張建羽,張瓊林

（南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津 300071）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）屬于條件致病菌，是導(dǎo)致院內(nèi)感染的主要原因之一［1-2］，囊性纖維化、艾滋病、器官移植、燒傷和尿毒癥等免疫力低下的人群較易被該菌感染［3］。由于該菌的天然內(nèi)在耐藥性，后天獲得性耐藥性和適應(yīng)性耐藥性復(fù)雜交織，使臨床治療面臨巨大的挑戰(zhàn)，已被世界衛(wèi)生組織列入多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）致病菌［4-5］。

3′，5′-環(huán)二鳥(niǎo)苷［Bis-（3′-5′）cyclic diguanylic acid，c-di-GMP］是細(xì)菌的第二信使，能夠感應(yīng)胞外信號(hào)，通過(guò)升高或降低其在胞內(nèi)的水平，調(diào)控胞內(nèi)相關(guān)酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)菌行為和多種表型，如運(yùn)動(dòng)性、毒力、致病性、抗生素產(chǎn)生、生物膜形成、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期控制和細(xì)胞通訊等［6-7］。在P.aeruginosa中，二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶催化三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosinetriphosphate，GTP）合成c-di-GMP，磷酸二酯酶A將c-di-GMP線(xiàn)性化為中間產(chǎn)物二鳥(niǎo)苷磷 酸 ［5′-phosphoguanylyl-（3′，5′）-guanosine，pGpG］，下一步由磷酸二酯酶B（phosplodiesterase-B，PDE-B） 降解為鳥(niǎo)苷單磷酸 （guanosinc monophosphate，GMP）， 而 寡 核 苷 酸 酶（oligorbonuclese，Orn）是PDE-B的主要來(lái)源［8-9］。由此可見(jiàn)，Orn是胞內(nèi)c-di-GMP代謝通路中的關(guān)鍵酶。研究［10-11］顯示：低水平c-di-GMP能夠啟動(dòng)細(xì)菌的三型分泌系統(tǒng)致使宿主表現(xiàn)出急性感染癥狀，而高水平啟動(dòng)六型分泌系統(tǒng)致使宿主表現(xiàn)出慢性感染癥狀。目前，銅綠假單胞菌寡核苷酸酶（P.aeruginoseOrn，PaOrn）的三維結(jié)構(gòu)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)表達(dá)純化PaOrn蛋白、蛋白晶體篩選和酶活性實(shí)驗(yàn)，探討該蛋白與P.aeruginosa毒性的關(guān)系，為藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑和儀器

pET 32M3C質(zhì)?；趐ET32a載體改造，將thrombin酶切位點(diǎn)替換為PreScission Protease酶切位點(diǎn)。大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α菌株購(gòu)自大連TaKaRa公司，E.coliBL21（DE3）菌株購(gòu)自北京博邁德公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，LB培養(yǎng)基、瓊脂、瓊脂糖、氯化鈉（NaCl）、咪唑和硫酸鎳等購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，GelRed購(gòu)自美國(guó)Biotium公司，結(jié)晶試劑購(gòu)自美國(guó)Hampton Research公司。AKTA純化系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)通用公司，核酸電泳儀、凝膠成像儀和電泳儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 PaOrn生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析

通過(guò)http：//web.expasy.org/protparam/平臺(tái)對(duì)PaOrn蛋白質(zhì)序列進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，包括相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸總數(shù)、理論等電點(diǎn)和穩(wěn)定性推測(cè)等，為電泳結(jié)果分析、分子篩選和純化工藝提供指導(dǎo)。通過(guò)http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/平臺(tái)分析氨基酸序列是否含信號(hào)肽，若含信號(hào)肽需截去；通過(guò)http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/服務(wù)器分析跨膜區(qū)；通過(guò)http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網(wǎng)址分析蛋白結(jié)構(gòu)相似性，若蛋白結(jié)構(gòu)相似度高于30%，可采用分子置換方法解析結(jié)構(gòu)，若低于30%可采用同晶置換和多波長(zhǎng)反常散射［12］等方法。

1.3 pET 32M3C-PaOrn重組質(zhì)粒構(gòu)建

Orn在P.aeruginosa基因組中編號(hào)為PA4951，以P.aeruginosa為擴(kuò)增模板，通過(guò)PCR獲得Orn基因片段，采用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ處理Orn片段和質(zhì)粒pET 32M3C，使基因片段和載體暴露黏性末端，通過(guò)T4連接酶將其連接，最后得到pET 32M3C-PaOrn重組質(zhì)粒；以pET 32M3CPaOrn為模板，PCR定點(diǎn)突變Orn基因，從而獲得pET 32M3C-PaOrnD11A、pET 32M3C-PaOrnE13A、pET 32M3C-PaOrnD111A、pET 32M3C-PaOrnH157A和pET 32M3C-PaOrnD162A點(diǎn)突變重組質(zhì)粒。最終以測(cè)序結(jié)果為準(zhǔn)，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒通過(guò)熱激法分別轉(zhuǎn)入DH5α和BL21（DE3）中，用于質(zhì)粒擴(kuò)增和基因表達(dá)。

1.4 Orn的表達(dá)和純化

將菌種以1%（V/V）接種于液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素抗性），200 r·min－1、37℃過(guò)夜培養(yǎng)?；罨蟮木N仍按1%（V/V）接種于液體LB培養(yǎng)基，200 r·min－1、37℃培養(yǎng)4 h。低溫16℃誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度0.3 mol·L－1，誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。4 000 r·min－1離 心20 min收 集 菌 體，使用20 mol·L－1Tris和150 mol·L－1NaCl（pH 8.0）緩沖液重懸。重懸菌液采用高壓勻漿破碎儀850 MPa、4℃破碎菌液，破碎液4℃、18 000 r·min－1離心45 min后取上清液冰浴。①Ni親和層析：目標(biāo)蛋白的組氨酸（histidine，His）標(biāo)簽可與Ni填料結(jié)合，蛋白液以2 mL·min－1流速與Ni色譜柱結(jié)合，使用平衡緩沖液洗去非特異性結(jié)合，向?qū)游鲋屑尤?.2 mg PreScission Protease蛋白酶，取下Ni色譜柱4℃保持48 h；使用平衡緩沖液沖洗Ni色譜柱，PaOrn和PreScission Protease蛋白酶被沖洗去除，融合標(biāo)簽保留于Ni色譜柱上。②GST親和層析：酶切引入PreScission Protease蛋白酶帶有GST標(biāo)簽，可經(jīng)GST親和層析去除。采用20 mmol·L－1Tris（pH 8.0）緩沖液沖洗GST色譜柱，樣品溶液緩慢滴加至重力層析柱，同時(shí)收集穿透液。③陰離子交換層析：采用20 mmol·L－1Tris（pH 8.0）緩沖液沖洗色譜柱，將GST層析的洗脫液以2 mL·min－1流速上樣，平衡緩沖液洗去非特異性結(jié)合，緩沖 液20 mmol·L－1Tris和1 mol·L－1NaCl（pH 8.0），以0%～50%、90 min的線(xiàn)性梯度洗脫，收集1.2 mL洗脫液，根據(jù)收集管內(nèi)聚丙烯酰胺凝膠結(jié)果收集樣品。使用超濾濃縮管濃縮樣品并將PaOrn蛋白置換至20 mmol·L－1Tris（pH 8.0）緩沖液中，－80℃條件下保存。

1.5 晶體條件篩選

采用商業(yè)化結(jié)晶試劑和坐滴法篩選晶體。初篩試劑各取100 μL，對(duì)應(yīng)加入至48孔結(jié)晶板中。PaOrn樣品配制為5和10 g·L－1工作濃度，分別取1 μL滴入結(jié)晶孔，池液1 μL懸滴于樣品上，膠帶密封結(jié)晶板。結(jié)晶板置于16℃恒溫室靜置，3 d后采用倒置顯微鏡觀察結(jié)晶情況。PaOrn晶體與GMP以1∶3摩 爾 比 共 同 孵 育，PaOrnD11A晶 體 與pGpG以1∶3的摩爾比共同孵育，16℃孵育3 d。

1.6 尿素聚丙烯酰胺（Urea-PAGE）法驗(yàn)證PaOrn活性

PaOrn水解10 nt RNA產(chǎn)物經(jīng)Urea-PAGE法鑒定［13］。分 別 配 制0.1 mmol·L－110 nt RNA和0.13 mmol·L－1PaOrn蛋白，稀釋液均為20 mmol·L－1Tris、100 mmol·L－1NaCl和2 mmol·L－1二氯化錳（MnCl2），pH 8.0，冰浴。將0.1 mmol·L－110 nt RNA（36 μL）和0.13 mmol·L－1PaOrn溶液置于37℃水浴中預(yù)熱5 min，向預(yù)熱的底物中加入1.8 μL PaOrn，迅速斡旋混勻，分別在如下反應(yīng)時(shí)間取樣4 μL：0、2、4、6、8、10和20 min。迅速取樣，并立即加入甲酰胺緩沖液，95℃加熱5 min，冰浴5 min，13 000 g離心10 min，取同體積的上清液上樣。采用300 V電壓預(yù)電泳3 min，然后 電壓調(diào)至220 V運(yùn)行40 min。取出膠片，去離子水清洗3遍，GelRed［14］染 色15 s，立 即 取 出 并 采 用ChemiDocMP成像系統(tǒng)拍照。

1.7 高分辨質(zhì)譜法驗(yàn)證蛋白活性

配 制0.01 mmol·L－1pGpG和0.13 mmol·L－1PaOrn蛋 白，稀 釋 液 均 為20 mmol·L－1Tris，pH 8.0。取40 μL pGpG溶液，放入37℃水浴中預(yù)熱5 min，向 其 中 加 入0.13 mmol·L－1PaOrn溶液1.12 μL，反 應(yīng)8 s后 立 刻98℃加 熱10 min，18 000 g離心10 min，取25 μL上清液進(jìn)行高分辨質(zhì)譜Q TOF［15］定性分析，采用MassLynx軟件分析數(shù)據(jù)，驗(yàn)證PaOrn蛋白活性。

2 結(jié) 果

2.1 PaOrn生物信息學(xué)分析

PaOrn相對(duì)分子質(zhì)量為20 826，由180個(gè)氨基酸組成，理論等電點(diǎn)為5.48，摩爾吸光系數(shù)ε為1.349 g·L－1，PaOrn親水指數(shù)為－0.494，屬于親水性蛋白。PaOrn無(wú)信號(hào)肽，無(wú)需修改氨基酸殘基序列，見(jiàn)圖1 A。PaOrn不含跨膜區(qū)，非膜蛋白，可選擇常規(guī)純化和結(jié)晶，見(jiàn)圖1 B。PaOrn是3′，5′核酸外切酶超家族核酸外切酶家族（Psp-Glu-Asp-His，DEDDh）的一員，成員擁有相似的結(jié)構(gòu)域，見(jiàn)圖1 C。PaOrn與霍亂弧菌寡核苷酸酶VcOrn（PDB ID∶6N6A）［16］有71.59%同源性。

圖1 PaOrn的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatic analysis of PaOrn

2.2 PaOrn的表達(dá)和純化

2.2.1 Ni親和層析PaOrn攜帶硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）標(biāo)簽（相對(duì)分子質(zhì)量12 000）、His標(biāo)簽和連接肽（相對(duì)分子質(zhì)量為2 590），PaOrn相對(duì)分子質(zhì)量為20 826，故重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為35 416。目的蛋白有明顯的胞內(nèi)可溶表達(dá)，并且表達(dá)量可觀，見(jiàn)圖2。按照咪唑濃度梯度洗脫，流速4 mL·min－1，設(shè)置洗脫線(xiàn)性梯度0%～60%緩沖液B（20 mmol·L－1Tris，150 mmol·L－1NaCl，500 mmol·L－1咪 唑），洗 脫90 min。泳 道1～7為洗脫峰。收集洗脫峰，收集液中加入PreScission?Protease蛋白酶切標(biāo)簽，混合均勻置于4℃環(huán)境中，酶切16 h。見(jiàn)圖3。

圖2 SDS-PAGE分析PaOrn蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expression of PaOrn analyzed with SDS-PAGE

圖3 PaOrn的Ni親和層析Fig.3 Ni affinity purification of PaOrn

2.2.2 GST親和層析 低溫酶切后，大多數(shù)標(biāo)簽被切下，以滿(mǎn)足下一步純化需求。經(jīng)GST純化后，去除殘留的PreScission?Protease蛋白酶。收集GST層析后的洗脫液，使用透析袋去除蛋白樣品中的鹽類(lèi)，最終透析至20 mmol·L－1Tris pH 8.0緩沖液中。在透析10 h內(nèi)無(wú)蛋白降解，蛋白穩(wěn)定性好。見(jiàn)圖4。

圖4 PaOrn的GST親和層析Fig.4 GST affinity purification of PaOrn

2.2.3 陰離子交換層析 陰離子交換層析圖中，主峰（3E12～4A2）和雜質(zhì)峰（4A2～4D3）能夠?qū)崿F(xiàn)良好分離。在主峰前半段，即3E12～3F10，有相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)；在主峰后半段，即3F10～4A2，純度較高，在電泳圖上無(wú)雜質(zhì)條帶，可用于結(jié)晶。雜質(zhì)峰中降解物比例偏高。見(jiàn)圖5。

圖5 PaOrn的Q陰離子交換層析Fig.5 Q anion exchange purification of PaOrn

陰離子交換洗脫液因含高濃度鹽溶液，故需通過(guò)超濾濃縮的方式濃縮并置換緩沖液，最終濃縮至20 mmol·L－1Tris（pH 8.0）中，濃度為20 g·L－1。濃縮后蛋白純度高，可用于結(jié)晶，見(jiàn)圖6。濃縮物分裝冷凍保存，避免反復(fù)凍融。

圖6 PaOrn濃縮物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of PaOrn concentration

2.3 PaOrn結(jié)晶條件篩選及優(yōu)化

初篩時(shí)，PaOrn可于多種條件下出現(xiàn)晶體，如WizardⅠ#18、WizardⅢ#4、WizardⅣ#20、WizardⅡ#48、Index #62、PEG/IonⅡ#29和PEG/IonⅡ#33等。經(jīng)X射線(xiàn)衍射驗(yàn)證，均無(wú)法用于解析蛋白結(jié)構(gòu)。于WizardⅠ#12：1.0 mol·L－1（NH4）2HPO4、0.1 mol·L－1Imidazole、pH 8.0條件下出現(xiàn)形狀規(guī)則的晶體。經(jīng)衍射，該晶體的分辨率 為1.85，PaOrn-GMP和PaOrnD11A-pGpG復(fù) 合物的分辨率分別為1.90和1.70。見(jiàn)圖7。

圖7 PaOrn及其復(fù)合物晶體圖Fig.7 Photoes of crystals of PaOrn and its complexes

2.4 PaOrn核酸降解實(shí)驗(yàn)

因PaOrn能夠降解2～5 nt RNA［17］，故本研究設(shè)計(jì)了10 nt長(zhǎng)度的降解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其是否可降解更長(zhǎng)的底物核酸片段。在Mg2+催化下，反應(yīng)20 min后，10 nt nanoRNA已被徹底水解。在Mn2+催化下，反應(yīng)6 min后，10 nt nanoRNA即可被徹底水解。因此，PaOrn能夠降解更長(zhǎng)片段的寡核苷酸，且Mn2+催化效率更高。PaOrn的DEDD位點(diǎn)Asp11、Glu13、Asp111、His157和Asp162突變后，無(wú)法降解底物10 nt nanoRNA，表明酶活性已經(jīng)喪失。見(jiàn)圖8。

圖8 Urea-PAGE法分析核酸降解Fig.8 Nucleic acid degradation analyzed by Urea-PAGE method

2.5 PaOrn降解底物的定性分析

高分辨率質(zhì)譜Q TOF可精確定性，相對(duì)分子質(zhì)量精確至小數(shù)點(diǎn)后4位。目標(biāo)檢測(cè)物為核酸，使用離子對(duì)試劑三乙胺和六氟異丙醇增強(qiáng)的分析能力［18］。由于底物pGpG昂貴，因此上樣量較少，質(zhì)譜基線(xiàn)抬高。本研究嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間，使底物pGpG未反應(yīng)完全。pGpG（Mr 707.09）可被純化的PaOrn降解為GMP（Mr 362.05）。見(jiàn)圖9。該結(jié)果與其他來(lái)源的Orn活性研究［19］相吻合，Orn降解pGpG為GMP。

圖9 高分辨率質(zhì)譜Q TOF定性分析Fig.9 Qualitative analysis by high-resolution mass spectrometry Q TOF

3 討 論

P.aeruginosa因其條件致病性和多重耐藥性使常規(guī)臨床治療效率變低或無(wú)效，目前尚無(wú)有效且長(zhǎng)期的治療方案，嚴(yán)重威脅到人類(lèi)生命健康。PaOrn作為第二信使c-di-GMP代謝途徑中的重要參與者，對(duì)細(xì)菌的耐藥性和毒性起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

本研究經(jīng)PaOrn蛋白表達(dá)、Ni親和層析、GST親和層析和IEX-Q陰離子交換層析多步純化，獲得高純度PaOrn蛋白，并篩選出晶體PaOrn（1.85）、PaOrnD11A-pGpG（1.70）和PaOrn-GMP（1.90）。高分辨質(zhì)譜結(jié)果顯示：PaOrn能夠?qū)GpG降 解 為GMP，在P.aeruginosa中，Orn又是降解pGpG的主要來(lái)源，因此Orn可通過(guò)調(diào)節(jié)c-di-GMP水平發(fā)揮菌體的多種生物學(xué)作用，如毒力、生物被膜形成及運(yùn)動(dòng)能力。與其他來(lái)源Orn序列比對(duì)，找到DEDDh位點(diǎn)，通過(guò)點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn) 獲 得 突 變 蛋 白 （OrnD11A、OrnE13A、OrnD111A、OrnH157A和OrnD162A），經(jīng)活性驗(yàn)證，點(diǎn)突變致使酶活性完全喪失。這些保守的活性位點(diǎn)可組成一個(gè)偏堿性的活性口袋，推測(cè)金屬陽(yáng)離子可能優(yōu)先進(jìn)入催化區(qū)域，寡核酸底物通過(guò)金屬離子的定位及路易斯酸堿作用進(jìn)入活性口袋。二價(jià)金屬陽(yáng)離子Mn2+的催化效果要優(yōu)于Mg2+，推測(cè)可能Mn2+更容易與核酸形成絡(luò)合物，募集底物進(jìn)入催化空間。本研究中核酸降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PaOrn除能夠水解天然底物pGpG和2～5 nt RNA外，還可降解長(zhǎng)達(dá)10 nt RNA。與霍亂弧菌VcOrn（PDB ID 7V5H）、大腸桿菌EcoOrn（PDB ID 1YTA）和貝納特氏立克次體CbuOrn（PDB ID 3TR8）等其他來(lái)源的Orn結(jié)構(gòu)比較顯示：活性口袋均有“三明治”夾層結(jié)構(gòu)，能夠較好地固定底物，可能通過(guò)His殘基激活水分子傳遞電子，促使磷酸二酯鍵斷裂。底物越短，越有利于其與活性口袋的結(jié)合；底物越長(zhǎng)，越不利于口袋的捕獲［20］。PaOrn可降解更長(zhǎng)片段的底物，但由于抓取力不夠，催化效率和結(jié)合力均可能會(huì)變?nèi)?。?dāng)DEDD活性位點(diǎn)突變時(shí)，PaOrn完全喪失催化活性，而PaOrn又是降解中間代謝產(chǎn)物pGpG的主要來(lái)源，若P.aeruginosa中Orn失活，則第二信使c-di-GMP水平升高。研究［21］顯示：c-di-GMP水平升高會(huì)激活T6SS慢性感染系統(tǒng)，降低T3SS急性感染系統(tǒng)，推測(cè)P.aeruginosa急性毒力減弱。PaOrn與P.aeruginosa毒力之間存在密切關(guān)聯(lián)，針對(duì)PaOrn晶體結(jié)構(gòu)和活性的研究具有重要的意義，可為研究潛在的藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。