陳 為,沈 楠,韓宛娜,郗艷麗,任 曠,金連海,許 娜

（1.吉林醫(yī)藥學院生物醫(yī)藥雙創(chuàng)轉(zhuǎn)化實訓平臺,吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學院低壓低氧環(huán)境與健康干預創(chuàng)新中心,吉林 吉林 132013；3.吉林醫(yī)藥學院毒理學教研室，吉林 吉林 132013）

在哺乳動物體內(nèi)，乳酸是無氧氧化的代謝產(chǎn)物。作為糖類分解的主要代謝途徑之一，無氧氧化的生理功能在于迅速提供能量，對許多生理和病理過程具有重要意義，如劇烈運動的肌纖維供能、傷口修復、炎癥活躍期免疫細胞供能和癌細胞的快速增殖供能等［1］。此外，長期慢性炎性疾病也可引起體內(nèi)氧利用不足而最終導致乳酸水平升高，包括慢性呼吸功能障礙、代謝性疾病和尿毒癥等［2］。近年來，研究者以乳酸為核心，在化學、生物化學、分子生物學、臨床醫(yī)學和運動醫(yī)學等領(lǐng)域開展了多項研究，形成了無氧閾和Warburg效應等多種學說［3］。隨著能量代謝微環(huán)境和免疫調(diào)控機制研究的不斷深入，乳酸在平衡內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫反應、調(diào)控肌肉再生、神經(jīng)發(fā)生和蛋白質(zhì)修飾等方面均有重要的作用［4-8］。乳酸研究由“代謝廢物”和“檢測指標”進入了“調(diào)節(jié)因子”的新范式。

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類位于細胞表面高度保守的模式識別受體超家族，能夠識別多種病原體及炎性分子，參與炎癥反應。研究［9］表明：巨噬細胞表面及內(nèi)部分布有多種TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10），且TLR4相關(guān)的信號傳導對巨噬細胞極化有關(guān)鍵的影響。接頭分子在TLRs信號傳導過程中發(fā)揮重要的作用，目前發(fā)現(xiàn)TLRs的接頭分子有5種，包括髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、誘導β干擾素的Toll/白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）受體結(jié)構(gòu)域 銜 接 蛋 白［Toll/IL-1 receptor（TIR）domain containing adaptor protein inducing interferon-β，TRIF］、類MyD88接頭分子（MyD88-adaptor like protein，MAL）、TRIF相 關(guān) 接 頭 分 子（TRIFrelated adaptor molecule，TRAM）和包含TIR結(jié)構(gòu)域的分子等，不同TLRs家族成員可依賴一個或多個接頭分子傳導信號［10］。巨噬細胞廣泛存在于人體組織中，在免疫反應中具有明顯的可塑性，即在不同的微環(huán)境或細胞外刺激物作用下巨噬細胞可發(fā)生M1極化或M2極化［11］。作為TLR4發(fā)揮生理功能的2個重要接頭分子，MyD88和TRIF介導的信號傳導途徑分別為MyD88依賴途徑和TRIF依賴途徑，均參與了巨噬細胞極化的調(diào)控［12］。研究［13-15］顯示：乳酸可誘導巨噬細胞產(chǎn)生M2極化，然而對于細胞內(nèi)部具體何種接頭分子參與乳酸引起M2極化的研究尚未見報道。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近年來快速發(fā)展的一項新技術(shù)，目前已廣泛應用于生命領(lǐng)域的研究［16］。本研究借助CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定向敲除接頭分子MyD88和TRIF，探討二者在促進乳酸誘導巨噬細胞M2極化中的作用，以期進一步闡明相關(guān)機制，為乳酸的生物調(diào)控作用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器小鼠單核巨噬細胞白血病Raw264.7細胞、人胚腎293T細胞和大腸桿菌DH5-α（吉林醫(yī)藥學院生物醫(yī)藥雙創(chuàng)轉(zhuǎn)化實訓平臺實驗室保存）。pSPAX2、pMD2G、穿梭質(zhì)粒、pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen載體和LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑盒（上海漢恒生物科技有限公司），質(zhì)粒抽提試劑盒（美國Axygen公司），RNA提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司），實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（大連寶生物工程有限公司），胎牛血清、1640培養(yǎng)液、0.25%胰酶和Puromycin（美國Gibco公司），乳酸（美國Sigma公司），MyD88蛋白抗體、TRIF蛋白抗體、核因子κB抑制蛋白α（nuclear factor κB inhibitor protein-α，IκB-α）抗體和NF-κB p65蛋白（NF-κB p65 protein，p65）抗體（美國Cell Signaling Technology公司），羊抗兔和羊抗鼠IgG抗體（美國Proteintech公司），小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）、γ干擾素（interferon-γ，INF-γ） 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測 定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（深圳達科為生物技術(shù)有限公司），ECL增強型化學發(fā)光試劑盒（美國GE公司）。CO2細胞培養(yǎng)箱和低溫高速離心機（美國Thermo公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司），熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司），Infinite F500多功能高端酶標儀（奧地利TECAN公司），電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），高端凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）。

1.2 引物序列設(shè)計本研究所采用的引物由吉林省庫美生物科技有限公司設(shè)計合成。見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of PCR

1.3 慢病毒法制備Raw264.7-Cas9細胞將pSPAX2、pMD2G和攜帶Cas9穿梭質(zhì)粒擴增，抽提后共轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)72 h后，收集上清，去除細胞碎片后，10 000 g離心2 h，上清中獲取高滴度HBLV-Cas9-PURO慢病毒，稀釋計數(shù)法測定病毒滴度。Raw264.7細胞鋪板，細胞密度生長至約50%時，以病毒感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為20感 染HBLV-Cas9-PURO。24 h后更換含10 g·L－1Puromycin新鮮完全培養(yǎng)液。收獲細胞以進行基因敲除。提取細胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、PCR和瓊脂糖電泳觀察Cas9基因表達情況，采用熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染情況。

1.4 MyD88和TRIF基因敲除細胞制備根據(jù)小鼠MyD88和TRIF在NCBI的基因序列，設(shè)計向?qū)NA（guide RNA，gRNA）序列，引物序列由吉林省庫美生物科技有限公司設(shè)計合成（表2）。序列合成后，退火為雙鏈Oligo序列，T4連接酶接入含ZsGreen熒光標記的pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen線性化表達載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，Amp抗性平板37℃培養(yǎng)過夜，挑菌并擴大培養(yǎng)。將測序驗證正確的DH5α陽性克隆進行質(zhì)粒提取、慢病毒包裝及滴度測定。

表2 gRNA寡核苷酸序列Tab.2 Sequences of gRNA oligonucleotides

Raw264.7-Cas9細 胞 以5×105mL－1密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞生長至約50%時，以MOI為30感染包裝的各組慢病毒，感染24 h后更換含10 mg·L－1Puromycin新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，以獲得穩(wěn)定基因敲除細胞株。感染MyD88-gRNA慢病毒細胞為MyD88-KO細胞組，感染TRIF-gRNA慢病毒細胞為TRIF-KO細胞組，未感染Raw264.7細胞為對照組。

1.5 RT-qPCR法檢測各組細胞中MyD88和TRIF mRNA表達水平收集對照組、MyD88-KO組和TRIF-KO組細胞，采用RNA快提試劑盒提取總RNA，微量紫外分光光度計測定RNA濃度，以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用SYBR?Green PCR Master Mix于熒光定量PCR儀上進行RT-qPCR反 應。采 用2－ΔΔCt法 計 算 各 組 細 胞 中MyD88和TRIF mRNA表達水 平。

1.6 Western blotting法檢測各組細胞中MyD88和TRIF蛋白表達水平采用RIPA裂解液裂解對照組、MyD88-KO組和TRIF-KO組細胞，并提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。每樣本取等量（50 μg）蛋白10% SDS-PAG凝膠電泳，將電泳分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVGF膜上，采用5%脫脂奶粉封閉后，將膜分別與MyD88抗體（1∶2 000）、TRIF抗體（1∶1 000）和β-actin抗體（1∶6 000）4℃條件下孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.7 乳酸誘導Raw264.7細胞極化按照參考文獻［14］中的方法，采用15 mmol·L－1乳酸進行極化誘導實驗，實驗分為未處理Raw264.7細胞組、Raw264.7+乳酸組、MyD88-KO組、MyD88-KO+乳酸組、TRIF-KO組和TRIF-KO+乳酸組，各乳酸組細胞均采用15 mmol·L－1乳酸作用24 h，收集上清和細胞進行后續(xù)實驗。光學顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)表現(xiàn)。采用RNA快提試劑盒提取總RNA，微量紫外分光光度計測定RNA濃度，以總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄。RT-qPCR法檢測各組細胞中巨噬細胞甘露糖受體CD206和精氨酸酶1（arginase1，Arg1）mRNA表達水平。采用ELISA試劑盒檢測細胞上清液中TNF-α、INF-γ和IL-10水平。

15 mmol·L－1乳酸作用各組細胞24 h后，提取各組細胞總蛋白，BCA蛋白定量后SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉1 h，β-actin、TLR4、IκB-α和p65一抗（1∶6 000、1∶1 000、1∶4 000和1∶2 000）4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。

1.8 分子對接檢測乳酸與接頭分子結(jié)合采用Autodock軟件進行分子對接，乳酸分子（ZINC4658560）結(jié)構(gòu)由ZINC數(shù)據(jù)庫下載，TLR4（7mlm）、MyD88（4eo7）和TRIF（3rc4）蛋白結(jié)構(gòu)由PBD數(shù)據(jù)庫下載，導入Autodock對接，選擇第一對接結(jié)構(gòu)并采用PyMOL軟件分析圖像。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。基因敲除各組細胞中MyD88及TRIF mRNA和蛋白表達水平，乳酸誘導后各組細胞中CD206和Arg1 mRNA表達水平，細胞上清中TNF-α、INF-γ和IL-10水平，各組細胞中TLR4、IκB-α和p65蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBLV-Cas9-PURO慢病毒轉(zhuǎn)染Raw264.7細胞和Cas9表達情況HBLV-Cas9-PURO慢病毒轉(zhuǎn)染后Cas9在Raw264.7細胞中成功表達，細胞呈明顯綠色熒光，表明構(gòu)建的慢病毒將Cas9成功導入并表達。見圖1和2。

圖1 Cas9 PCR電泳圖Fig.1 Electrophoregram of Cas9 PCR

2.2 MyD88和TRIF基因敲除后各組細胞中MyD88及TRIF mRNA和蛋白表達水平與對照組比較，MyD88-KO組細胞中MyD88 mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），TRIF-KO組細胞TRIF mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），表明通過慢病毒方式的CRISPER/Cas9基因編輯方法成功敲除MyD88和TRIF。見圖3和4。

圖3 MyD88和TRIF敲除后各組細胞中MyD88和TRIF mRNA表達水平Fig.3 Expression levels of MyD88 and TRIF mRNA in cells in various groups after knockout of MyD88 and TRIF

2.3 乳酸處理后各組細胞中CD206和Arg1mRNA表達水平、細胞形態(tài)表現(xiàn)及細胞因子水平RT-qPCR檢測結(jié)果顯示：與未處理Raw264.7細胞組比較，Raw264.7+乳酸組細胞中CD206和Arg1 mRNA表達水平均明顯升高（P＜0.05）。與MyD88-KO組比較，MyD88-KO+乳酸組細胞中CD206和Arg1 mRNA表達水平均升高（P＜0.05）。與TRIF-KO組比較，TRIF-KO+乳酸組細胞中CD206和Arg1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 RT-qPCR法檢測各組細胞中CD206（A）和Arg1（B）mRNA表達水平Fig.5 Expression levels of CD206（A）and Arg1(B)mRNA in various groups detected by RT-qPCR method

圖2 熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染情況（×40）Fig.2 Transfection of lentivirus observed by fluorescence microscope(×40)

細胞形態(tài)表現(xiàn)：與未處理Raw264.7細胞組比較，Raw264.7+乳酸組細胞表現(xiàn)出較為典型的M2極化形態(tài)，即體積增大、出現(xiàn)明顯的突起偽足和偏錐形細胞比例增加；MyD88-KO組和MyD88-KO+乳酸組細胞同樣表現(xiàn)出M2極化的形態(tài)表現(xiàn)；而TRIF-KO組和TRIF-KO+乳酸組細胞形態(tài)變化不明顯。見圖6。

圖6 光學顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)表現(xiàn)（×20）Fig.6 Morphology of cells in various groups observed by optical microscope(×20)

ELISA法檢測結(jié)果顯示：與未處理Raw264.7細胞組比較，Raw264.7+乳酸組細胞上清液中TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），INF-γ和IL-10水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與MyD88-KO組比較，MyD88-KO+乳酸組細胞上清液中TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），INF-γ水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），IL-10水平明顯升高（P＜0.05）；與TRIF-KO組比較，TRIF-KO+乳酸組細胞上清液中TNF-α水平明顯升高（P＜0.05），INF-γ和IL-10水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組細胞上清液中TNF-α、INF-γ和IL-10水平Tab.3 Levels of TNF-α,INF-γ and IL-10 in cell supernatant in various groups[n=3，x±s，ρB/（ng·L－1）］

圖4 MyD88和TRIF敲除后各組細胞中MyD88和TRIF蛋白表達電泳圖（A，B）和直條圖（C，D）Fig.4 Electrophoregram(A,B)and histogram(C,D)of expressions of MyD88 and TRIF proteins in cells in various groups after knockout of MyD88 and TRIF

2.4 各組細胞中TLR4和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達水平與未處理Raw264.7細胞組比較，其余各組細胞中TLR4蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Raw264.7+乳酸組細胞中IκB-α和p65蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與MyD88-KO組 比 較，MyD88-KO+乳 酸 組 細 胞 中IκB-α和p65蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與TRIF-KO組比較，TRIF-KO+乳酸組細胞中IκB-α和p65蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 Western blotting法檢測各組細胞中TLR4，IκB-α和p65蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B-D）Fig.7 Electrophoregram(A)and histogram(B-D)of expressions of of TLR4，IκB-α and p65 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

2.5 乳酸與TLR4、MyD88和TRIF結(jié)合情況乳酸與TLR4、MyD88和TRIF分子對接模擬結(jié)果顯示：乳酸與TLR4蛋白形成2個氫鍵，分別為ARG55：HH12和LYS128：HZ1，結(jié)合能為－2.72；乳酸與MyD88蛋白形成4個氫鍵，分別為GLU159：HN、ARG160：HN、LYS190：HZ3和LYS190：HZ2，結(jié)合能為－3.24；乳酸與TRIF蛋白形成4個氫鍵，分別為ARG1161：HH12、GLY1162：HN、ARG1161：HN和ARG1161：HE，結(jié)合能為－3.66。提示乳酸與TRIF蛋白結(jié)合優(yōu)于其與MyD88蛋白結(jié)合，與細胞實驗結(jié)果一致。見圖8。

圖8 乳酸與TLR4、MyD88和TRIF對接位點圖Fig.8 Molecular docking views of lactate with TLR4,MyD88,and TRIF

3 討 論

近期研究［17-18］表明：乳酸可作為重要的能量代謝底物和信號分子影響諸多生理進程。傷口愈合組織、實質(zhì)性腫瘤組織和慢性炎性疾病病灶組織中均具有較高濃度乳酸，該現(xiàn)象與細胞快速增殖的供能所需密不可分。而巨噬細胞作為傷口、腫瘤和部分慢性炎性疾病微環(huán)境的重要成員，高濃度乳酸對巨噬細胞的影響也被不斷報道［19-20］。巨噬細胞具有典型的可塑化特性，根據(jù)其功能變化可分為促進炎癥的M1極化和抑制炎癥的M2極化［21］。研究［9］表明：巨噬細胞極化過程中TLR4接頭分子發(fā)揮重要作用。然而乳酸作用后巨噬細胞極化的具體機制尚未完全闡明，因此本研究探討TLR4接頭分子是否參與巨噬細胞極化過程。

TLR4作為首個發(fā)現(xiàn)的TLRs，廣泛分布于巨噬細胞、淋巴細胞和樹突狀細胞等各類免疫細胞表面，是免疫反應的重要靶點［22］。TLR4被細胞外刺激物激活后，可在細胞內(nèi)招募接頭分子調(diào)控下游的信號轉(zhuǎn)導最終引起免疫細胞對外部刺激的反應。巨噬細胞M2極化主要表現(xiàn)為抗炎性細胞因子分泌［IL-10、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和 趨 化 因 子CC配 體18（C-C motif chemokine ligand 18，CCL18）］、釋放活化因子［巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colong-stimulating factor，MCSF）、IL-4和IL-13］和標志性膜蛋白（CD206、Arg1、CD163、CD86和Fizz1）表達等［23］。本研究結(jié)果顯示：在乳酸誘導的M2極化過程中TLR4受體無明顯變化，提示乳酸可能并未直接同TLR4結(jié)合，而是進入細胞內(nèi)部后同接頭分子相互作用而產(chǎn)生調(diào)控效應。本研究進一步的基因敲除實驗結(jié)果顯示：在接頭分子TRIF存在情況下，經(jīng)乳酸誘導后巨噬細胞能夠高表達M2極化的標志分子CD206和Arg1，細胞呈錐形并出現(xiàn)明顯的偽足，釋放抗炎性細胞因子IL-10，抑制炎性因子TNF-α釋放；而進一步的分子對接結(jié)果顯示：與TLR4和MyD88蛋白比較，乳酸可與TRIF蛋白形成較多的氫鍵且結(jié)合能更小，提示乳酸進入細胞內(nèi)部后更易與TRIF蛋白結(jié)合。

NF-κB是巨噬細胞極化調(diào)控過程中的關(guān)鍵信號通 路，調(diào) 節(jié) 大 量 炎 性 因 子 基 因 表 達［24］。NF-κB蛋白是由p65和p50組成的異二聚體，在正常狀態(tài)下因其與抑制蛋白IκB結(jié)合而保持非活性狀態(tài)。當細胞 受 到 炎 性 刺 激 時，IκB激 酶（inhibitor of κB kinase，IKK）復合物被激活，IκB被磷酸化和泛素化降解，與p65和p50異二聚體復合物分離。p65和p50異二聚體復合物進入到細胞核中激活轉(zhuǎn)錄，引起炎癥因子的合成增加［25］。巨噬細胞M2極化的基本生理作用是為了平衡過激的炎癥可能對細胞的損傷，有研究［26］表明：NF-κB信號通路的負向調(diào)控是M2極化過程中的重要機制。本研究結(jié)果顯示：TRIF蛋白存在的情況下乳酸能夠通過下調(diào)巨 噬 細 胞 中IκB-α表達，實現(xiàn)對NF-κB信號通路的抑制效應，即p65表達下調(diào)。研究［27］顯示：細胞中NF-κB信號通路的負性調(diào)控蛋白A20參與TRIF介導的NF-κB活化調(diào)控。而在線粒體上，TRIF作為TLR3的主要接頭分子同樣可參與能量代謝相關(guān)的信號調(diào)控過程［28-29］。最新研究［8］顯示：乳酸能夠以乳酸化蛋白修飾的方式調(diào)控蛋白功能。因此，乳酸在巨噬細胞內(nèi)是否通過A20或TLR3調(diào)控TRIF，或直接修飾TRIF，還需進一步的研究證實。

綜上所述，乳酸作用巨噬細胞后，可通過TRIF使 其 下 游IκB-α蛋 白 表 達 下 調(diào)，從 而 抑 制NF-κB，促進巨噬細胞M2極化。本研究為初步闡明乳酸的免疫調(diào)控作用提供了新的思路和方向。