郭坤雄 王志華 郭嬋娟 范應(yīng)方

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽一科（廣州 510280）

胰腺癌是世界上最常見且致命的癌癥之一，總體5年生存率不足10%［1-2］。目前胰腺癌的臨床治療方法包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等療效欠佳，研究進(jìn)展緩慢，未能有效改善胰腺癌患者的預(yù)后［3-4］。因此，亟需開發(fā)有效治療胰腺癌的新方法，以提高胰腺癌患者的遠(yuǎn)期生存率。

近年來，光動力治療以其安全有效、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤的治療中備受關(guān)注，有望為胰腺癌治療提供新的思路和方法［5］。在特定波長激發(fā)光的照射下，光敏劑通過氧氣生成活性氧，損傷癌細(xì)胞中線粒體等細(xì)胞器，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡［6-7］。光動力治療療效取決于癌細(xì)胞對光敏劑的攝?。?］，然而，既往研究表明單純光敏劑在胰腺癌中難以達(dá)到有效的治療劑量［9］。如何高效遞送光敏劑至腫瘤區(qū)域、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對光敏劑的攝取是提高光動力治療療效的關(guān)鍵。隨著納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展，納米遞藥系統(tǒng)成為提高藥物遞送效率、降低毒副作用、增強(qiáng)療效的重要手段［10］；而主動靶向型納米載體能將藥物靶向轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞，最大程度提高藥物的抗腫瘤效果［11-12］。因此，利用主動靶向型納米粒子遞送光敏劑，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對光敏劑的攝取，有望提高光動力治療療效。同時，腫瘤細(xì)胞溶酶體存在低pH 的特點(diǎn)，構(gòu)建酸響應(yīng)納米遞藥系統(tǒng)以提高光敏劑胞內(nèi)釋放的特異性，也可進(jìn)一步提高光動力治療療效。

本研究以胰腺癌細(xì)胞高表達(dá)的胰島素樣生長因子1 受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）為靶點(diǎn)，以二氫卟吩e6（chlorine e6，Ce6）為光敏劑，構(gòu)建酸響應(yīng)的主動靶向型碳酸鈣納米粒子Ce6/Lins@CaCO3-PEG（CLCP），通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察CLCP 光動力治療對胰腺癌的治療效果，并對其作用機(jī)制進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 動物與細(xì)胞 5 ～6 周齡的Balb/c 裸鼠和C57BL/6J 小鼠購自維通利華公司；人源性胰腺癌Bxpc-3 細(xì)胞株和C57 小鼠源性胰腺癌Pan-02 細(xì)胞株購自PerkinElmer 公司。

1.2 主要試劑及儀器 二水合氯化鈣（CaCl2·2H2O）購自Sigma-aldrich 公司；Ce6 購自Frontier 公司；碳酸氫銨（NH4HCO3）、膽固醇、二氯甲烷、無水乙醇、二甲基亞砜（DMSO）購自北京伊諾凱科技有限公司；Linsitinib、1，2-二油酰-sn-丙三基-3 磷酸鈉鹽（DOPA）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；1，2-二十六烷?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿（DPPC）購自北京謹(jǐn)明生物科技有限公司；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基（聚乙二醇）-5000（DSPE-PEG-5000）購自上海芃碩生物科技有限公司。RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco 公司；CCK-8 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Calcein-AM/PI 活/死細(xì)胞雙染試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液購自北京索萊寶科技有限公司；流式細(xì)胞術(shù)抗體（anti-CD16/32，F(xiàn)ITC-anti-CD3，PE-anti-CD4，APC-anti-CD8）購自BioLegend 公司。635nm激光器購自中山鼎碩光電科技有限公司；粒度和電位分析儀（Zetasizer Nano ZS）購自Malvern 公司；透射電子顯微鏡（JEOL-1011）購自JEOL 公司；酶標(biāo)儀（VICTOR Nivo）購自PerkinElmer 公司；倒置熒光顯微鏡（DMIL Led）購自Leica 公司；流式細(xì)胞儀（FACS Canto Ⅱ）購自Becton，Dickinson and Company 公司。

1.3 Ce6@CaCO3-PEG 的合成 采用氣體擴(kuò)散法合成Ce6@CaCO3。200 mg CaCl2·H2O、10 mg Ce6 溶于100 mL 無水乙醇。燒杯口用錫紙包封，留置多個小孔。燒杯與5 g NH4HCO3粉末共同放置在密閉箱中30 ℃下避光反應(yīng)36 h，得到Ce6@CaCO3納米粒子。20 mg Ce6@CaCO3、4 mg DOPA 溶于5 mL無水乙醇，超聲反應(yīng)20 min 得Ce6@CaCO3-DOPA。隨后加入2 mL 二氯甲烷、16 mg DPPC、8 mg 膽固醇、32 mg DSPE-PEG-5000 攪拌反應(yīng)過夜。真空旋蒸后PBS 超聲振蕩重懸，得到Ce6@CaCO3-PEG 納米粒子。

1.4 Ce6@CaCO3-PEG 表面裝載Linsitinib 5 mg Ce6@CaCO3-PEG、1 mg Linsitinib 溶于2 mL PBS 溶液，室溫攪拌24 h。100 kDa 超濾管離心過濾即可得到Ce6/Lins@CaCO3-PEG 納米粒子。

1.5 納米粒子CLCP 的理化表征驗(yàn)證 將CLCP稀釋成0.01 ～0.05 mg/mL 的溶液，振蕩分散5 min后，分別通過粒度和電位分析儀、透射電子顯微鏡進(jìn)行水合粒徑、形貌像分析。CLCP 分別于pH=7.4和pH = 6.5 的緩沖溶液孵育4 h 后，隨后制樣并于透射電子顯微鏡下拍攝樣品形貌像。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng) Bxpc-3 和Pan-02 細(xì)胞株采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基，于恒溫37 ℃、含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 Bxpc-3 細(xì)胞對納米粒子的攝取實(shí)驗(yàn) 將Bxpc-3 細(xì)胞以2 × 105個/孔種植到共聚焦皿培養(yǎng)24 h后，分別與50 μg/mL CCP 或CLCP 納米粒子共培養(yǎng)24 h。隨后棄去培養(yǎng)基，每孔加入1 mL DAPI 染色工作液孵育20 min，PBS 洗滌后共聚焦顯微鏡下觀察DAPI 和Ce6 熒光信號并拍照。

1.8 CCK-8 法檢測納米粒子的體外光動力治療效果 將Bxpc-3 細(xì)胞以1×104個/孔種植到96 孔板培養(yǎng)24 h 后，分別與0、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL CCP 和CLCP 納米粒子共培養(yǎng)24 h，在635 nm 激光下照射，功率為0.1 W/cm2，照射時間為5 min。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄去舊培養(yǎng)基，加入100 μL 含10%CCK-8 溶液的完全培養(yǎng)基，用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度。

1.9 活死細(xì)胞染色 處理基本同上，根據(jù)處理不同分為對照組、激光（PBS + L）組、非靶向治療（CCP + L）組和靶向治療（CLCP + L）組。在激光照射24 h 后，棄去培養(yǎng)基，加入Calcein-AM 和PI 工作液染色30 min后，在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.10 Bxpc-3 原位胰腺癌及Pan-02 胰腺癌皮下移植瘤模型構(gòu)建 取Bxpc-3 細(xì)胞和Balb/c 裸鼠用于構(gòu)建原位胰腺癌模型。通過消化、離心、洗滌收集Bxpc-3 細(xì)胞沉淀，與PBS 溶液、基質(zhì)膠溶液以1∶1∶1 的比例混勻配置細(xì)胞懸液。手術(shù)暴露小鼠胰腺組織，抽取50 μL 細(xì)胞懸液注射進(jìn)胰腺組織中。用小動物活體成像設(shè)備進(jìn)行腫瘤自發(fā)光成像，將成功建模的小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取Pan-02 細(xì)胞和C57 小黑鼠用于皮下腫瘤模型構(gòu)建。Pan-02 細(xì)胞懸液配置同上。將100 μL 細(xì)胞懸液注射到小鼠左側(cè)大腿根部。當(dāng)腫瘤逐漸成形生長至100 mm3可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.11 CLCP 光動力治療原位胰腺癌的療效觀察 將成功構(gòu)建的原位胰腺癌模型裸鼠隨機(jī)分為對照組、PBS + L 組、CCP + L 組和CLCP + L 組。精密稱取少量的CCP 和CLCP 粉末，用PBS 溶解并稀釋為1 mg/mL。通過尾靜脈注射的方式，給對照組和PBS + L 組 注 射200 μL PBS 溶 液，CCP + L 組 和CLCP + L 組分別注射200 μL 1 mg/mL CCP、CLCP溶液。24 h 后，手術(shù)暴露腫瘤組織，在635 nm 激光下以0.1 W/cm2照射15 min。對照組進(jìn)行假手術(shù)處理，不接受激光照射。定期記錄小鼠生存期。

小鼠死亡后，及時獲取腫瘤組織進(jìn)行原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)染色（TUNEL 染色）觀察腫瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡情況。

1.12 CLCP 光動力治療對胰腺癌組織中T 細(xì)胞浸潤的分析 將皮下胰腺癌移植瘤小鼠分組同上。在腫瘤形成后的第1、8 天進(jìn)行治療，藥物注射劑量和方式同上。24 h后，對腫瘤區(qū)域進(jìn)行激光照射，功率為0.1 W/cm2，照射時間為15 min。第21 天取腫瘤組織，用組織消化液消化得到單細(xì)胞懸液，裂紅處理后anti-CD16/32 抗體封閉15 min。隨后anti-CD3、anti-CD4 和anti-CD8 抗體染色25 min，及時用流式細(xì)胞儀檢測。

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行了3 次重復(fù)。計量資料用（）表示。兩組之間差異采用t檢驗(yàn)，Kaplan-Meier 法評估生存曲線。本研究中的所有數(shù)據(jù)分析均使用GraphPad Prism 8 進(jìn)行。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CLCP 理化性質(zhì)表征 通過透射電子顯微鏡觀察CLCP 的形貌像。見圖1A，CLCP 電鏡下為直徑（80.4±12.3）nm 的球形結(jié)構(gòu)。在水溶液中，CLCP的流體動力學(xué)尺寸為（121.5±5.2）nm（圖1B）。通過紫外分光光度計檢測發(fā)現(xiàn)CLCP 對Ce6 的包封率為63.2%，包載率為16.37%。CaCO3在酸性條件下可降解為無害產(chǎn)物CO2和H2O［13］。見圖1C，CLCP在pH=7.4 條件下形態(tài)和結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。而在pH=6.5弱酸性條件下，CLCP 被降解，4 h 后沒有觀察到可見的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

圖1 納米粒子CLCP 理化性質(zhì)表征Fig.1 Physicochemical properties of CLCP nanoparticles

2.2 CLCP體外細(xì)胞靶向性分析 見圖2A，用DAPI對Bxpc-3 細(xì)胞核進(jìn)行染色定位（圖中顯示為藍(lán)色），并觀察細(xì)胞內(nèi)Ce6 熒光信號（圖中顯示為紅色）。結(jié)果表明，沒有主動靶向能力的Ce6@CaCO3-PEG（CCP）只有少量進(jìn)入細(xì)胞中，而有主動靶向能力的CLCP 能夠被Bxpc-3 細(xì)胞大量攝取，表現(xiàn)為強(qiáng)烈的Ce6 熒光信號。對圖像中的Ce6 熒光信號進(jìn)行定量分析，表明相比未結(jié)合的納米粒子，Bxpc-3 細(xì)胞對表面結(jié)合Linsitinib 的納米粒子CLCP 具有更強(qiáng)的攝取量（P＜0.001），見圖2B。

圖2 CLCP 體外細(xì)胞靶向性分析Fig.2 In vitro cells targeting assay of CLCP nanoparticles

2.3 CLCP光動力治療體外療效評估 通過CCK-8法檢測CCP和CLCP對Bxpc-3細(xì)胞的光毒性。見圖3A，相比于CCP，CLCP 在激光照射下表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞活力抑制作用。通過活/死細(xì)胞染色來進(jìn)一步分析細(xì)胞活力下降的原因，Calcein-AM 標(biāo)記活細(xì)胞而表現(xiàn)為綠色熒光信號，作為核染色染料的PI僅在死細(xì)胞中進(jìn)入細(xì)胞核而發(fā)出紅色熒光信號。見圖3C，對照組、激光（PBS + L，L 代表激光照射）組的細(xì)胞存活未受影響，CCP光動力治療（CCP+L）組可以引起部分細(xì)胞死亡，而CLCP 光動力治療（CLCP + L）組造成了顯著的細(xì)胞死亡。通過對死細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，可以更直觀地發(fā)現(xiàn)CLCP + L 組具有更強(qiáng)的癌細(xì)胞殺傷作用（圖3B）。

圖3 CLCP 納米粒子的體外療效檢測Fig.3 In vitro therapeutic effect of CLCP nanoparticles

2.4 CLCP 光動力治療在體療效評估 在原位胰腺癌模型裸鼠中評估不同治療對小鼠生存期的影響。見圖4A，CLCP+L、CCP+L、PBS+L 和對照組的中位生存期分別為46、40、28 和20 d。CLCP+L組的小鼠具有更長的生存期，并且其中位生存期是對照組的2.3 倍（P＜0.001）。對獲取的腫瘤組織進(jìn)行TUNEL 凋亡染色發(fā)現(xiàn)，與其他組相比，CLCP+L 處理后腫瘤組織中凋亡細(xì)胞顯著增加（圖4C）。見圖4B，對腫瘤組織中凋亡/正常細(xì)胞數(shù)量的比值進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CLCP + L 組的凋亡細(xì)胞占比最大，多于CCP+L 組（P＜0.05）。

圖4 CLCP 納米粒子在體療效評估Fig.4 In vivo therapeutic effect of CLCP nanoparticles

2.5 CLCP 光動力治療對腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用分析 腫瘤內(nèi)死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥可有效提高腫瘤微環(huán)境的免疫原性［14］。通過流式細(xì)胞術(shù)來定量分析不同治療后腫瘤中浸潤T 細(xì)胞比例，以評估CLCP 光動力治療對腫瘤免疫的調(diào)節(jié)作用。見圖5A，在各組中CD4+T 細(xì)胞比例沒有顯著差異，但CLCP + L 組中腫瘤細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CD3+CD8+）比例最高。定量結(jié)果（圖5B）顯示，在對照組、PBS+L之間，腫瘤內(nèi)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；CLCP + L 組中細(xì)胞毒性T 細(xì)胞比例不僅顯著高于對照組（P＜0.01），并且高于CCP + L 組（P＜0.05），表明CLCP 光動力治療能夠更有效地刺激腫瘤中CD8+T 細(xì)胞的募集。

圖5 腫瘤浸潤T 細(xì)胞流式分析Fig.5 Flow analysis of tumor-infiltrating T cells in vivo

3 討論

胰腺癌惡性程度高、預(yù)后差；除了少部分患者得以手術(shù)治療外，藥物治療效果不佳，亟需開發(fā)新的治療手段［15］。近年來，光動力治療在膽道腫瘤中表現(xiàn)出良好的治療效果，也有臨床試驗(yàn)探索光動力治療胰腺癌的臨床療效［16-17］。Ce6 由于其安全性良好、光吸收能力強(qiáng)、活性氧產(chǎn)率高而備受關(guān)注，是目前用于光動力治療的常用光敏劑［5，18-19］。然而，由于光敏劑難以遞送到腫瘤區(qū)域，限制了光動力治療在胰腺癌中的應(yīng)用［20］。納米載藥技術(shù)可實(shí)現(xiàn)藥物的高負(fù)載及高效遞送，提高藥物療效、降低毒副作用［21］，故采用納米載藥技術(shù)遞送光敏劑，有望提高光動力治療效果。研究表明，根據(jù)腫瘤細(xì)胞特異性高表達(dá)的分子靶標(biāo)設(shè)計的主動靶向型納米載體更有助于藥物在腫瘤區(qū)域的聚集［10］。前期研究表明胰腺癌細(xì)胞高表達(dá)IGF-1R，且靶向IGF-1R 的納米探針可實(shí)現(xiàn)良好的胰腺癌分子成像及治療效果［22］。此外，根據(jù)腫瘤細(xì)胞中溶酶體低pH的特點(diǎn)，構(gòu)建酸響應(yīng)型納米載體遞送光敏劑可實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異性釋放，發(fā)揮精準(zhǔn)光動力治療效應(yīng)［23］。研究表明，納米碳酸鈣具有價格低廉、合成簡單、安全無毒、載藥量大的優(yōu)點(diǎn)，且對酸性環(huán)境敏感，在弱酸性條件（pH=6.5）下能夠迅速降解為無毒物質(zhì)Ca2+和CO2，因此，納米碳酸鈣已被廣泛作為酸響應(yīng)型載體應(yīng)用于藥物的遞送［13］。本研究以IGF-1R 的靶向分子Linsitinib 作為主動靶向元件、納米碳酸鈣作為載體、Ce6 作為光敏劑合成了納米粒子CLCP，其水合粒徑為（121.5 ± 5.2）nm（圖1C），呈均勻球形結(jié)構(gòu)（圖1B）。CLCP 中Ce6 包封率為63.2%，包載率為16.37%，可高效負(fù)載Ce6。除此之外，CLCP 具有敏感的酸環(huán)境降解能力（圖1C），允許其在酸性的溶酶體內(nèi)迅速降解釋放Ce6 并進(jìn)入胞質(zhì)，為精準(zhǔn)、有效的光動力治療奠定了基礎(chǔ)。體外實(shí)驗(yàn)表明CLCP 具有良好的胰腺癌細(xì)胞靶向性，能夠被Bxpc-3 細(xì)胞大量攝取并釋放Ce6（圖2）?；?死細(xì)胞染色及CCK-8 實(shí)驗(yàn)表明，CLCP在激光照射下，可顯著殺傷Bxpc-3細(xì)胞（圖3）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明CLCP 光動力治療可引起明顯的腫瘤組織細(xì)胞死亡，顯著延長了荷瘤小鼠的生存期（圖4）。上述結(jié)果表明，構(gòu)建的CLCP 具有良好的酸響應(yīng)性能和IGF-1R 主動靶向性，能夠有效遞送光敏劑Ce6 至腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮光動力效應(yīng)殺傷胰腺癌細(xì)胞，抑制腫瘤生長。

現(xiàn)有研究認(rèn)為光動力治療主要通過線粒體損傷介導(dǎo)的細(xì)胞死亡通路殺傷腫瘤細(xì)胞［24］?；贑LCP 的光動力治療導(dǎo)致顯著的細(xì)胞活性下降甚至死亡，推測與更高劑量的光敏劑Ce6 腫瘤區(qū)域遞送及癌細(xì)胞攝取有關(guān)。其可能機(jī)制如下：CLCP經(jīng)實(shí)體瘤高通透性和滯留效應(yīng)在腫瘤組織中聚集，Linsitinib 識別結(jié)合胰腺癌細(xì)胞表面IGF-1R，CLCP 經(jīng)內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，到達(dá)酸性溶酶體內(nèi)后，降解并釋放光敏劑Ce6 至胞質(zhì)并聚集在線粒體周圍，Ce6 在激光照射下產(chǎn)生大量活性氧，損傷線粒體膜導(dǎo)致細(xì)胞死亡［24-25］。

也有研究表明光動力治療具有腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用，通過促進(jìn)腫瘤相關(guān)抗原的釋放激活抗腫瘤免疫，特別是增強(qiáng)細(xì)胞毒性CD8+T 細(xì)胞浸潤［5，26-27］。研究發(fā)現(xiàn)，與其他組比較，CLCP 介導(dǎo)的光動力治療能夠誘導(dǎo)廣泛的腫瘤細(xì)胞死亡（圖4B 和C），CLCP光動力治療組腫瘤組織中CD8+T 細(xì)胞明顯增多（圖5），提示CLCP 光動力治療能夠?qū)崿F(xiàn)更強(qiáng)的免疫激活反應(yīng)。其可能機(jī)制為CLCP 光動力治療導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)鈣網(wǎng)蛋白等免疫原性物質(zhì)暴露，激活并募集了更多細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，從而激活抗腫瘤免疫反應(yīng)［5］。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了酸響應(yīng)的主動靶向型納米粒子CLCP，高效攜載光敏劑Ce6 進(jìn)行光動力治療，可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞死亡，并激活抗腫瘤免疫。研究結(jié)果提示納米載體靶向遞送光敏劑可進(jìn)一步提高光動力治療的療效，且光動力治療聯(lián)合免疫治療具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，為胰腺癌治療提供了新思路。然而，本研究僅對CLCP 光動力治療胰腺癌的療效及其機(jī)制進(jìn)行初步驗(yàn)證，后續(xù)尚需對CLCP 光動力治療誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞死亡和免疫激活的機(jī)制進(jìn)行更深入的探索。