張珊，陳歡歡，張磊，崔趁趁，張翠蓮*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省人民醫(yī)院，鄭州 450003；2.河南省人民醫(yī)院生殖中心，鄭州 450003；3.河南省生殖醫(yī)學(xué)工程國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450003)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女中較常見的生殖內(nèi)分泌疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)PCOS的患病率約為5%～10%[1]。PCOS常見特征是雄激素過多、月經(jīng)紊亂、排卵功能障礙、卵巢多囊樣改變，它是一種具有復(fù)雜病理特征的異質(zhì)性綜合征疾病，不僅與不孕癥有關(guān)，還與代謝紊亂密不可分，可伴有胰島素抵抗(IR)、糖尿病、肥胖和心血管疾病等[2]，同時(shí)也是子宮內(nèi)膜癌致病的高危因素[3]。目前已知遺傳、環(huán)境、生活方式和心理(慢性焦慮和抑郁)等因素參與PCOS的發(fā)生發(fā)展，但其內(nèi)在的分子機(jī)制尚不清楚[4]。

microRNAs(miRNAs)是一種小的單鏈非編碼RNA，大小在19～25個(gè)核苷酸之間，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄沉默；一個(gè)miRNA可以靶向數(shù)百個(gè)mRNAs，可同時(shí)影響某些特定途徑上關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)[5]。研究表明，miRNAs序列具有高度保守性，有助于調(diào)節(jié)不同生物體的多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞凋亡、增殖、分化、發(fā)育、細(xì)胞周期、干細(xì)胞維持、代謝和造血等[6]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，其異常表達(dá)與多種疾病有關(guān)，如癌癥[7]、自身免疫性疾病[8]、不孕癥[9-10]等。miRNAs在幾乎所有細(xì)胞中都發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。研究發(fā)現(xiàn)，在人前脂肪細(xì)胞和分化的脂肪細(xì)胞中都存在不同的miRNA，特定的miRNA參與脂肪細(xì)胞的分化、脂肪代謝和胰島素敏感性[11]。miRNAs在生物合成過程中，可以釋放到細(xì)胞間隙，所以在血液、尿液、精液、卵泡液[12-15]等多種體液中可被檢測。miRNAs不僅在各種體液中表現(xiàn)出顯著的穩(wěn)定性，還可以反映卵母細(xì)胞和卵泡壁的分泌及代謝活動[16]。大量研究表明，miRNAs與PCOS的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。本文將對PCOS相關(guān)差異表達(dá)miRNAs的研究進(jìn)展作一綜述。

一、miRNAs在PCOS患者血清中的異常表達(dá)

miRNAs在各種組織中的異常表達(dá)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，其中血清中miRNAs的表達(dá)水平在同一物種中是相對穩(wěn)定的[17]。Long等[6]通過對血清樣本進(jìn)行測序，篩選出不同組分間差異表達(dá)的miRNAs，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR(qRT-PCR)方法檢測出PCOS患者血清中miR-222、miR-146a和miR-30c的表達(dá)量顯著增多；通過相關(guān)性分析顯示miR-222與血清胰島素水平呈正相關(guān)，miR-146a與血清睪酮值呈負(fù)相關(guān)；使用DIANA-mirPath計(jì)算工具識別出上述miRNAs靶基因參與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期、凋亡和內(nèi)分泌通路，如Wnt信號通路、MAPK信號通路、Jak-STAT信號通路等。Nanda等[18]采用qRT-PCR方法檢測了血清中miR-24、miR-29a和miR-502-3p的表達(dá)情況，與對照組相比，PCOS受試者血清中miR-24水平顯著下調(diào)，miR-24與體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血糖、黃體生成素(LH)、胰島素、空腹胰島素抵抗指數(shù)(FIRI)、穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、睪酮、甘油三酯(TG)水平及黃體生成素/卵泡刺激素(LH/FSH)比值呈顯著負(fù)相關(guān)，而高密度脂蛋白(HDL)水平與miR-24呈顯著正相關(guān)，miR-24在PCOS的診斷方面具有重要意義。Lin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a在PCOS患者血清中異常低表達(dá)，于cov434細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-23a模擬物及抑制物后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)miR-23a過表達(dá)可誘導(dǎo)cov434細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這一過程是miR-23a靶向調(diào)節(jié)FGD4參與完成的；研究還表明，miR-23a誘導(dǎo)cov434細(xì)胞CDC42/PAK-1信號通路的激活，此通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期，可能在PCOS患者的生理病理過程中具有重要意義。有研究報(bào)道了miR-320在PCOS患者血清中低表達(dá)，這一表現(xiàn)在PCOS合并IR的患者中更明顯，Logistic回歸分析顯示miRNA -320表達(dá)水平與PCOS獨(dú)立相關(guān)[20]。

二、miRNAs在PCOS患者血漿中的異常表達(dá)

血漿因其成分的特殊性，作為體外樣本時(shí)常需要添加抗凝劑，因此限制了其在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，但與血清相比，血漿更能代表患者的體內(nèi)狀態(tài)[21]。Pourteymour Fard Tabrizi等[22]通過生物信息學(xué)分析得出miR-27a、miR-130b和miR-301a與PCOS存在相關(guān)性，經(jīng)qRT-PCR方法驗(yàn)證了PCOS組及對照組患者血漿樣本中3種miRNAs的差異表達(dá)，并檢驗(yàn)其對PCOS發(fā)病的敏感性及特異性，指出miR-27a對PCOS的診斷更有價(jià)值。近期一項(xiàng)基于全基因組測序結(jié)果的研究，分析了PCOS和對照組患者的RAB5B基因的8個(gè)位點(diǎn)后，發(fā)現(xiàn)rs1045435、rs11550558、rs705700和rs11171718位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與PCOS風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；經(jīng)qRT-PCR方法檢測了兩組人群血漿中miR-24及miR-320的表達(dá)，其中miR-24在PCOS患者血漿中高表達(dá)，而miR-320呈現(xiàn)為低表達(dá)，并指出rs1045435可能是miR-24的結(jié)合位點(diǎn)，rs11550558、rs705700、rs11171718可能為miR-320的結(jié)合位點(diǎn)[23]。

三、miRNA在PCOS患者卵泡液中的異常表達(dá)

卵泡液為卵母細(xì)胞成長發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)及微環(huán)境，在生殖功能中發(fā)揮著重要作用[24-25]。在一項(xiàng)病例對照研究中經(jīng)高通量測序分析了PCOS組與對照組卵泡液中miRNAs的表達(dá)譜，其中miR-29a-3p、miR-151-3p及miR-518f-3p在PCOS組中低表達(dá)，miR-29a-3p通過抑制磷酸酯酶和張力蛋白同源物(PTEN)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育，與PCOS患者卵泡生長和卵泡發(fā)育受阻相一致；miR-151-3p與總雄激素和游離雄激素水平顯著負(fù)相關(guān)，并參與多種癌癥的發(fā)病；研究中有miRNAs表達(dá)不一致的情況，推測由PCOS的異質(zhì)性、使用不同PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)或種族差異等因素引起[26]。近期Butler等[27]在一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究中，從卵泡液中檢測到176個(gè)miRNAs，其中29個(gè)miRNAs在PCOS患者和正常對照組中存在顯著差異；PCOS患者卵泡液中miR-382-5p與年齡和游離雄激素水平相關(guān)，miR-199b-5p與抗苗勒管激素(AMH)水平相關(guān)，miR-93-3p與C反應(yīng)蛋白相關(guān)。

四、miRNA在 PCOS患者壁層顆粒細(xì)胞中的異常表達(dá)

卵母細(xì)胞和其周圍的顆粒細(xì)胞(GCs)是相互依存的，PCOS患者GCs存在增殖減少、凋亡增加、激素分泌紊亂等病理現(xiàn)象，與卵泡發(fā)育異常密切相關(guān)[28-29]。Fu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者卵巢皮質(zhì)和血清中miR-16表達(dá)下調(diào)，miR-16過表達(dá)后通過靶向程序性細(xì)胞死亡蛋白4(PDCD4)以促進(jìn)GCs細(xì)胞生長和抑制細(xì)胞凋亡；睪酮使miR-16表達(dá)下調(diào)和PDCD4表達(dá)上調(diào)，可抑制GCs生長和促進(jìn)凋亡。Sun等[31]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者GCs中miR-204表達(dá)下調(diào)，通過miR-204模擬物或抑制物轉(zhuǎn)染KGN細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)miR-204的過表達(dá)和表達(dá)的敲降，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析KGN細(xì)胞的細(xì)胞周期情況，證實(shí)了miR-204對KGN細(xì)胞G2/M期阻滯和誘導(dǎo)凋亡的重要作用；并且miR-204與翻譯控制的腫瘤蛋白(TPT1)直接作用，通過直接靶向和降解KGN細(xì)胞中的TPT1來抑制細(xì)胞增殖。He等[32]通過qRT-PCR方法檢測出PCOS患者GCs中miR-200b表達(dá)上調(diào)；向KGN細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-200b和miR-200c模擬物以實(shí)現(xiàn)過表達(dá)，CCK-8結(jié)果顯示兩者表達(dá)上調(diào)均可抑制KGN細(xì)胞增殖；qRT-PCR和蛋白免疫印記檢測證實(shí)PTEN是KGN細(xì)胞中miR-200b和miR-200c的直接靶點(diǎn)；si-PTEN在轉(zhuǎn)染48 h后顯著降低了KGN細(xì)胞中PTEN mRNA及蛋白的水平，CCK-8結(jié)果顯示PTEN下調(diào)顯著抑制KGN細(xì)胞的增殖，這為PCOS患者GCs異常增殖提供相關(guān)分子證據(jù)。

五、miRNA在 PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中的異常表達(dá)

Shi等[33]取PCOS及對照組患者成熟卵母細(xì)胞后機(jī)械剝離收集卵丘顆粒細(xì)胞(CCs)樣本，通過miRNA微陣列測序技術(shù)檢測miRNAs的差異表達(dá)，篩選出有顯著差異的miR-483-5p和miR-486-5p，qRT-PCR方法驗(yàn)證了其在PCOS患者CCs中的低表達(dá)，與miRNA芯片檢測結(jié)果一致；使用生物信息學(xué)分析預(yù)測靶基因，并行qRT-PCR方法檢測，結(jié)果顯示與對照組相比，SOCS3、SRF、PTEN、FOXO1在PCOS患者CCs中表達(dá)上調(diào)；miR-483-5p作為編碼在IGF2的第二個(gè)內(nèi)含子中的保守序列，故IGF2在PCOS患者CCs中同樣表達(dá)下調(diào)；利用DAVID工具對相關(guān)靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，最終miR-483被認(rèn)定在改善IR中起重要作用，miR-486-5p可能通過激活PI3K/Akt信號通路促進(jìn)CCs的增殖。張慧敏等[34]利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了miR-1270的靶基因，再通過KEGG富集信號通路選定卵巢類固醇激素生成途徑上的限速酶細(xì)胞色素P450 19A1(CYP19A1)為目標(biāo)靶基因；收集了PCOS與非PCOS不孕患者的CCs，qRT-PCR方法檢測了兩者在組間的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-1270在PCOS患者CCs中表達(dá)量降低，CYP19A1的表達(dá)量升高；向KGN細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-1270的模擬物及抑制劑后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了兩者的靶向關(guān)系，在KGN細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測到雌二醇(E2)的水平差異。miR-1270對CYP19A1的負(fù)性調(diào)控影響PCOS患者CCs中E2的生成。

六、miRNA在PCOS患者(血清/血漿/卵泡液)外泌體中的異常表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，攜帶大量生物活性物質(zhì)(包括調(diào)節(jié)性RNA)的外泌體可被鄰近細(xì)胞吸收或進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，并到達(dá)遙遠(yuǎn)的部位影響受體細(xì)胞的生物行為。外泌體傳遞到受體細(xì)胞的mRNA可以被翻譯成蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是細(xì)胞-細(xì)胞通訊的重要介質(zhì)[35-36]。王潔等[37]提取了PCOS與非PCOS患者血清中外泌體，經(jīng)高通量測序技術(shù)檢測到差異表達(dá)miRNAs共有 243 個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)有115個(gè)、下調(diào)128個(gè)，對10個(gè)差異顯著miRNAs進(jìn)行了qRT-PCR檢測，其中miR-378d、miR-378b、miR-4772-3p在PCOS患者血清外泌體中表達(dá)上調(diào)，miR-5090、miR-3680-3p、miR-6836-5p表達(dá)下調(diào)；將PCOS患者血清外泌體差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行GO富集分析及KEGG功能注釋，結(jié)果顯示這些差異表達(dá)miRNAs與類固醇激素的合成有關(guān)，可參與調(diào)節(jié)胰島素信號受體通路。Jiang等[38]收集了PCOS與對照組患者血漿進(jìn)行了外泌體miRNA測序分析，根據(jù)測序結(jié)果選取差異顯著的miRNAs，通過GO分析和KEGG通路富集顯示差異表達(dá)的miRNAs主要富集在軸突導(dǎo)向、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導(dǎo)、胞吞作用、晝夜節(jié)律和癌癥等途徑；其中miR-20b-5p、miR-106a-5p及 miR-18a-3p表達(dá)上調(diào)，miR-126-3p和miR-146a-5p表達(dá)下調(diào)，將這5種miRNAs與PCOS表型進(jìn)行相關(guān)性分析，顯示miR-20b-5p、miR-106a-5p和miR-18a-3p的表達(dá)與血漿睪酮水平呈負(fù)相關(guān)，miR-18a-3p與竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)、AMH濃度、LH水平和LH/FSH比值也呈負(fù)相關(guān)，而miR-146a-5p和miR-126-3p的表達(dá)與AFC和AMH濃度呈正相關(guān)。這些差異表達(dá)的血漿外泌體miRNAs有助于PCOS的診斷及致病風(fēng)險(xiǎn)性預(yù)測。Yuan等[39]使用差速離心法提取了 PCOS與對照組患者卵泡液外泌體，通過測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)25個(gè)miRNAs存在組間差異，miRNA譜的改變與IR、細(xì)胞生長和增殖、細(xì)胞衰老和胰島素信號通路等相關(guān)聯(lián)；篩選出miR-424-5p作為研究靶標(biāo)，通過qRT-PCR檢測方法發(fā)現(xiàn)miR-424-5p均在PCOS患者卵泡液外泌體和原代GCs中低表達(dá)，miR-424-5p可促進(jìn)GCs衰老并抑制細(xì)胞增殖，在轉(zhuǎn)染miR-424-5p模擬物的KGN細(xì)胞中觀察到同樣的結(jié)果；對miR-424-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，確定為細(xì)胞分裂周期相關(guān)4(CDCA4)基因，雙熒光素酶報(bào)告檢測結(jié)果表明外泌體miR-424-5p通過阻斷CDCA4介導(dǎo)的Rb/E2F1信號，抑制GCs增殖并誘導(dǎo)PCOS細(xì)胞衰老。Cui等[40]為了研究PCOS和非PCOS患者的卵泡液、血清中外泌體miRNAs表達(dá)譜，通過miRNA探針微陣列技術(shù)及測序結(jié)果選取異常表達(dá)的miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)miRNAs(miR-15b-5p、miR-34a-5p、miR-3148、miR-3646、 miR-3976、 miR-4271、 miR-4481)在PCOS患者卵泡液中顯著高表達(dá)，對這些miRNAs的靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集，顯示它們參與MAPK信號通路和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。Zhang等[41]通過測序及序列技術(shù)顯示PCOS患者血清外泌體中差異表達(dá)miRNAs有54個(gè)，使用qRT-PCR方法測量這些miRNAs的表達(dá)情況，其中miR-1299和miR-6818-5p表達(dá)顯著上調(diào)，miR-1925p和miR-145-5p表達(dá)顯著下調(diào)；通過GO分析和KEGG通路富集探究這些差異miRNAs靶基因的分子生物學(xué)功能及基因通路，發(fā)現(xiàn)它們主要參與軸突導(dǎo)向、腫瘤通路和MAPK信號通路等，認(rèn)為外泌體miRNAs有望成為PCOS臨床診斷的新型分子生物標(biāo)志物。

以上為多種miRNAs在PCOS患者不同體液、組織中的差異表達(dá)情況(相關(guān)細(xì)節(jié)總結(jié)于表1)，這些研究表明，miRNAs在調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、激素合成、卵泡發(fā)育障礙及卵母細(xì)胞功能等方面起著關(guān)鍵性作用。一些miRNAs被證實(shí)與PCOS表型相關(guān)，對其功能的研究為PCOS的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)，可作為新型非侵入性生物標(biāo)志物。

表1 PCOS患者體液/組織中差異表達(dá)miRNAs匯總

續(xù)表

續(xù)表

七、小結(jié)與展望

綜上所述，miRNAs在血液、卵巢及外泌體中的差異表達(dá)對PCOS疾病的診斷、治療及預(yù)后等存在特殊的意義。miRNAs可通過調(diào)控靶基因在特定的通路中傳遞特殊信息來影響PCOS的發(fā)生發(fā)展，可為PCOS患者卵泡發(fā)育異常和生育力低下等的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，有望成為生殖領(lǐng)域診斷性標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。未來期望可以通過對某些特定miRNA的檢測來達(dá)到明確PCOS發(fā)病機(jī)制、治療及改善預(yù)后等目標(biāo)，這一過程需要更多更深入的研究來實(shí)現(xiàn)。

所有作者均聲明不存在利益沖突。