邵蘇,徐鵬飛,占小平

邵蘇,浙江中醫(yī)藥大學(淳安縣第一人民醫(yī)院)普外科 浙江省杭州市310053

徐鵬飛,占小平,淳安縣第一人民醫(yī)院普外科 浙江省杭州市 311700

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤.據(jù)美國癌癥學會2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)報告,2018年全球胃癌發(fā)病率第6位,死亡率第2位.據(jù)中國癌癥中心2019年發(fā)布的年度報告,在我國胃癌高居惡性腫瘤發(fā)病率第2位,死亡率第3位.胃癌患者由于缺乏有效篩查手段,通常在被診斷時就是晚期階段,或已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)根治的機會.胃癌腹膜轉(zhuǎn)移是晚期胃癌患者首要死亡原因之一,也是臨床胃癌治療的難點.對于胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的患者,化療藥物是治療的首要選擇.面臨著毒副作用大、治愈率低、易出現(xiàn)藥物耐受等問題.溶瘤病毒作為有效抗癌劑,在治療胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移,加快腫瘤的消退速度中展現(xiàn)了不錯的效果.但是給藥方式也是治療胃癌中非常重要的環(huán)節(jié),相比較其他給藥方式,反復(fù)腹膜內(nèi)給藥更適應(yīng)臨床環(huán)境.在臨床試驗中,H101在顯示了良好的抗腫瘤療效和安全性,其上市后臨床應(yīng)用顯示對頭頸部腫瘤、肝癌、胰腺癌等消化道腫瘤均有良好的治療效果.H101是第一個在全球批準上市的溶瘤病毒類抗腫瘤新藥,但是目前尚無將其用于治療胃癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的相關(guān)報道.因此,本研究通過溶瘤病毒H101對胃癌細胞的體外作用,觀察其對胃癌細胞的影響,并探討發(fā)生機制,以期為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者的治療提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 BGC-823細胞系(ATCC),SGC-7901(ATCC),MTS檢測試劑盒(Abcam),Hoechst33342熒光染料(北京索萊寶),鼠抗人E1A、B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、凋亡蛋白(BCL2-associated X,Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3)的特異性抗體(Abcam),羊抗鼠辣根過氧化物酶標記的二抗(Abcam),H101(上海三維生物技術(shù)有限公司,規(guī)格: 5.0×10/支).

1.2 方法

1.2.1 MTS檢測細胞活率: 取對數(shù)生長期的胃癌細胞,消化收集細胞,調(diào)整細胞濃度,接種至96孔板,每孔10個細胞,貼壁過夜;加入不同濃度的H101[感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)值分別為1、5、10、15],繼續(xù)培養(yǎng)48 h,加入MTS,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標儀檢測吸光值.將不加H101的對照組看做100%,各個濃度組的吸光度與對照組的比值,即為細胞存活率.MOI值=病毒滴度×病毒體積/細胞個數(shù).

1.2.2 細胞劃痕實驗: 先用marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻地劃橫線,大約每隔0.5 cm-1 cm一道,橫穿過孔.每孔至少穿過5條線.每孔加入約5×10個細胞,培養(yǎng)過夜.第二天用槍頭比著直尺,盡量垂直于背后的橫線劃痕.用PBS洗細胞3次,去除劃下的細胞,加入不同濃度的H101(MOI值分別為1、5、10、15)和無血清培養(yǎng)基.放入37 ℃,5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng),48 h后取樣,拍照,每孔隨機選擇5處計算劃痕寬度,取平均值.

1.2.3 Hoechst33342染色檢測細胞凋亡: 胃癌細胞BGC-823接種于24孔細胞板的細胞爬片上,每孔2×10個細胞,加入不同濃度的溶瘤腺病毒H101(MOI值分別為1、5、10、15)處理48 h.向24孔板中加入Hoechst33342染液,避光室溫染色10 min,滴加含有DAPI(4,6-diamino-2-phenyl indole)的封片劑于載玻片上,隨后放上細胞爬片進行封片操作,熒光顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示H101可以有效誘導(dǎo)凋亡小體的形成.

1.2.4 Western blot檢測細胞相關(guān)蛋白的表達: 取對數(shù)生長期的胃癌細胞,消化收集細胞,調(diào)整細胞濃度,接種至6孔板,每孔10個細胞,貼壁過夜;加入不同濃度的H101(MOI值分別為1、5、10、15)繼續(xù)培養(yǎng)48 h;利用RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液提取細胞總蛋白,進行Western blot,檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3通路的表達調(diào)控作用.

用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件分析,計量資料用mean±SD表示,方差齊性行檢驗,符合正態(tài)分布行檢驗,其余行校正檢驗.計數(shù)資料用%表示,行檢驗,＜0.05表示有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 H101對胃癌細胞增殖的影響 溶瘤腺病毒H101處理48 h后,把對照組看做100%,MTS結(jié)果顯示與MOI值為1時相比,MOI值為15的時候,H101在體外可以明顯殺傷BGC-823和SGC-79012種胃癌腫瘤細胞,差異具有統(tǒng)計學意義(=0.024,=0.004),如圖1.Western blot檢測E1A表達情況,進而驗證H101可以在胃癌細胞中有效復(fù)制(圖2).在增殖實驗中發(fā)現(xiàn)相對于BGC-823細胞,SGC-7901細胞對H101的敏感性更差,因此選取敏感性較差的SGC-7901細胞作為研究重點.

圖1 四氮唑藍顏化合物MTS檢測胃癌細胞存活率.A: 人胃腺癌細胞-823;B: BGC-823;人胃腺癌細胞-7901(SGC-7901).與MOI=1組相比,aP＜0.05,aaaP＜0.005.MOI: 感染復(fù)數(shù).

圖2 Western blot檢測E1A表達.

2.2 H101對胃癌細胞遷移能力的影響 48 h后,與對照組的遷移距離(0.42±0.07) mm和MOI=1組的遷移距離(0.38±0.08) mm相比,MOI=5組,MOI=10組和MOI=15組的遷移距離(0.25±0.05) mm,(0.15±0.04) mm,(0.16±0.04) mm明顯更低,,(=0.032,=0.022,=0.026),如圖3.

圖3 劃痕實驗檢測細胞的遷移能力.A: 對照組;B: MOI=1;C: MOI=5;D: MOI=10;E: MOI=15;F: 0H的劃痕.圖示長度為200 μm.MOI: 感染復(fù)數(shù).

2.3 H101對胃癌細胞凋亡的影響 48 h后,與MOI=1組相比,MOI=5、MOI=10和MOI=15組的凋亡小體數(shù)量更多(=0.044,=0.035,=0.021),如圖4.

圖4 細胞凋亡情況.A: Hoechst33342染色.圖示長度為100 μm;B: 凋亡小體統(tǒng)計結(jié)果.與MOI=1組相比,aP＜0.05.MOI: 感染復(fù)數(shù).

2.4 Western blot檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白 與對照組和MOI=1組相比,MOI=5、MOI=5和MOI=10組的Bcl-2表達量較低(=0.035,=0.028,=0.016);而Bax表達量更高(=0.036,=0.021,=0.019);Caspase-3表達量更高(=0.035,=0.027,=0.011),如圖5.

圖5 細胞相關(guān)凋亡蛋白的表達. A: Western Blot結(jié)果;B: 各組凋亡蛋白的相對表達量.與MOI=1組相比,aP＜0.05.MOI: 感染復(fù)數(shù).Bcl-2: B淋巴細胞瘤-2蛋白;Bax: 凋亡蛋白;Caspase-3: 半胱氨酸蛋白酶-3.

3 討論

胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的具體機制尚未完全明確,目前大多數(shù)學者較為認同的發(fā)病機制為“種子土壤”學說.早期胃癌腹膜轉(zhuǎn)移無明顯的癥狀,很難被檢測.晚期的腹膜轉(zhuǎn)移容易被檢測,但術(shù)后效果差.常用的腹膜轉(zhuǎn)移檢測方法有影像學檢查、腹腔沖洗液細胞學檢查、標記物檢測等,但都不能作為唯一的診斷依據(jù),需要多種方法共同診斷做出精確的判斷.由于胃癌患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移治療效果不佳且預(yù)后效果差,因此腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制、診斷以及治療方案問題亟待解決.研究顯示,化療、腹腔灌注化療、腹腔熱灌注化療、免疫治療及手術(shù)等多種方法聯(lián)合進行預(yù)防式治療及治療,提高患者的生存質(zhì)量.溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)是指一類天然或者經(jīng)過基因改造后可以特異性靶向和殺死癌細胞的病毒,同時它還能激發(fā)免疫反應(yīng),吸引更多免疫細胞來繼續(xù)殺死殘余癌細胞.相較于其他腫瘤免疫療法,溶瘤病毒具有殺傷效率高、靶向性好、副作用小、多種腫瘤殺傷途徑以避免耐藥性以及成本低廉等優(yōu)點.因此,溶瘤病毒療法作為一種新型癌癥治療策略,在癌癥治療領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注.目前已在多種體內(nèi)腫瘤模型和臨床試驗中得到證實溶瘤病毒在腫瘤治療中具有良好的安全性和耐受性.

H101為的線性雙鏈DNA病毒,刪除了E1B-55KD基因和E3部分基因片段的人5型腺病毒.E1B-55KD可以抑制p53,利于病毒復(fù)制、并協(xié)助晚期mRNA的出核轉(zhuǎn)錄翻譯,刪除后P53將導(dǎo)致細胞周期停滯或誘導(dǎo)凋亡,阻礙病毒復(fù)制并影響晚期mRNA出核.腫瘤細胞由于遺傳的不穩(wěn)定性,細胞核的核孔變大,彌補E1B-55KD的作用,即使病毒刪除了E1B-55KD,病毒晚期mRNA的出核仍不受影響,可順利完成復(fù)制.E3主要是破壞宿主的免疫防御機制,刪除后將會增強溶瘤反應(yīng),提高免疫誘導(dǎo)能力,殺死腫瘤細胞,誘導(dǎo)全身、長期特異性抗腫瘤免疫反.Kawaguchi等將溶瘤病毒作為有效抗癌劑治療胃癌腹膜轉(zhuǎn)移,發(fā)現(xiàn)腫瘤消退程度增加,同時也驗證了相比于其他給藥方式,反復(fù)腹膜內(nèi)給藥更適應(yīng)臨床環(huán)境.在臨床試驗中,H101在顯示了良好的抗腫瘤療效和安全性,其上市后臨床應(yīng)用顯示對頭頸部腫瘤、肝癌、胰腺癌等消化道腫瘤、宮頸癌、其它腫瘤伴惡性胸腹腔積液等均有良好的治療效果.本研究通過對不同濃度H101對胃癌細胞的作用發(fā)現(xiàn),在MOI值大于5的時候能明顯抑制胃癌細胞的生長,并誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡,當MOI值大于10的時候抑制胃癌細胞增殖和遷移,促進細胞凋亡的效果達到最大化,表現(xiàn)出了強烈的抗胃癌腫瘤作用.在增殖實驗中發(fā)現(xiàn)相對于BGC-823細胞,SGC-7901細胞對H101的敏感性更差,因此選取敏感性較差的SGC-7901細胞作為研究重點.

Caspase-3作為caspase級聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者,在很大程度上依賴于cyt-c的釋放,而bcl-2和bax基因是目前已知的細胞凋亡中最重要的調(diào)節(jié)基因,可以通過線粒體途徑介導(dǎo)cyt-c等物質(zhì)的釋放.bcl-2和bax不僅可以作為Caspase-3的上游調(diào)控機制,參與對Caspase-3的調(diào)節(jié),還可以作為Caspase-3的直接底物作用于Caspase-3的下游.本研究通過不同MOI值的H101對胃癌細胞的作用發(fā)現(xiàn)與對照組和MOI=1組相比,MOI=5、MOI=5和MOI=10組的Bcl-2均更低,而Bax、Caspase-3表達量均更高.表明高濃度的H101可以調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達.

4 結(jié)論

綜上所述,H101能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移,提高細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達量,加速細胞的凋亡.

胃癌作為發(fā)病率較高的消化道腫瘤,以手術(shù)治療為主,但是在發(fā)病的中晚期癌細胞易發(fā)生腹膜的轉(zhuǎn)移,手術(shù)無法根除,死亡風險提升.

胃癌患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制和治療方案問題亟待解決.晚期患者手術(shù)無法根除,化療效果不理想,加重身體負擔,溶瘤病毒不僅可以靶向殺死癌細胞,還能激發(fā)免疫反應(yīng).

溶瘤病毒H101作為穩(wěn)定的上市產(chǎn)品在治療多種癌癥方面都取得一定的療效,本研究旨在探討H101對胃癌細胞的體外生存影響以及相關(guān)發(fā)生機制.

本研究主要通過體外細胞培養(yǎng),MTS檢測細胞活率,劃痕檢測細胞遷移,WB法檢測蛋白表達等方法進行,數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計學軟件SPSS 25.0.

處理48 h后,感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)值為15的時候,H101在體外可以明顯殺傷BGC-823和SGC-7901胃癌細胞,SGC-7901細胞對H101的敏感性更差;MOI=5組,MOI=10組和MOI=15組的遷移距離更低,凋亡小體數(shù)量更多,B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表達量較低,凋亡蛋白(BCL2-associated X,Bax)和半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3)表達量更高.

H101在抑制胃癌細胞的增殖、遷移的同時,還能通過調(diào)節(jié)Caspase相關(guān)的凋亡蛋白的表達,進而促進胃癌細胞的凋亡.

本研究主要從體外細胞層面探討研究H101對胃癌的抑制效果,但是治療是在體內(nèi)進行,因此為了進一步證實研究結(jié)論的正確性仍需開動物實驗、臨床試驗等數(shù)據(jù)的支持.