邴伯東，孟慶春，李川

(1.承德市婦幼保健院婦科，承德 067000；2.灤平縣中醫(yī)院心內(nèi)科，承德 068250；3.灤平縣中醫(yī)院婦產(chǎn)科，承德 068250)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是子宮內(nèi)膜組織在子宮內(nèi)膜之外的部位出現(xiàn)生長浸潤、多次重復出血形成包塊引起疼痛的婦科疾病。EMs患者的子宮內(nèi)膜組織包括在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜，在位內(nèi)膜是患者子宮內(nèi)的內(nèi)膜，異位內(nèi)膜是已經(jīng)轉(zhuǎn)移到宮腔以外的內(nèi)膜。在位內(nèi)膜的細胞凋亡、增殖等異常，可導致異位病灶的形成；雌激素分泌增多、炎癥、免疫、遺傳等多種因素均能導致該疾病的發(fā)生，臨床癥狀主要表現(xiàn)為小腹疼痛、痛經(jīng)、不孕等，在育齡期女性較為常見，甚至部分患者會逐漸演變成卵巢癌，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全[1]。因此，研究與EMs有關(guān)的標志物，對EMs的早期防治具有重要意義[2-3]。

叉頭框D1(FOXD1)作為叉頭框(FOX)家族成員之一，其在真核細胞中廣泛表達，具有多種生物學功能，比如調(diào)節(jié)細胞周期、胚胎發(fā)育等[4-5]。Zhang等[6]研究結(jié)果表明，宮頸癌患者FOXD1呈高表達，具有促進癌癥發(fā)生的作用，然而關(guān)于FOXD1在EMs中發(fā)揮的作用尚不清楚。微小RNA(miRNA)是一種高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度約為21～25 nt，可調(diào)控多種基因的表達，目前，已知有高達2 000個miRNA在機體各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用。報道稱，miRNA在EMs患者的子宮內(nèi)膜組織的修復、血管形成、炎癥反應和細胞外間質(zhì)形成等生理病理過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7-9]。研究表明，miR-216b-5p作為miRNA的一員，其異常表達與卵巢癌[10]、宮頸癌[11]等疾病的發(fā)生有關(guān)，但關(guān)于miR-216b-5p在EMs中發(fā)揮的作用未見報道。因此，本研究通過檢測EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1、miR-216b-5p表達水平變化，探討二者的臨床意義。

資料與方法

一、研究對象

納入標準：經(jīng)病理確診為EMs；無免疫性疾??；無急性炎癥；無雌激素依賴性疾?。唤谖唇邮苓^內(nèi)分泌治療；患者知情同意。

排除標準：使用激素類藥物治療；合并卵巢癌等惡性腫瘤；合并甲狀腺疾??；合并糖尿病、多囊卵巢綜合征等；臨床資料不全。

另選取在我院因子宮肌瘤進行手術(shù)的患者作為對照組(185例)。納入標準：經(jīng)病理確診為子宮肌瘤；患者知情同意；無免疫性疾??；排除標準與研究組一致。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

二、主要試劑和儀器

兔抗人FOXD1單克隆抗體(ab129324，Abcam，美國)；DAB染色試劑盒(CD-103172GM，武漢純度生物)；山羊抗兔IgG二抗(ZF-0511，北京中杉金橋)；miR-216b-5p、U6、FOXD1、GAPDH引物序列由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

輪轉(zhuǎn)式切片機(RM2235，Leica，美國)；生物顯微鏡(SPCC-200，Nikon，日本)；PCR基因擴增儀(Applied Biosystems，美國)。

三、研究方法

1.樣本采集：取腹腔鏡手術(shù)后經(jīng)病理學證實為EMs患者的異位子宮內(nèi)膜組織(內(nèi)異囊腫壁)和在位子宮內(nèi)膜組織(研究組)，取因子宮肌瘤進行手術(shù)患者的子宮內(nèi)膜組織(對照組)；將內(nèi)膜組織置于-80℃冰箱中保存待測。

在妊娠前半期，支持胎兒腦神經(jīng)發(fā)育的甲狀腺激素主要來自母體。妊娠期患有甲狀腺疾病的患者也要攝取足夠的碘，食用加碘食鹽是最好的方法。患有自身免疫甲狀腺炎和甲狀腺功能減退的妊娠婦女，還要定期監(jiān)測甲狀腺功能。

2.免疫組化法檢測組織中FOXD1蛋白的表達：取組織標本進行多聚甲醛固定，然后石蠟包埋，使用輪轉(zhuǎn)式切片機制作4 μm石蠟切片，將其編碼并烘干，使用二甲苯、檸檬酸緩沖液進行脫蠟、修復抗原等一系列操作后，加入1∶500稀釋的兔抗人FOXD1一抗，4℃過夜，陰性對照組使用稀釋液代替；使用PBS進行3次清洗，加入山羊抗兔lgG二抗25℃孵育1 h，DAB染色，蘇木素復染；使用生物顯微鏡高倍視野(×400)觀察切片。

結(jié)果判定[12]：以染色強度和陽性細胞百分比評分乘積評估FOXD1蛋白表達：≤3分為表達陰性，>3分為表達陽性(表1)。

表1 結(jié)果判定標準

3.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測組織FOXD1 mRNA、miR-216b-5p的相對表達量：取子宮內(nèi)膜組織研磨，加入1 ml Trizol試劑(Invitrogen，美國)完全裂解提取總RNA，測定RNA純度和濃度，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR對FOXD1 mRNA、miR-216b-5p進行擴增。FOXD1 mRNA的qRT-PCR反應條件為96℃ 5 min；60℃ 3 min；55℃ 60 s。miR-216b-5p的qRT-PCR反應條件為94℃ 8 min；95℃ 30 s；55℃ 60 s。FOXD1、miR-216b-5p、GAPDH、U6的上下游引物序列見表2。采用2-ΔΔCT法分析FOXD1 mRNA、miR-216b-5p的表達水平。

表2 qRT-PCR引物序列

四、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、兩組患者一般資料比較

本研究共納入188例EMs患者為研究組，根據(jù)修正的美國生育協(xié)會(r-AFS)分期標準[13]Ⅰ～Ⅱ期95例、Ⅲ～Ⅳ期93例，年齡20～45歲。另納入185例同期因子宮肌瘤進行手術(shù)的非EMs患者作為對照組，年齡21～45歲。

兩組間年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、孕產(chǎn)史、不孕、痛經(jīng)等比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者一般資料比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者子宮內(nèi)膜組織中FOXD1蛋白表達陽性率比較

研究組分別取材在位子宮內(nèi)膜組織(在位組)和異位子宮內(nèi)膜組織(異位組)。研究組在位和異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1蛋白表達陽性率均顯著高于對照組(P<0.05)；研究組異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1蛋白表達陽性率顯著高于在位子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)(表4、圖1)。

三、兩組患者子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA、miR-216b-5p表達水平比較

研究組在位和異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)，miR-216b-5p表達水平均顯著低于對照組(P<0.05)；研究組異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA表達水平顯著高于在位子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)，miR-216b-5p表達水平顯著低于在位子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)(表5、圖2)。

表4 兩組患者子宮內(nèi)膜組織中FOXD1蛋白表達陽性率比較

圖1 FOXD1蛋白在各組子宮內(nèi)膜組織中的表達(免疫組織化學 ×100)

表5 兩組患者子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA、miR-216b-5p相對表達水平比較

圖2 FOXD1 mRNA、miR-216b-5p相對表達量的電泳圖

四、EMs組織FOXD1 mRNA、miR-216b-5p的相關(guān)性分析

生物信息學TargetScan網(wǎng)站顯示，F(xiàn)OXD1和miR-216b-5p存在結(jié)合位點(圖3)。

圖3 FOXD1與miR-216b-5p結(jié)合位點圖

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中，miR-216b-5p表達水平與FOXD1 mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.369，P<0.05)(圖4)。

圖4 FOXD1 mRNA、miR-216b-5p相關(guān)性分析圖

五、FOXD1 mRNA和miR-216b-5p水平對EMs的診斷價值

ROC曲線結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD1 mRNA診斷EMs發(fā)生的ROC曲線下面積(AUC)為0.730(0.677～0.784)，敏感度為80.5%，特異性為68.6%，截斷值為2.000；miR-216b-5p診斷EMs發(fā)生的AUC為0.828(0.783～0.872)，敏感度為82.7%，特異性為85.1%，截斷值為0.409；二者聯(lián)合診斷EMs發(fā)生的AUC為0.847(0.805～0.889)，敏感度為88.1%，特異性為68.1%。與FOXD1 mRNA單獨檢測相比，二者聯(lián)合診斷EMs發(fā)生的AUC更高(Z=3.359，P=0.001)；與miR-216b-5p單獨檢測相比，二者聯(lián)合診斷EMs發(fā)生的AUC無顯著差異(Z=0.597，P=0.551)(圖5)。

圖5 相關(guān)指標診斷EMs的ROC曲線

六、多因素Logistic回歸分析影響EMs的危險因素

將是否發(fā)生EMs作為因變量，以FOXD1 mRNA、miR-216b-5p水平作為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示FOXD1 mRNA高水平、miR-216b-5p低水平是影響EMs發(fā)生的危險因素(P<0.05)(表6)。

表6 多因素Logistic回歸分析影響EMs發(fā)生的危險因素

討 論

EMs是臨床上較為常見的良性增殖婦科疾病，其病理機制是子宮內(nèi)膜細胞凋亡能力減弱，異位子宮內(nèi)膜細胞增殖能力增強。EMs雖然是一種良性疾病，但因其具有復發(fā)、侵襲等特征，可引起惡變?nèi)缪葑兂陕殉舶┑取Ms具有較高的發(fā)病率，目前我國約有10%～15%的育齡女性患EMs，且近年來EMs發(fā)病率逐年呈上升的趨勢，是導致婦女不孕的最主要因素之一，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康[14-15]。因此，研究與EMs有關(guān)的標志物，對EMs的早期防治具有重要意義。

FOXD1是FOX家族的一員，研究表明，F(xiàn)OXD1異常表達與卵巢癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[16]。謝力等[17]研究表明，結(jié)腸癌患者癌組織中FOXD1呈高表達，具有促進癌癥發(fā)生的作用，F(xiàn)OXD1的表達水平與細胞分化、侵襲、細胞凋亡等密切相關(guān)。但關(guān)于FOXD1在EMs中發(fā)揮的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，EMs患者在位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA表達水平、FOXD1蛋白表達陽性率顯著高于對照組正常子宮內(nèi)膜組織；EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA表達水平、FOXD1蛋白表達陽性率顯著高于在位子宮內(nèi)膜組織。這些結(jié)果提示FOXD1異常高表達與EMs的發(fā)生有關(guān)。ROC曲線結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD1 mRNA診斷EMs發(fā)生的AUC為0.730，敏感度為80.5%、特異性為68.6%，提示FOXD1 mRNA對EMs具有良好的診斷價值；多因素Logistic回歸分析顯示，F(xiàn)OXD1 mRNA高水平是影響子宮內(nèi)膜異位的危險因素，提示FOXD1 mRNA可作為EMs診斷的生物標志物。

有研究表明，子宮內(nèi)膜中大多數(shù)的基因產(chǎn)物，比如血管生成因子、黏附分子、雌激素的分泌等，受多種miRNAs的調(diào)控，miRNAs在EMs的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮極其重要的作用[18-19]。馮婉琴等[20]研究顯示，EMs患者子宮內(nèi)膜組織中miR-34a-5p表達下調(diào)，參與EMs的發(fā)生發(fā)展過程，而將miR-34a-5p模擬物轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞(ESC)后，ESC細胞增殖、遷移、侵襲能力減弱。He等[21]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者癌組織和細胞中miR-216b呈低表達，F(xiàn)OXM1呈高表達，且患者預后不良，miR-216b通過靶向調(diào)控FOXM1表達抑制癌細胞增殖，其在宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，且可反映患者的預后情況。Pei等[10]研究結(jié)果表明，卵巢癌患者miR-216b-5p表達下調(diào)，且miR-216b-5p低水平的卵巢癌患者總生存期較短，提示miR-216b-5p異常低表達與卵巢癌的發(fā)生及預后不良密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，EMs患者在位子宮內(nèi)膜組織中miR-216b-5p表達水平顯著低于對照組正常子宮內(nèi)膜組織，且EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中miR-216b-5p表達水平顯著低于患者在位子宮內(nèi)膜組織，提示miR-216b-5p異常低表達與子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生有關(guān)；ROC曲線分析結(jié)果表明，miR-216b-5p診斷EMs的AUC為0.828，敏感度為82.7%、特異性為85.1%，提示miR-216b-5p對EMs具有良好的診斷價值；而與FOXD1 mRNA單獨檢測相比，二者聯(lián)合檢測EMs的AUC更高，二者聯(lián)合檢測可提高對EMs診斷的靈敏度；多因素Logistic回歸分析顯示，miR-216b-5p低水平是影響EMs發(fā)生的危險因素，提示miR-216b-5p可作為EMs診斷的生物標志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，EMs患者子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA、miR-216b-5p表達呈負相關(guān)，推測miR-216b-5p可能通過靶向調(diào)控FOXD1的表達參與EMs的發(fā)生，但具體調(diào)控機制還需后續(xù)研究。

綜上所述，F(xiàn)OXD1 mRNA及蛋白、miR-216b-5p在EMs子宮內(nèi)膜組織中表達異常，可作為EMs診斷的輔助指標。