郭 曉，曹詩洋，譚亞芳，周亞洲，陳紅艷，任一帆，王 艷，楊瑞馥，杜宗敏

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis，簡稱鼠疫菌)感染引起的自然疫源性人獸共患病，主要宿主是嚙齒動物，可通過鼠蚤傳染給人(腺鼠疫)，并可通過氣溶膠途徑在人與人之間傳播(肺鼠疫)。鼠疫傳染性強(qiáng)、病死率高[1]，也是最具威脅的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖制劑之一[2]。疫苗接種是預(yù)防鼠疫最為經(jīng)濟(jì)有效的方法，但目前尚未有毒副作用小、保護(hù)效果好的疫苗問世。

目前鼠疫疫苗主要有滅活疫苗、重組亞單位疫苗、活載體疫苗、減毒活疫苗等。其中，鼠疫EV76減毒活疫苗在中國、蒙古和前蘇聯(lián)部分地區(qū)被用在高危人群中，它是基于色素沉著位點(diǎn)(pigmentation locus，pgm)缺失的減毒株，能夠誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[3-4]，對腺鼠疫和肺鼠疫能夠起到預(yù)防作用。但是鼠疫EV76減毒活疫苗可引起不同程度的副作用。此外，有其他pgm-減毒株感染造成實(shí)驗(yàn)人員死亡的個案報道[5]。因此，本研究致力于進(jìn)一步降低已有減毒株的殘存毒力，并使其具有良好的保護(hù)率。

一般而言，細(xì)菌基因組編碼的長度小于50個氨基酸的產(chǎn)物稱為小肽(small ORF encoded peptide，SEP)，由于在基因組注釋的過程中被漏掉而長期被忽視。近年研究發(fā)現(xiàn)，小肽在真核生物和原核生物中都發(fā)揮著重要的功能[6-7]。本研究組在研究鼠疫菌小肽組學(xué)的過程中，鑒定出一個新型小肽，編號為SEP34，其基因位于鼠疫菌91001染色體YP1841基因下游，即2 543 689～2 543 865 bp處，暫命名為sORF34，在敲除編碼基因后鼠疫菌毒力明顯下降[8]。

本研究針對sORF34基因，分別以田鼠型鼠疫菌201株和EV76疫苗株構(gòu)建了sORF34缺失株，并評價其經(jīng)皮下感染小鼠的毒力變化。采用皮下免疫方式評價sORF34缺失株誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答情況和對鼠疫不同感染途徑攻毒的短期保護(hù)效果，探討鼠疫EV76ΔsORF34株作為減毒活疫苗候選株的可行性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動物 鼠疫菌201株(本室保存)，鼠疫菌EV76疫苗株(本室保存)，質(zhì)粒pKD46、pKD4、pCP20(本室保存)，SPF級6～8周齡雌性BALB/c小鼠(北京維通力華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0006)。

1.1.2 試劑 氨芐西林(上海生工生物工程有限公司)、卡那霉素(MP，美國)、BHI培養(yǎng)基(BD公司，美國)、LB培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)室自制)、溶血赫氏瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)、DNA Maker 2000 plus(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)、QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen公司，德國)、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen公司，德國)、Taq DNA polymerase(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)、L-阿拉伯糖(上海生工生物工程有限公司)、天然F1(Fraction 1)蛋白(本室制備并保存)、LcrV(Low calcium response V)重組蛋白(本室制備并保存)、HRP-羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(Thermofisher公司，美國)、HRP-羊抗小鼠IgG1抗體(Thermofisher公司，美國)、HRP-羊抗小鼠IgG2a抗體(Thermofisher公司，美國)、HRP-羊抗小鼠IgG2b抗體(Thermofisher公司，美國)ELISA輔助試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司)，引物均合成自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 HZQ-F160全溫震蕩培養(yǎng)箱(太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、T100 PCR儀(Bio-Rad公司，美國)、UV-5100B分光光度計(上海元析儀器有限公司)、Gene Pluser Xcell 電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司，美國)、核酸電泳儀(北京六一儀器廠)、GelDoc Go自動成像儀(Bio-Rad公司，美國)、iMark酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 方 法

1.2.1 小肽基因缺失株的構(gòu)建 使用λ-Red一步突變法構(gòu)建小肽基因缺失株[9]。首先設(shè)計并合成同源區(qū)突變盒引物sORF34-P1/P2(表1)，以pKD4質(zhì)粒為模板，對卡那抗性基因進(jìn)行擴(kuò)增獲得突變盒(預(yù)變性94 ℃/5 min；變性94 ℃/40 s，退火54 ℃/40 s，延伸72 ℃/2 min 30 s，30個循環(huán)；再延伸72 ℃/5 min)，回收PCR產(chǎn)物。之后將pKD46質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)入鼠疫201株和鼠疫EV76疫苗株，L-阿拉伯糖誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，制備感受態(tài)細(xì)胞。將1.5 μg 卡那抗性突變盒擴(kuò)增產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，加入1 mL LB培養(yǎng)基復(fù)蘇2 h，集菌后全部涂布于雙抗LB平板(氨芐西林100 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL)培養(yǎng)2 d，挑取單菌落到雙抗板上劃線增菌，sORF34-F/R(表1)引物進(jìn)行PCR鑒定(預(yù)變性95 ℃/5 min；變性95 ℃/40 s，退火58 ℃/40 s，延伸72 ℃/2 min 30 s，30個循環(huán)；再延伸72 ℃/5 min)，并測序驗(yàn)證克隆正確。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，100 μL菌液稀釋1 000倍后，涂LB平板，挑取單菌落使用pKD46-JD-F/R(表1)引物進(jìn)行PCR鑒定(預(yù)變性95 ℃/5 min；變性95 ℃/40 s，退火56 ℃/40 s，延伸72 ℃/1 min，30個循環(huán)；再延伸72 ℃/5 min)，篩選pKD46質(zhì)粒消除克隆。獲得消除pKD46菌株后，再電轉(zhuǎn)入pCP20輔助質(zhì)粒，導(dǎo)入質(zhì)粒的單克隆于37 ℃培養(yǎng)1 d，100 μL菌液稀釋1 000倍后涂布LB平板，挑取單克隆，sORF34-F/R引物進(jìn)行PCR確定抗性基因消除，測序篩選正確克隆。獲得最終的sORF34基因敲除株，命名為201ΔsORF34、EV76ΔsORF34。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 鼠疫菌201株、鼠疫菌EV76疫苗株、基因缺失株201ΔsORF34和EV76ΔsORF34均轉(zhuǎn)接三代培養(yǎng)。甘油種接種于5 mL的LB培養(yǎng)基中，26 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。上述菌液1∶20接種于5 mL LB 培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD620≈1.0，而后1∶20接種于5 mL LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD620≈1.0)，獲得最終培養(yǎng)菌液。滴鼻攻毒前將最終培養(yǎng)菌液移至37 ℃孵育1 h。

1.2.3 鼠疫201ΔsORF34株皮下攻毒途徑感染小鼠LD50測定 使用無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)將鼠疫201ΔsORF34菌液調(diào)整為 OD620≈1.0理論濃度為2×107CFU/100 μL后，10倍稀釋至2×102～2×106CFU/100 μL。選取SPF級6到8周齡雌性BALB/c小鼠50只，隨機(jī)分成5組，每組10只，取100 μL各梯度菌液進(jìn)行皮下感染，滴板計數(shù)確定實(shí)際感染量。感染后每天觀察小鼠2次，記錄死亡情況，連續(xù)觀察14 d，計算不同感染劑量小組的小鼠死亡情況，使用Reed-Muench法[10]計算鼠疫201ΔsORF34皮下感染途徑半數(shù)致死量(LD50)。相同方法，調(diào)整鼠疫菌201株菌液濃度為1～1×105CFU/100 μL，每組小鼠5只進(jìn)行試驗(yàn)并計算出鼠疫201株皮下感染途徑LD50。

1.2.4 皮下感染途徑鼠疫EV76ΔsORF34株生存曲線觀察 6～8周齡雌性BALB/c小鼠20只，隨機(jī)分成兩組，每組10只。使用無菌PBS將鼠疫EV76疫苗株和EV76ΔsORF34株菌液配制成理論感染劑量2×108CFU/mL，取100 μL以皮下途徑(s.c.)感染小鼠，滴板計數(shù)確定實(shí)際感染量。每天觀察記錄2次小鼠發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察2周，繪制生存曲線。

1.2.5 動物免疫與攻毒 6到8周齡雌性BALB/c小鼠60只，隨機(jī)分組進(jìn)行腹股溝皮下注射免疫接種。鼠疫201ΔsORF34株(20只)、EV76ΔsORF34株(20只)、EV76株(10只)免疫劑量分別為2×103CFU/100 μL、2×105CFU/100 μL、2×105CFU/100 μL，對照組(10只)注射100 μL PBS溶液，21 d后上述菌株分別以2×103CFU/100 μL、2×105CFU/100 μL、2×105CFU/100 μL劑量加強(qiáng)免疫，對照組注射100 μL PBS溶液。首次免疫后42 d，存活小鼠使用鼠疫201株進(jìn)行皮下攻毒和滴鼻攻毒，攻毒理論劑量分別為1×103CFU/只(300 LD50)和1×105CFU/只(40 LD50)。攻毒后每天觀察記錄2次小鼠發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察2周，計算生存率。

1.2.6 ELISA檢測血清抗體水平 免疫小鼠于初免后40 d眼眶靜脈采血，分離血清備用。1 μg/mL純化F1抗原蛋白、2 μg/mL重組鼠疫低鈣響應(yīng)因子V(LcrV)抗原每孔100 μL加入ELISA板中，4 ℃過夜包被ELISA板，封閉液37 ℃封閉2 h，血清分別從1∶200到1∶409 600、1∶20到1∶2 560連續(xù)2倍稀釋，100 μL不同稀釋度血清加入檢測孔，37 ℃孵育30 min，PBST洗液洗板5次；檢測孔分別加入HRP-羊抗小鼠IgG抗體、HRP-羊抗小鼠IgG1抗體、HRP-羊抗小鼠IgG2a抗體、HRP-羊抗小鼠IgG2b抗體，37 ℃孵育20 min，PBST洗液洗板5次；檢測孔加入TMB 37 ℃避光孵育10 min；加入終止液，酶標(biāo)儀檢測450 nm處OD值。大于2.1倍陰性對照組OD值判為陽性。

1.2.7 統(tǒng)計分析 用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在皮下途徑感染小鼠生存曲線和保護(hù)效果評價實(shí)驗(yàn)中，組間比較采用Log-Rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)；在保護(hù)性抗體滴度比較實(shí)驗(yàn)中，采用方差分析(ANOVA)進(jìn)行多組間比較，使用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行事后兩兩比較；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 小肽基因sORF34缺失株的鑒定 利用1.2.1中用于鑒定sORF34基因的引物對sORF34-F/R對缺失株和野生株進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。敲除株和野生株理論P(yáng)CR產(chǎn)物大小分別為248 bp和316 bp。圖1和圖2為對所構(gòu)建的陽性敲除菌株的PCR鑒定結(jié)果，條帶大小、產(chǎn)物測序結(jié)果均符合預(yù)期，表明小肽基因缺失株201ΔsORF34、EV76ΔsORF34構(gòu)建成功。

圖1 201ΔsORF34基因缺失菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR verification of Y.pestis 201 strain sORF34 gene deletion mutant

圖2 EV76ΔsORF34基因缺失菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of PCR verification of Y.pestis EV76 strain sORF34 gene deletion mutant

2.2 皮下途徑感染201株與201ΔsORF34的LD50比較 鼠疫201株實(shí)際感染劑量分別為0.46～4 600 CFU/只，201ΔsORF34實(shí)際感染劑量分別為3.24×102～3.24×106CFU/只，通過皮下途徑感染BALB/c小鼠，201ΔsORF34株14 d觀察期結(jié)束后，根據(jù)不同感染劑量組小鼠死亡情況繪制出生存曲線(圖3)，并使用Reed-Muench法[10]求出兩株菌皮下途徑感染BALB/c小鼠的LD50。計算結(jié)果，201株的LD50為3.1 CFU，201ΔsORF34的LD50為 4.75×104CFU，約是其親本株1.5×104倍。由此可見sORF34基因缺失引起了鼠疫201株毒力的降低。

圖3 不同劑量鼠疫菌201株(A)與201ΔsORF34(B)皮下感染小鼠生存曲線Fig.3 Survival curves of mice s.c.challenged with Y. pestis 201(A) or 201ΔsORF34(B) at different doses

2.3 皮下途徑感染EV76和 EV76ΔsORF34后的生存曲線比較 將EV76疫苗株及EV76ΔsORF34株通過皮下途徑免疫接種BALB/c小鼠，滴板計數(shù)結(jié)果顯示EV76疫苗株實(shí)際感染劑量為2.5×107CFU/只，EV76ΔsORF34株實(shí)際感染劑量為3.1×107CFU/只。接種后觀察14 d，繪制生存曲線(圖4)。EV76感染組生存率為70%，EV76ΔsORF34 感染組生存率為100%。Log-Rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)，兩組生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035)，且實(shí)際攻毒劑量EV76ΔsORF34較EV76株更高，可見EV76ΔsORF34較其親本株毒力進(jìn)一步下降。

①:P<0.05圖4 EV76疫苗株與EV76ΔsORF34株皮下感染途徑小鼠生存曲線Fig.4 Survival curves of mice s.c.challenged with high doses of Y. pestis EV76 or EV76ΔsORF34

2.4 減毒株皮下免疫后對皮下、滴鼻攻毒的保護(hù)效果評價 鼠疫201ΔsORF34株、EV76ΔsORF34株、EV76株采取皮下途徑進(jìn)行兩劑免疫，間隔21 d，PBS溶液注射組為對照。在首劑免疫后42 d，201ΔsORF34株免疫組存活18只，EV76ΔsORF34株免疫組存活20只，EV76株免疫組存活10只，PBS組存活10只。存活小鼠隨機(jī)均分為兩組，用鼠疫201株皮下和滴鼻途徑對各免疫接種組和PBS組進(jìn)行攻毒，觀察14 d，繪制生存曲線(圖5)。皮下途徑攻毒中201ΔsORF34株免疫組、EV76 ΔsORF34株免疫組與EV76疫苗株免疫組動物均100%存活；滴鼻途徑攻毒中201ΔsORF34、EV76ΔsORF34免疫組與EV76疫苗株免疫組生存率分別為55.6%、40%、40%，能夠起到部分保護(hù)作用，Log-Rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)，3組保護(hù)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.699)。

A：300 LD50 Y.pestis 201皮下攻毒；B：40 LD50 Y.pestis 201滴鼻攻毒；①：P>0.05圖5 3種鼠疫菌減毒株免疫小鼠后行皮下、滴鼻途徑感染的生存曲線Fig.5 Survival curves of mice immunized with EV76,EV76ΔsORF34 or 201ΔsORF34 after exposure to Y. pestis 201 by subcutaneously or intranasal route

2.5 皮下免疫后小鼠血清保護(hù)性抗體滴度比較 鼠疫菌的莢膜抗原F1和毒力抗原LcrV是鼠疫菌的2種重要保護(hù)性抗原[11]，因此我們使用ELISA方法檢測了相應(yīng)的抗體滴度。小鼠初免后40 d，經(jīng)眼眶靜脈采血并分離血清。其中鼠疫201ΔsORF34株、EV76株、EV76ΔsORF34株免疫組可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較高滴度的抗F1-IgG(圖6A)。EV76免疫組和201ΔsORF34免疫組較 EV76ΔsORF34 免疫組抗F1-IgG滴度更高。EV76免疫組和201ΔsORF34免疫組未檢測出抗LcrV-IgG，EV76ΔsORF34免疫組可檢測出較低滴度的抗LcrV-lgG(圖6B)。對特異性F1抗體進(jìn)行IgG亞型檢測(圖7)，EV76、EV76ΔsORF34、201ΔsORF34免疫組IgG1抗體滴度均較IgG2a、IgG2b抗體滴度高(FEV76=45.96，P<0.001；FEV76ΔsORF34=20.47，P<0.001；F201ΔsORF34=7.399，P<0.01)，EV76 ΔsORF34免疫組中IgG2b抗體滴度較201ΔsORF34免疫組低(qIgG2b=3.875，P<0.05)，而IgG1、IgG2a抗體滴度與201ΔsORF34免疫組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(qIgG1=1.187，P>0.05；qIgG2a=0.297，P>0.05)。

A：抗F1-IgG抗體滴度；B：抗LcrV-IgG抗體滴度；①：P<0.05；②:P<0.01；③：P>0.05圖6 3種鼠疫菌減毒株免疫后小鼠血清抗F1、LcrV IgG抗體滴度Fig.6 F1-IgG and LcrV-IgG antibodies titer in mice immunized with Y.pestis EV76,EV76ΔsORF34 or 201ΔsORF34

①：P<0.05；②：P<0.01圖7 小鼠血清中特異性抗鼠疫菌F1抗體IgG 亞型Fig.7 IgG isotypes of antibodies specific to F1 antigen in mouse sera

3 討 論

鼠疫是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的甲類傳染病，自然疫源地面積廣泛，致病性強(qiáng)，病死率高。在經(jīng)濟(jì)開發(fā)和交通便利的背景下，遠(yuǎn)距離傳播鼠疫的風(fēng)險增加。同時，鼠疫的多重抗生素耐藥株已經(jīng)出現(xiàn)[12-13]，因此亟待研制更為安全有效的鼠疫疫苗。國內(nèi)外基于F1和(或)LcrV抗原的亞單位疫苗大多已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)[14-17]，展現(xiàn)出了良好的保護(hù)效果。但是F1抗原陰性鼠疫菌對人依然強(qiáng)毒，LcrV蛋白在自然界具有多態(tài)性，導(dǎo)致亞單位疫苗不能覆蓋所有致病菌。鼠疫減毒活疫苗由于攜帶多種抗原，理論上能夠覆蓋更多致病菌株，并且能激發(fā)機(jī)體細(xì)胞免疫，比亞單位疫苗具有明顯優(yōu)勢。本研究旨在現(xiàn)有鼠疫EV76疫苗株的基礎(chǔ)上，通過敲除sORF34基因，進(jìn)一步降低其殘存毒力，同時觀察其對鼠疫菌感染的保護(hù)作用。

首先評價小肽基因缺失株的安全性。本研究組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)鼠疫菌201株中sORF34基因在37 ℃培養(yǎng)下較26 ℃轉(zhuǎn)錄水平升高，敲除后鼠疫菌201株較野生株毒力下降明顯[8]。此次研究使用λ-Red一步法，將鼠疫菌201株和EV76疫苗株中sORF34基因敲除，構(gòu)建了鼠疫菌201ΔsORF34和EV76ΔsORF34。本研究測定了皮下感染途徑鼠疫菌201株和201ΔsORF34株的LD50，分別為3.1 CFU和4.75×104CFU，鼠疫201ΔsORF34株毒力較鼠疫201株下降1.5×104倍。雖然鼠疫菌201株對人不致病[18]，但有研究表明在非人靈長類動物中鼠疫201株殘存毒力高于EV76疫苗株[19]。鼠疫201ΔsORF34株在非人靈長類中的安全性，仍然需要進(jìn)一步研究。由于EV76疫苗株對小鼠皮下途徑LD50約為6.3×107CFU[20]，本研究選擇2×107CFU不同菌株皮下感染，觀察生存率，比較兩者毒力差別，EV76ΔsORF34株生存率為100%，而EV76疫苗株生存率為70%，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明敲除sORF34后EV76疫苗株殘存毒力進(jìn)一步下降。

有研究報道，鼠疫菌減毒活疫苗可誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[21-22]。我們對免疫后小鼠血清中主要保護(hù)性抗體(F1抗體和LcrV抗體)進(jìn)行了檢測。發(fā)現(xiàn)鼠疫201ΔsORF34株、EV76株、EV76ΔsORF34株免疫組可以產(chǎn)生較高滴度的抗F1-IgG，EV76疫苗株免疫組與201ΔsORF34株免疫組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均高于EV76ΔsORF34株免疫組(P<0.05)；而鼠疫201ΔsORF34株免疫劑量較EV76疫苗株和EV76ΔsORF34株低，提示鼠疫201ΔsORF34株可能具有更好的免疫原性。EV76免疫組不能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗LcrV-IgG，這與已有文獻(xiàn)報道結(jié)論一致[23-25]，而EV76ΔsORF34免疫組可產(chǎn)生較低滴度的抗LcrV-IgG。之后本研究組對IgG抗體不同亞型滴度進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)不同免疫組中特異性IgG1抗體的滴度均高于IgG2a和IgG2b。IgG1抗體的產(chǎn)生與Th2細(xì)胞相關(guān)，而IgG2a、IgG2b抗體的產(chǎn)生與Th1細(xì)胞相關(guān)。這種差異提示機(jī)體在針對鼠疫減毒活疫苗免疫應(yīng)答中Th2占主導(dǎo)。

綜上所述，本研究揭示鼠疫EV76ΔsORF34株比EV76疫苗株毒力更弱，且短期免疫保護(hù)效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。為鼠疫EV76ΔsORF34株作為候選的鼠疫減毒活疫苗提供了依據(jù)。同時201ΔsORF34株相較于201株毒力下降，相較于EV76株有更好的免疫原性，但其安全性需要進(jìn)一步研究。

利益沖突：無

引用本文格式：郭曉，曹詩洋，譚亞芳，等.鼠疫耶爾森菌小肽基因sORF34缺失株毒力及短期免疫保護(hù)效果評價[J]．中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(9)：757-763.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.109