楊利利 胡強(qiáng)夫 閔娜 王濤

1鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院麻醉科（鄭州 450052）；2鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科（鄭州 450000）

宮頸癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤，雖然近年來(lái)其發(fā)病率、死亡率有所降低，但晚期患者5年生存率不足40%，仍是導(dǎo)致女性死亡的重要原因［1-2］。宮頸癌治療主要以手術(shù)輔助放化療為主，但對(duì)化療藥物的耐藥性往往影響化療療效，難以達(dá)到預(yù)期的臨床效果，導(dǎo)致預(yù)后結(jié)局差［3］。因此，尋找一種安全有效的途徑增強(qiáng)化療敏感性，對(duì)改善宮頸癌預(yù)后具有重要研究、應(yīng)用價(jià)值。熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）可維護(hù)正常組織蛋白穩(wěn)定性，作為ATP 依賴性分子伴侶能參與腫瘤細(xì)胞生存、代謝過(guò)程，抑制其表達(dá)可逆轉(zhuǎn)腫瘤的順鉑耐藥性［4］。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）活化后可調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞的異常增殖分化過(guò)程，在腫瘤進(jìn)展、治療機(jī)制中均具有重要作用［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，觸發(fā)HSP90-ERK 途徑介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌DNA 修復(fù)可增強(qiáng)順鉑化學(xué)耐藥性［6］。右美托咪定是一類脂溶性的α2 腎上腺素激動(dòng)劑，常用于臨床輔助手術(shù)麻醉，近年來(lái)在腫瘤根治術(shù)中廣泛應(yīng)用。此外，右美托咪定能抑制宮頸癌細(xì)胞的存活與轉(zhuǎn)移［7］，減輕化療相關(guān)性惡心嘔吐［8］，且研究報(bào)道其能提高肺癌細(xì)胞A549 對(duì)化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性［9］。為明確右美托咪定應(yīng)用于宮頸癌的根治術(shù)、放化療等過(guò)程中是否有利于腫瘤治療，本研究從細(xì)胞層面上，探索右美托咪定對(duì)宮頸癌細(xì)胞HSP90/ERK 通路及順鉑敏感性的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 常用試劑與儀器 人HeLa（HZ-CC100769），美國(guó)ATCC；順鉑（JKLN003484a）、右美托咪定（JKLN010388a），上海經(jīng)科；DMEM 培養(yǎng)基（KLP0032），德國(guó)merck/sigma；抗體：HSP90（ab13495）、ERK（ab184699）、p-ERK（ab201015）、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferases1，DNMT1）（ab19905）、DNA 聚合酶δ 催化亞基（DNA polymerase delta catalytic subunit gene 1，POLD1）（ab196561）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（ab18197）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（ab104156）、GAPDH（ab181602），美國(guó)abcam；CCK-8（CK-04），日本同仁；AnnexinV-FITC/PI 試劑盒（S0185）購(gòu)自哈爾濱新海基因檢測(cè)有限公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDocXRS）、酶標(biāo)儀（MODEL550），美國(guó)Bio-Rad；流式細(xì)胞儀（BD FACSCanto Ⅱ），美國(guó)BD。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HeLa 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，融合80%左右時(shí)消化、傳代。

取對(duì)數(shù)期HeLa 細(xì)胞接種96 孔板（1 × 104個(gè)/孔），分為對(duì)照組（不做處理）、順鉑組（5 μg/mL 順鉑）、低濃度組（5 μg/mL 順鉑+3 μmol/L 右美托咪定）和高濃度組（5 μg/mL 順鉑+6 μmol/L 右美托咪定）。

1.2.2 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 收集，提取總蛋白，定量。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h 后，分別于4 ℃加HSP90 抗體、ERK 抗體、p-ERK 抗體、DNMT1 抗體、POLD1 抗體、PCNA 抗體、Bax 抗體、GAPDH 抗體（1∶500）過(guò)夜孵育，再室溫孵育羊抗兔二抗（1∶5 000）1 h，化學(xué)發(fā)光，拍攝圖像，分析蛋白灰度，以內(nèi)參GAPDH 為對(duì)照定量。

1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)增殖 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加10 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀（450 nm）檢測(cè)吸光度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h收集，消化、洗滌后調(diào)整為1 × 106個(gè)/mL，用5 μL Annexin V-FITC 及5 μL PI 避光孵育1 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以（）表示，采用Graph-Pad 軟件進(jìn)行多組間比較（單因素方差分析）和進(jìn)一步兩兩比較（SNK-q檢驗(yàn)），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HeLa 細(xì)胞中HSP90/ERK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，順鉑組HeLa 細(xì)胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與順鉑組相比，低濃度組HeLa 細(xì)胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與低濃度組相比，高濃度組HeLa 細(xì)胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組HeLa 細(xì)胞中HSP90、p-ERK、ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of HSP90，p-ERK，ERK，DNMT1 and POLD1 protein expression levels in HeLa cells of each groups ±s

表1 各組HeLa 細(xì)胞中HSP90、p-ERK、ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of HSP90，p-ERK，ERK，DNMT1 and POLD1 protein expression levels in HeLa cells of each groups ±s

注：較對(duì)照組，aP ＜0.05；較順鉑組，bP ＜0.05；較低濃度組，cP ＜0.05

組別對(duì)照組順鉑組低濃度組高濃度組F 值P 值HSP90/GAPDH 0.90 ± 0.14 0.73 ± 0.11a 0.55 ± 0.07b 0.38 ± 0.05bc 30.977＜0.001 p-ERK/ERK 0.84 ± 0.09 0.62 ± 0.09a 0.50 ± 0.05b 0.37 ± 0.04bc 47.163＜0.001 DNMT1/GAPDH 0.93 ± 0.11 0.75 ± 0.09a 0.49 ± 0.05b 0.36 ± 0.05bc 62.500＜0.001 POLD1/GAPDH 0.88 ± 0.10 0.73 ± 0.11a 0.48 ± 0.07b 0.34 ± 0.04bc 49.532＜0.001

圖1 Western blot 檢測(cè)各組HeLa 細(xì)胞中HSP90、p-ERK、ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表達(dá)情況Fig.1 Western blot detect the HSP90，p-ERK，ERK，DNMT1，and POLD1 protein expression in HeLa cells of each groups

2.2 各組HeLa 細(xì)胞增殖情況 順鉑組與對(duì)照組相比較，HeLa 細(xì)胞OD值降低（P＜0.05）；低濃度組與順鉑組相比較，HeLa 細(xì)胞OD 值顯著降低（P＜0.05）；與低濃度組相比，高濃度組HeLa 細(xì)胞OD 值顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 各組HeLa 細(xì)胞凋亡情況 與對(duì)照組相比，順鉑組HeLa 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與順鉑組相比，低濃度組HeLa 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與低濃度組相比，高濃度組HeLa 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組HeLa 細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of HeLa cells in each groups

表2 各組HeLa 細(xì)胞OD 值比較Tab.2 Comparison of the OD values，apoptosis of HeLa Cells in each groups ±s

表2 各組HeLa 細(xì)胞OD 值比較Tab.2 Comparison of the OD values，apoptosis of HeLa Cells in each groups ±s

注：較對(duì)照組，aP ＜0.05；較順鉑組，bP ＜0.05；較低濃度組，cP ＜0.05

組別對(duì)照組順鉑組低濃度組高濃度組F 值P 值OD 值0.53 ± 0.07 0.40 ± 0.07a 0.30 ± 0.04b 0.20 ± 0.03bc 38.813＜0.001凋亡率（%）6.42 ± 0.94 12.63 ± 1.13a 21.95 ± 1.26b 37.86 ± 2.04bc 567.597＜0.001

2.4 各組HeLa 細(xì)胞中增殖、凋亡蛋白表達(dá)情況順鉑組與對(duì)照組相比，PCNA 蛋白水平顯著降低，而B(niǎo)ax 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；低濃度組與順鉑組相比，PCNA 蛋白水平顯著降低，Bax 蛋白顯著水平升高（P＜0.05）；與低濃度組相比，高濃度組PCNA 蛋白水平顯著降低，Bax 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表3。

表3 各組HeLa 細(xì)胞中PCNA、Bax 蛋白表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of PCNA and Bax protein expression levels in HeLa cells of each groups ±s，n = 6

表3 各組HeLa 細(xì)胞中PCNA、Bax 蛋白表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of PCNA and Bax protein expression levels in HeLa cells of each groups ±s，n = 6

注：較對(duì)照組，aP ＜0.05；較順鉑組，bP ＜0.05；較低濃度組，cP ＜0.05

組別對(duì)照組順鉑組低濃度組高濃度組F 值P 值PCNA/GAPDH 0.85 ± 0.10 0.57 ± 0.10a 0.40 ± 0.07b 0.26 ± 0.06bc 54.288＜0.001 Bax/GAPDH 0.25 ± 0.05 0.43 ± 0.05a 0.74 ± 0.07b 0.92 ± 0.08bc 133.742＜0.001

圖3 Western blot 檢測(cè)各組HeLa 細(xì)胞中PCNA、Bax 蛋白表達(dá)情況Fig.3 Western blot detect the PCNA，and Baxprotein expression in HeLa cells of each groups

3 討論

宮頸癌是女性常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在女性相關(guān)死亡原因中居第四位。化療是常用于宮頸癌的輔助治療方式，可影響細(xì)胞行為，有效減緩癌癥發(fā)展，減小手術(shù)切除后復(fù)發(fā)概率，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間［10］。目前，順鉑是臨床上常用于治療宮頸癌等癌癥的一線化療藥物，但其耐藥性的出現(xiàn)易降低宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，導(dǎo)致患者治療不理想［11］。手術(shù)切除作為臨床治療癌癥的核心治療方式，手術(shù)期的種種操作均可能是影響癌癥預(yù)后的重要因素，如手術(shù)造成的創(chuàng)口會(huì)影響機(jī)體免疫，給遺留癌細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移、增殖創(chuàng)造良好環(huán)境，影響患者預(yù)后，而有研究發(fā)現(xiàn)，麻醉藥的正確使用能減少手術(shù)期間癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［12-13］。此外，由于癌細(xì)胞對(duì)化療藥物具有耐藥性或藥物本身敏感性不高，手術(shù)期間使用具有抗癌效果、能提高化療敏感性的麻醉藥，將有利于術(shù)后化療有效清除殘余癌細(xì)胞，提高患者預(yù)后。

右美托咪定是臨床常用的麻醉輔助用藥，具有鎮(zhèn)靜、止痛及保持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定效應(yīng)，常用于癌癥手術(shù)中［14］。此外，LIU 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，DEX 可降低TNF-α、IL-6 分泌量，抑制腫瘤炎癥微環(huán)境形成。王仕斌等［7］研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能通過(guò)抑制PI3K/Akt 通路激活，進(jìn)而抑制人宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移行為，誘導(dǎo)Hela 細(xì)胞凋亡。CHI 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲亦具有抑制作用，其作用機(jī)制可能與抑制糖類抗原Tn 表達(dá)有關(guān)。然而，目前右美托咪定對(duì)宮頸癌順鉑敏感性的影響尚無(wú)研究，本研究采用順鉑、右美托咪定對(duì)人宮頸癌HeLa 細(xì)胞進(jìn)行分組處理，以探究右美托咪定對(duì)宮頸癌的作用及可能作用機(jī)制，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，順鉑組HeLa 細(xì)胞OD 值及細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞凋亡家族成員促凋亡蛋白Bax 表達(dá)升高，驗(yàn)證了順鉑的抑癌作用。進(jìn)一步研究顯示，隨著右美托咪定的添加及濃度的升高，順鉑處理下的HeLa 細(xì)胞OD 值及PCNA 蛋白水平進(jìn)一步降低，細(xì)胞凋亡率與Bax 蛋白水平進(jìn)一步升高，表明右美托咪定可增強(qiáng)HeLa 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，從而抑制HeLa 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且該作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。

HSP90 是一組結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白質(zhì)，是維持胞內(nèi)蛋白構(gòu)象穩(wěn)定及功能正常所必需的分子伴侶，參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)與應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)，在腫瘤治療中可降低腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥的敏感性［17-18］。ERK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的主要成員，介導(dǎo)生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡等多種細(xì)胞生理過(guò)程，在腫瘤細(xì)胞行為調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［19-20］。SUN 等［6］研究顯示，受體相互作用蛋白激酶3 通過(guò)HSP90/ERK 途徑調(diào)節(jié)DNA 修復(fù)，最終影響腫瘤的化學(xué)耐藥性。ZHOU等［21］研究表明，磷酸甘油酸激酶1 通過(guò)觸發(fā)HSP90/ERK 途徑介導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌的DNA 修復(fù)和甲基化來(lái)促進(jìn)順鉑化學(xué)耐藥性。以上研究表明，HSP90/ERK 通路是化療發(fā)揮療效的重要靶點(diǎn)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑組HeLa 細(xì)胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白水平顯著降低，表明順鉑可抑制HSP90/ERK 途徑激活，導(dǎo)致下游DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNA 修復(fù)相關(guān)蛋白POLD1 表達(dá)減少［22-25］，DNA 甲基化、DNA 修復(fù)水平降低，進(jìn)而影響HeLa 細(xì)胞的增殖與凋亡過(guò)程。而使用右美托咪定處理后，HeLa 細(xì)胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白水平進(jìn)一步降低，且高濃度右美托咪定對(duì)HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1蛋白表達(dá)的抑制作用更明顯，表明右美托咪定可增強(qiáng)順鉑對(duì)HSP90/ERK 途徑的抑制作用，進(jìn)一步降低DNA 甲基化、DNA 修復(fù)水平，增強(qiáng)HeLa 細(xì)胞的順鉑敏感性。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)右美托咪定能增強(qiáng)HeLa 細(xì)胞的順鉑敏感性，抑制HeLa 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其過(guò)程可能與抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞中HSP90/ERK 通路，降低細(xì)胞內(nèi)DNA 甲基化、DNA 修復(fù)水平有關(guān)。但本研究?jī)H在宮頸癌的一種細(xì)胞株中展開(kāi)實(shí)驗(yàn)得出該結(jié)論，且因不少研究認(rèn)為HSP90/ERK 通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞化療抵抗而未設(shè)置回復(fù)實(shí)驗(yàn)，故將HSP90/ERK 通路作為右美托咪定影響HeLa 細(xì)胞順鉑敏感性的途徑不夠充分，后續(xù)研究會(huì)進(jìn)行改進(jìn)。