhì)量。

2.6 SDS-PAGE測定結(jié)果

PPO在兩種條件下貯藏的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖7所示。

圖7 SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.7 SDS-PAGE analysis results

由圖7的SDS-PAGE可知，PPO分子質(zhì)量約為210 kDa，這與 Nirmal等[19]結(jié)論相似。在 8、16、24 d 貯藏期間，LVEF組與Con組相比，各條帶色度和寬度均沒有出現(xiàn)明顯變化，即沒有觀察到PPO的降解。各組及各貯藏期間PPO分子質(zhì)量都在210 kDa，說明LVEF并不是通過降解PPO蛋白分子來影響酶活性。Xie等[17]在用LVEF解凍牛肉試驗研究中也發(fā)現(xiàn)，LVEF不會影響蛋白分子質(zhì)量。

2.7 PPO圓二色譜分析

PPO圓二色譜分析見圖8，多酚氧化酶二級結(jié)構(gòu)比例見表1。

圖8 多酚氧化酶圓二色譜分析Fig.8 Circular dichroism analysis of PPO

表1 多酚氧化酶二級結(jié)構(gòu)比例Table 1 Secondary structure analysis of polyphenol oxidase

圓二色譜中180 nm～260 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)可以反映蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象的光活性基團(tuán)的肽鍵的分布區(qū)。α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)反映的是蛋白質(zhì)分子的有序性，而β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等則體現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子的無序性[20]。

由圖8可知，α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)象的CD譜的線性疊加，兩組色譜圖均在220 nm處具有負(fù)峰，這是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，說明PPO中有多種構(gòu)象并存，并以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。

由表1可知，LVEF處理后的PPO的α-螺旋及β-折疊含量減少，β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲含量相對增高，表明LVEF通過改變PPO的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊比例改變酶活性。

3 結(jié)論

本研究考察了LVEF對凡納濱對蝦PPO性質(zhì)的影響。除12 d外，其余貯藏時間LVEF組PPO酶活性低于Con組，兩組樣品的總巰基、總蛋白含量和Ca2+-ATPase活性總體呈下降的趨勢，但LVEF組樣品下降更為明顯，這說明LVEF有促進(jìn)PPO蛋白變性的作用；SDS-PAGE顯示PPO的分子量未發(fā)生明顯變化，這說明LVEF并不會斷裂PPO的分子鏈；CD譜和表面疏水性的檢測結(jié)果顯示LVEF可能是通過改變PPO的二級結(jié)構(gòu)來影響酶的活性。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LVEF在凡納濱對蝦的微凍保鮮過程中可以通過抑制PPO酶的活性延長產(chǎn)品貨架期，這對于對蝦的儲運(yùn)銷售具有指導(dǎo)意義，并為對蝦產(chǎn)品的儲運(yùn)保鮮提供了新的思路。